文摘

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种多组分的疾病特点是肺气肿和慢性支气管炎。慢性阻塞性肺病是与吸烟有关。香烟包含超过4700个化合物,包括自由基和有限合伙人(toll样受体4受体激动剂)的浓度,可能导致慢性阻塞性肺病等疾病的发病机制。我们曾表明,短期暴露于香烟烟雾中介质(CSM)可以刺激一些炎性细胞通过TLR4和CSM减少从肥大细胞脱粒(BMMCs)。在目前的研究中,CSM对肥大细胞的成熟和功能的影响研究。Coculturing BMMC的CSM的开发过程中骨髓祖细胞抑制粒度和表面的表达c - kit和足球俱乐部ε国际扶轮受体。刺激与IgE /抗原导致减少脱粒和Th1、Th2细胞因子的释放。CSM暴露的影响不能被模仿的有限合伙人培养基。总之,这项研究表明,CSM可能影响肥大细胞的发展和后续反应过敏TLR4-independent方式激活。

1。介绍

慢性呼吸道疾病的发生率,诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘是大幅增加,目前影响大约300到2亿人的生命,世界范围内分别(1,2]。慢性阻塞性肺病的特征是炎症细胞和结构之间的复杂的相互作用,所有这些有能力释放多种炎症介质(3]。香烟(CS)是主要的球员在COPD的发病机制3]。暴露在CS激活的炎症级联航空公司导致的生产一些强大的细胞因子和趋化因子伴随肺上皮损伤,通透性增加,招募巨噬细胞和中性粒细胞(4]。CS包含高浓度的活性氧(5和有限合伙人6,7]。有限合伙人是一个强大的toll样受体(TLR) 4受体激动剂(8]。通常是一种进化保守的家庭细胞表面分子参与先天免疫反应(9,10]。吸烟对炎性细胞成熟分化的影响还没有很好地描述。在遇到病原体和/或炎性介质、细胞进行转换过程称为“成熟”,例如,提高树突状细胞(DC) Ag-presenting能力或释放炎性细胞因子的能力。的角色通常在DCs的成熟和发展11)和B细胞(12)已被广泛描述。在这方面,据报道,CS暴露会导致(a)减少痰成熟dc在健康吸烟者和COPD患者(13),(b)受损的DC成熟和胸腔淋巴结t细胞增殖的老鼠14)和(c)抑制代DCs通过ERK-dependent通路介导的il - 12和IL-23 [15]。

父母吸烟在儿童和个人吸烟在青少年和成年早期与降低变应性致敏的风险在那些特异反应性的家族病史。这种联系的潜在机制仍有待确定,但研究结果与假设一致,CS预防异位性的免疫抑制效应(16]。到目前为止,很少有研究报道了肥大细胞的作用在人类吸烟者和肺气肿动物模型。肥大细胞通常居住接近上皮细胞,血管,神经,平滑肌细胞、腺体食用(17]。在过敏反应[肥大细胞发挥着至关重要的作用18]。有趣的是,新兴的证据也表明,肥大细胞的作用在肺气肿的发病机制19,20.]。Kalenderian先生et al。19,20.]发现肥大细胞的水平介质,如组胺和类胰蛋白酶,大大提升BALF中吸烟者。肥大细胞的重要性进一步支持的事实,肥大细胞类胰蛋白酶活性与慢性阻塞性肺病的严重程度(21),在慢性阻塞性肺病患者的积累肥大细胞在航空公司已被观察到22]。肥大细胞在这里可以接触到吸入环境挑战,和肥大细胞激活导致协调释放促炎介质进入周围组织;激活的细胞类型可能导致病理与慢性炎症刺激(23,24]。肥大细胞扮演着重要的角色在急性和过敏性炎症和Fcε扶轮表面(24]。IgE表面分子的交联导致胞外分泌的介质如胺和蛋白酶,以及新生成的释放介质包括白细胞三烯、前列腺素、多种细胞因子如Th1 (TNF - ,il - 6)或Th2细胞因子(il - 4, IL-13 IL-5) (24]。

以前,我们表明,CSM(没有IgE / Ag)激活)不触发脱粒骨骨髓来源的肥大细胞(BMMCs)但是诱导释放趋化因子(2]。此外,CSM接触抑制ige肥大细胞脱颗粒和细胞因子释放,但没有对白三烯释放的影响。这表明,暴露在CSM可能导致减少过敏激活肥大细胞而不影响他们对其他刺激的反应25]。相比之下,CS接触体内增强OVA-specific IgE水平,金边的价值观,和招聘的炎症细胞,包括OVA-exposed过敏小鼠肥大细胞(26]。

在目前的研究中,我们调查了CSM暴露对肥大细胞发展的影响从骨髓祖细胞。

2。材料和方法

2.1。试剂

重组鼠标IL-3和自洽场(干细胞因子)从PeproTech购买(tebu-bio Heerhugowaard,荷兰)。有限合伙人(大肠杆菌055. b5)购买从σ(Sigma-Aldrich Zwijndrecht,荷兰)。RPMI 1640年,Tyrode缓冲区,胎牛血清,不必要的氨基酸GIBCO BRL买来生活技术(GIBCO-BRL英杰公司公司,卡尔斯巴德,CA,美国)。青霉素、链霉素、谷酰胺、丙酮酸钠和2-mercaptoethanol是从Sigma-Aldrich获得的。

2.2。香烟烟雾中(CSM)的生产

香烟smoke-conditioned介质(CSM)是如前所述25]。CSM是通过燃烧生成的参考香烟2 r4f(肯塔基州列克星敦市肯塔基大学),使用TE-10z吸烟机(爱尔兰人企业,戴维斯、钙、美国),这是程序根据美国联邦贸易委员会(Federal Trade Commission)抽烟协议(35毫升吹卷画2 s,每分钟一次)。简单地说,这台机器主要用于直接和侧流烟从一个香烟通过5毫升培养基(RPMI无酚红)。此后,吸光度测量spectrophotometrically,媒体被标准化320海里的吸光度。结果提取滴定的pH值与介质pH值7.4和稀释。这个浓度(光密度(OD) = 4.0)和未经处理的媒体连续稀释到0.75%,1.5%,3% OD和用于显示实验。在初步实验,CSM浓度的1.5%被发现最优文化实验。

2.3。老鼠骨骨髓来源肥大细胞(BMMC)文化和治疗CSM

BMMCs来自骨髓的雄性BALB / cBy老鼠像前面描述的那样27]。在RPMI培养基培养细胞补充mitogen-stimulated脾脏细胞条件培养液(见下文)28]。

细胞用于实验3周后当一个肥大细胞纯度> 95%。骨髓细胞cocultured ( /毫升)与1.5% CSM或有限合伙人(100 ng / mL)在文化的第三周。

2.4。商陆Mitogen-Stimulated脾细胞条件培养液(PWM-SCM)

从BALB / c小鼠脾细胞(查尔斯河实验室繁殖)养殖密度 细胞/毫升RPMI 1640中包含4毫米l谷氨酰胺, M 2-mercaptoethanol, 1毫米丙酮酸钠,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,0.1毫米不必要的氨基酸含有凝集素(8(完整的RPMI 1640)μg / mL),放置在75厘米2组织培养瓶。37°C的细胞被孵化有限公司5%2湿润的气氛。5 - 7天后,中收集,离心机在3200×g为15分钟,0.22的过滤μm微孔过滤器,用作PWM-SCM。

2.5。甲苯胺蓝染色

肥大细胞的粒度是由甲苯胺蓝染色29日]。总之,这些细胞被cytospun,固定在不同的液体,然后用酸甲苯胺蓝染色通过2分钟(pH = 2.7)。细胞被光学显微镜检查。

2.6。肥大细胞脱粒试验

描述的脱粒试验进行前(28]。简单地说,大约2 - 每组细胞在培养基resuspended(富集培养基)和孵化1μg / mL anti-DNP-IgE 2小时。在那之后,细胞被洗和resuspended密度 细胞/毫升。在96孔板的细胞被整除( 细胞每口井)和激活表示浓度DNP-conjugated卵白蛋白(DNP-Ova) 30分钟。孵化后,上层清液被收集。细胞随后lyzed使用0.1% NP-40(皮尔斯)以量化的总 己糖胺酶存在于这些细胞的活动。样本与孵化4-methylumbelliferyl glucosaminide (4-MUG)(σ)0.1 M柠檬酸缓冲(pH值4.5)1 h在37°C。4-MUG水解是由荧光的测量(λ例:360海里,λ新兴市场:452海里)使用微孔Cytofluor 2350标。的百分比 己糖胺酶释放被确定的比例计算荧光上层清液/荧光细胞溶解产物纠正 己糖胺酶活性呈现nonchallenged上层清液的细胞。

2.7。流式细胞术分析

BMMCs收获,与冷PBS洗涤后,细胞表面Fc受体被封锁2.4 g2(美国PharMingen,圣地亚哥,CA)染色。我们使用PE-conjugated anti-mousec - kit(PharMingen)污渍c - kit,和鼠标Fcε国际扶轮是沾FITC-conjugated anti-mouse Fcε国际扶轮抗体(PharMingen)并与匹配的同形像控制抗体。抗体的细胞被孵化50μL PBS的1 h在4°C,用PBS洗净,和分析FACSCantoII流式细胞分析仪(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)。死细胞被封闭在执行分析。

2.8。细胞因子的测定

短暂的,约1×106每个实验条件resuspended在细胞培养基和孵化1μg / mL anti-DNP IgE 2小时。在那之后,细胞被洗和resuspended。在96孔板的细胞被整除(1×106细胞/毫升)和激活DNP-Ova 16 h浓度表示。il - 4、IL-5、il - 6、IL-13和TNF - 在细胞上清液浓度使用ELISA(表达载体和eBioscience)估计的数量,根据制造商的指示。

2.9。统计分析

实验结果表示为均值±S.E.M.结果由一个未配对的双尾学生的测试统计 以及或单向方差分析,其次是所有组的Newman-Keuls测试比较。分析利用GraphPad棱镜(版本5.04)。结果被认为是显著时 。

3所示。结果

3.1。CSM的粒度降低肥大细胞在培养

骨髓细胞培养与CSM或有限合伙人在第三周的肥大细胞的发展。细胞分析了粒度与甲苯胺蓝染色(图1(一))。Coculturing细胞与CSM(1.5%)降低肥大细胞(图的粒度1 (b))。有限合伙人(1μg / mL)并不影响培养肥大细胞(图的粒度1 (c))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
长期的文化存在的CSM降低肥大细胞颗粒的密度。BMMCs BALB / c小鼠只存在与培养基培养(a), CSM (1.5%) (b),或有限合伙人(c) (1μg / mL)的第三周期间培养骨髓细胞中描述的部分2。细胞与甲苯胺蓝染色。
3.2。CSM下降c - kit(CD117)和Fc 国际扶轮在肥大细胞表达

柱状细胞c - kit和足球俱乐部ε扶轮表面表达决心CSM曝光后用流式细胞仪。与CSM Coculture显著抑制表面的表达c - kit和足球俱乐部ε国际扶轮在肥大细胞(图2:上、下面板、控制(a), CSM (b))。相比之下,长期文化与有限合伙人不改变表面的表达c - kit和足球俱乐部εRI(图2 (c)上、下面板)。流式细胞仪数据3代表实验量化(d)显示平均荧光强度为每个实验组(MFI)。细胞生存能力并不影响治疗CSM或有限合伙人(数据没有显示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
CSM调节Fc的表面表达ε国际扶轮和c - kit。BMMCs cocultured在存在与否的CSM(1.5%)或有限合伙人在第三周骨髓的文化。表面的表达c - kit(上部面板)和FcεRI(较低的面板)被流式细胞术检测(蓝色柱状图):控制(a), CSM (b),有限合伙人(c),绿色直方图代表同形像控制。(d)量化3代表流式细胞仪分析显示平均荧光强度(MFI)为每个组。值表示为均值±S.E.米( )。 相比明显不同(增加/减少)控制。
3.3。长期接触CSM调节IgE / Ag-Mediated由肥大细胞脱颗粒和细胞因子生产

刺激与IgE / Ag)导致剂量依赖性的肥大细胞脱粒对照组(图3)。Coculturing肥大细胞与CSM(1.5%)减少ige脱粒(图3)。相比之下,有限合伙人,TLR4受体激动剂,并不影响IgE / antigen-induced BMMC脱粒(图3)。


图3
长期接触CSM的肥大细胞抑制过敏脱粒。BMMCs在普通培养基培养,在CSM(1.5%)或有限合伙人(100 ng / mL)的第三周骨髓的文化。然后,细胞被激活的DNP-specific IgE,紧随其后的是激活dinitrophenyl-conjugated人类卵清蛋白(DNP-Ova)。脱粒被释放的评估 己糖胺酶在上层的细胞。一式四份样品数据均值±SEM ( )。

CSM显著抑制IgE-receptor介导il - 4的生产,IL-5, il - 6, IL-13, TNF - 由肥大细胞(数字4(一)- - - - - -4 (e))。培养与有限合伙人不显著改变il - 4, IL-5, il - 6, IL-13, TNF - 生产(数据4(一)- - - - - -4 (e))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图4
长期接触CSM的肥大细胞肥大细胞抑制细胞因子的生产。BMMCs(控制、CSM和有限合伙人培养4 - 6天)与DNP-specific IgE敏感,其次是激活dinitrophenyl-conjugated卵白蛋白(DNP-Ova) 9 h。细胞因子il - 4的水平(a), IL-5 (b), il - 6 (c), IL-13 (d)和肿瘤坏死因子-α(e)的上层清液被ELISA估计。数据是一式四份样本的均值±SEM。星号代表未激活的和激活细胞之间的显著差异( )。准备代表之间的显著差异控制肥大细胞和肥大细胞与CSM cocultured或有限合伙人( 和 )。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们进一步研究了CSM的发育和功能的影响主要是培养了从骨髓中萃取出来的肥大细胞。我们表明BMMC暴露在CSM在开发过程中从祖细胞抑制肥大细胞发展由甲苯胺染色和表达c - kit和足球俱乐部εRI。此外,Th1、Th2细胞因子的释放对Fc的回应ε国际扶轮激活降低。有趣的是,TLR4受体激动剂LPS并不影响这些参数,甚至略有增加il - 4生产。

肥大细胞在过敏性气道疾病很重要,但他们仍缺乏研究nonallergic炎症气道慢性阻塞性肺病等疾病。肥大细胞特别感兴趣的是由于他们促进气道重塑和粘液分泌过多的能力。临床数据显示增加水平的肥大细胞类胰蛋白酶和脱粒灌洗和支气管组织的肥大细胞吸烟者(30.- - - - - -33]。此外,CS暴露促进小鼠变应性致敏(34]。

我们曾报道称,短期暴露的成熟对CSM减弱他们对过敏的反应刺激肥大细胞(28]。金等人还显示CSM在肥大细胞激活的抑制作用表明CS可能有助于减少过敏症状观察吸烟者(26]。

肥大细胞在功能上是动态的天然免疫与适应性免疫效应细胞(24]。两个柱状细胞表面受体c - kit和足球俱乐部ε国际扶轮调解激活通过先天和适应性免疫机制,分别为(17,23,24]。c - kit是表达了最早成熟的肥大细胞和肥大细胞祖细胞(35,36]。c - kit既是一个表达的可溶性形式和细胞膜上的36]。虽然c - kit是一个主要的生长和分化因子对小鼠和人类肥大细胞(35,37)它也促进c - kit端依赖肥大细胞中介发布(38)以及肥大细胞的释放介质通过IgE-dependent机制(39]。IgE-dependent变应性疾病是由多价结合过敏原IgE必将Fcε国际扶轮肥大细胞(40]。足球俱乐部εRI在过敏反应中起着至关重要的作用。这是肥大细胞的主要表面受体直接免疫特定分泌影响如预制细胞质granule-associated介质的释放和脂质介质和细胞因子的产生和释放41]。因此,抑制c - kit和足球俱乐部ε国际扶轮CSM的肥大细胞可能占肥大细胞的减少响应IgE / Ag)激活。我们的研究表明,有限合伙人可能不参与的机制CSM影响肥大细胞的成熟和激活。

肥大细胞表达功能通常(42]可能占赋予的保护肥大细胞对细菌和寄生虫感染(43]。激活肥大细胞释放一批强有力的炎症介质快速放电的预制在颗粒介质,炎症的产生从花生四烯酸脂质,和众多的th2型细胞因子和趋化因子的生产44]。所有这些反应是通过Fc过敏原诱发的ε国际扶轮,刺激肥大细胞通过TLR2和TLR4受体主要结果在一代的细胞因子il - 4、IL-5, il - 6、il - 10, IL-13, TNF -α(43]。Saluja等人最近表明,长期接触有限合伙人放大Fc的肥大细胞εRI-mediated脱粒、脂质介质生成和细胞因子的生产(45]。这与影响在这项研究中,发现在有限合伙人治疗不会增加ige肥大细胞激活。这种差异可能是由于不同品系小鼠用于研究和治疗的时间在肥大细胞的发展。

总之,我们的研究表明,CSM独立TLR4信号,抑制肥大细胞的成熟和功能。这种抑制香烟烟雾对肥大细胞的影响可能占减少过敏反应动物模型的cigarette-smoke-induced肺气肿(46]。

缩写

BMMC: 从柱状细胞
CSM: 香烟烟雾中
慢性阻塞性肺病: 慢性阻塞性肺疾病
流式细胞仪: Fluorescence-activated细胞分类
自洽场: 干细胞因子
TLR: toll样受体。