文摘

寻常天疱疮(PV)是一种自身免疫性的疾病,其发病机制涉及体液免疫和细胞免疫反应。虽然自身抗体针对desmoglein 3的致病的作用是肯定的,已经提出许多其他因素来确定在PV皮肤棘层松解。在这项研究中,我们审查的角色发展的CD8 + T细胞皮肤棘层松解PV自身抗体的被动转移使用CD8不足的老鼠,我们还研究了光伏的炎性浸润皮肤损伤,免疫组织化学染色。免疫组织化学染色法研究的结果的表达CD3, CD4, CD8在PV皮肤损伤表明,CD4 +比CD8 +表达炎性浸润的PV病变,确认数据之前的文学作品。被动转移研究显示发病率较低的天疱疮组CD8缺陷小鼠相比控制野生型老鼠之一。这些结果表明,CD8 + T细胞可能在PV的发病机制中发挥作用,可能通过Fas和FasL通路。

1。介绍

寻常天疱疮(PV)是一种危及生命的自身免疫性猛烈的疾病由自身抗体(autoAbs)针对desmogleins (Dsg)位于角化细胞表面的细胞(KC)。这导致一个名为皮肤棘层松解的上皮内失去附着力,并临床礼物vescicles和水泡(1]。AutoAbs在光伏主要是针对desmoglein 3 (Dsg 3),一个desmosomal糖蛋白位于suprabasilar主要在皮肤表皮层,和较少desmoglein 1 (2]。虽然发病的作用antidesmoglein autoAbs是肯定的,确切的机制,导致皮肤棘层松解仍不完全理解。补充(3],plasminogen-plasmin [4),细胞因子(5),细胞介导免疫性,和其他自身抗体,如抗胆碱能受体抗体在PV(建议在决定皮肤棘层松解6]。研究到目前为止关于T细胞的作用主要涉及与B细胞CD4 +淋巴细胞为他们的合作,随后的感应和监管autoAbs生产(7]。CD8 + T细胞的功能尚未开发,但一些作者猜测他们的角色在细胞介导的病机PV (8]。其他研究提出一个可能的自然杀伤(NK)细胞的作用[98)以及Fas和半胱天冬酶在光伏10]。这些分子的功能细胞凋亡机制是众所周知的。PV这些分子导致角质细胞的萎缩导致超然诱导皮肤棘层松解(11]。Fas属于肿瘤坏死因子(TNF)受Fas配体受体家族,表达了对CD8 + T细胞。在这项研究中,我们试图评估CD8 +细胞的角色执行被动转移PV autoAbs使用CD8缺陷小鼠(CD8⁻/⁻)。这些研究的结果表明,CD8 PV发病机制的作用。

2。材料和方法

2.1。免疫组织化学

免疫组织化学染色进行使用碱性phosphatase-antialkaline磷酸酶(APAAP)方法在7μ米7 PV患者的皮肤部分(12]。CD3单克隆抗体(1:20;DAKO、斯特鲁普、丹麦),CD4 (1: 20;DAKO)和CD8 (1: 20;DAKO)。在定量研究中,细胞被染色前连续三微观统计字段(250 x),真皮和表皮,然后总结;然后计算平均值。

2.2。天疱疮的制备免疫球蛋白

等离子体是获得一个患者的血浆置换的临床,组织学,组成的光伏的诊断和免疫功能,在疾病的急性期。总免疫球蛋白浓度测量浊度测定法使用单一的山羊反人类免疫球蛋白(贝克曼仪器,Missasauga、加拿大)。天疱疮Ab滴度是衡量间接免疫荧光(IIF)使用猴食道上皮细胞作为组织基质(13]。作为一个消极的控制,免疫球蛋白分数被孤立起来,从光伏等离子使用蛋白(PA)。隔离PV免疫球蛋白分数的等离子体是通过标准化技术使用葡萄球菌蛋白A与琼脂糖4 b [14(法玛西亚生物技术,乌普萨拉,瑞典)。PA被四次在寒冷的PBS最后孵化与PV等离子一夜之间在4°C。上层清液收集和使用消极的控制。缺乏免疫球蛋白的分数在控制等离子体被国际评估猴食道上皮细胞基质染色,证实了浊度测定法。PV等离子体和控制等离子体与Millex过滤消毒(孔径0.22毫米;微孔,贝德福德,MA)和存储在−20°C。

2.3。老鼠

使用以下品种:CD8⁻/⁻和C57BL / 6 (CD8⁻/⁻控制)。所有的老鼠被安置和特定的无菌条件下饲养的动物设施新宁保健科学中心。新生儿(< 24 h(年龄)。平均15个老鼠在每个实验组,每个实验至少重复三次。所有动物程序新宁保健科学中心的动物保健委员会批准。

CD8⁻/⁻老鼠。老鼠的一代CD8 (CD8基因突变纯合子⁻/⁻)是通过破坏Lyt-2基因通过同源重组和突变通婚在C57BL / 6生成CD8-deficient (CD8前背景⁻/⁻老鼠)。纯合子小鼠的缺陷被用作淘汰赛(KO)小鼠与野生型(WT)动物作为nondeficient控制。

2.4。被动转移模型

在小鼠诱导PV,我们利用安哈尔特的模型等。15与一些细微的修改。短暂,等离子体注入皮内,背侧区,通过30-gauge针到老鼠新生儿。总剂量范围从30到50μL / g的体重在一个单一的管理。我们选择了一个剂量的30μL / g,因为这是最小剂量WT小鼠诱发疾病。CD8⁻/⁻老鼠和C57BL / 6小鼠注射相同剂量的PV等离子体。负控制,目标基因突变小鼠和WT老鼠注入等离子体耗尽治疗蛋白的免疫球蛋白a .老鼠检查注射后24小时。皮肤病变组成的完整的水泡或侵蚀枚举。

2.5。组织标本染色

Lesional perilesional皮肤获得了光学显微镜和直接免疫荧光(DIF)与PV免疫球蛋白注射后24小时。活检时,血清也获得和化验IIF在猴食道上皮细胞检测免疫球蛋白浓度测定。

2.6。直接免疫荧光

Perilesional皮肤活检标本在液氮快速冻结,直到使用。低温恒温器部分(5μ米)被使用,和DIF根据标准技术进行研究16]。简而言之,标本在PBS洗了10分钟,30分钟孵化FITC-conjugated F (ab′)₂片段的兔子反人类免疫球蛋白、具体γ进行攻击(1:25;Dako、斯特鲁普、丹麦),在PBS洗15分钟。幻灯片满是缓冲甘油,结果读入一个尼康Optiphot免疫荧光显微镜(尼康,梅尔维尔,纽约)。

2.7。间接免疫荧光法

PV免疫球蛋白治疗后血清收集24小时或PA治疗(免疫球蛋白耗尽),与国际研究进行根据标准技术(16]。低温恒温器部分(5μ米)猴食道被用作基质,洗了10分钟在PBS,孵化与不同浓度的血清30分钟(1:1 - 1:600),在PBS洗15分钟,贴上FITC-conjugated F (ab′)₂片段的兔子反人类免疫球蛋白(DAKO、斯特鲁普、丹麦)30分钟,然后再洗在PBS 10分钟。幻灯片满是缓冲甘油,结果检查使用尼康Optiphot免疫荧光显微镜(尼康,梅尔维尔,纽约)。

2.8。组织学技术

从小鼠皮肤活检固定在10%福尔马林和苏木精和伊红染色。

2.9。统计分析

数据对于疾病的发病率在KO和控制老鼠进行了分析使用χ²测试;一个值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。免疫组织化学CD3-CD4-CD8

检测CD3 + T细胞在真皮细胞(32.8±1.6算作部分中提到2),血管周的分布,在所有的病人的表皮(7.9±2.8)。发现CD4 + T细胞在真皮表面和(33.6±4.8)分散和血管周的分布,和更少的人在附近的基底和suprabasal层发现真皮(4.2±1.2)。CD8 + T细胞的数量(14.2±1.6)观察真皮lesional皮肤血管周的地区(CD4 / CD8 = 2.7)(表1)。

3.2。寻常天疱疮免疫球蛋白

天疱疮节中描述了等离子体2。IIF PV免疫球蛋白g使用猴食道的底物显示出效价1:2460年,一个免疫球蛋白浓度为5.9 mg / mL被浊度测定法测量。PA-treated等离子显示缺乏细胞间染色猴食道,和免疫球蛋白水平低于检测水平使用浊度的分析。

3.3。被动转移光伏

PV免疫球蛋白的被动转移证明之间的直接相关性的PV免疫球蛋白注射量和疾病的发病率。在小鼠皮肤棘层松解和炎性浸润明显给等离子体包含PV免疫球蛋白和缺席在老鼠身上注射IgG-depleted等离子体。小鼠注射了PV免疫球蛋白的表皮发展光伏病变显示人类免疫球蛋白绑定到细胞间细胞表面DIF。没有发现染色在老鼠身上注射PA-treated等离子体。没有观察到荧光强度差异在不同品系的老鼠接受同等剂量的PV免疫球蛋白。所有光伏等离子体注入老鼠的免疫球蛋白g效价检测到国际范围之间1:100年的老鼠接受30μL / g PV等离子体和1:200在老鼠身上注射50μL / g。没有检测到循环PV免疫球蛋白在老鼠身上注射PA-treated等离子体。在所有的WT小鼠,观察免疫球蛋白沉积与最小剂量的30μL / g PV等离子(177μPV免疫球蛋白g / g)。在这个剂量,大约10%的老鼠显示疾病的临床证据。50的服用剂量μL / g PV等离子(295μg / g PV免疫球蛋白),75%的WT老鼠出水泡。

当一个剂量反应研究CD8⁻/⁻小鼠,观察天疱疮发生率较低。特别是,剂量的30μL / g PV等离子,CD8的0% (0/5)⁻/⁻小鼠注射显示疾病的证据与C57BL / 6小鼠9.5%(4/42)(统计上没有显著差异)。注射剂量为50μL / g, CD8的44% (13/29)⁻/⁻老鼠PV病变发展,比例为72%(26/36),对照组(差异显著(图)2)。

4所示。讨论和结论

光伏的免疫发病机理包括体液免疫和细胞介导的反应。虽然desmoglein抗体致病性,CD4 +、CD8 +和NK细胞也牵涉其中。CD4 +细胞的功能曾被检查。众所周知,CD4 + Th1细胞促进IgG1生产的B细胞,而IgG4 IgA, IgE autoAbs诱导的合作与B细胞(CD4 + Th29]。CD8 +细胞的功能在PV的发病机制仍不清楚,但他们的角色已经被一些作者假设。他们偶尔观察到从活跃的PV患者CD8 + T细胞在体外刺激响应Dsg 3。特别是他们分泌和正- - 2γ但不是il - 4或IL-5,成为第一个细胞因子与细胞介导的免疫反应和增强体液。这表明一个角色的CD8 + T细胞细胞病理的PV (9]。

PV的渗入人体皮肤病变的特征显示一般主要是CD4 + t细胞和少,约10%,CD8 +细胞(17]。在我们的研究中,我们分析了T细胞渗透皮肤损伤的患者受到光伏通过免疫组织化学表达CD3, CD4, CD8。结果证实数据的文献,因为CD4 +表达在人类皮肤损伤PV多于CD8 +比率为2.7。控制老鼠(WT)开发光伏病变(9.5%和30μ与50 L / g和72%μL / g),而CD8淘汰赛组相对耐药(0%和30μ与50 L / g和44%μL / g)。正如所料,老鼠收到50μL / g PV等离子体开发更多的PV病变比注射30μL / g。组织学分析和DIF和IIF测试证实的诊断PV小鼠皮肤病变PV等离子体注入后,在小鼠的整体治疗免疫球蛋白剥夺了等离子体,所有测试都是消极的(图1)。这些结果表明,CD8 + T细胞可能在PV的发病机制中发挥作用。CD8 + T细胞调节免疫部分通过granzymes或诱导细胞凋亡的Fas / Fas配体(FasL)系统。这个死亡细胞通路主要取决于Fas和FasL还存在交互通过激活系统。一些报道表明,在角化细胞治疗天疱疮血清,观察还存在的激活。还存在其他报告表明抑制剂引起的封锁皮肤棘层松解(11]。成瘾的体外研究表明,anti-FasL Abs部分地抑制了IgG-PV诱导细胞凋亡在文化的角化细胞11]。

我们因此建议CD8 + T淋巴细胞的作用的PV发病机制在一定程度上可以通过也许Fas-FasL介导信号。