文摘

功能障碍的血脑屏障(BBB)是一个实验性自身免疫性脑脊髓炎的主要特点(运算单元),多发性硬化症(MS)的实验模型。苦参碱(垫),quinolizidine生物碱来源于草基数Sophorae Flave,最近发现和中枢神经系统炎症抑制临床实验性自身免疫性脑脊髓炎。然而,这是否垫的效果是通过保护BBB的完整性和功能尚不清楚。在目前的研究中,我们表明,垫治疗疗效与地塞米松(DEX)大鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎,与伊文思蓝外渗,减少胶原IV的表达增加,基底膜的主要成分,紧密连接的结构(TJ)适配器蛋白质Zonula occludens-1 (ZO-1)。此外,垫治疗减毒的表达矩阵metalloproteinase-9和2 (MMP-9 / 2),虽然增加的表达组织抑制剂metalloproteinase-1和2 (TIMP-1 / 2)。我们的研究结果表明,垫降低BBB渗漏通过加强基底膜,抑制MMP-2活动和9,上调其抑制剂。综上所述,我们的结果确定一个新颖的机制垫的影响,天然化合物,可能是一个女士的新疗法。

1。介绍

多发性硬化(MS)及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元),是T细胞介导炎性疾病表现为淋巴细胞浸润,脱髓鞘和轴突损伤(1,2]。尽管病理学女士不是完全理解,血脑屏障(BBB)功能障碍在这种疾病的发病机制中扮演着重要的角色。,女士和实验性自身免疫性脑脊髓炎促炎细胞和有毒分子通过受损的BBB迁移进入大脑,导致脑水肿,髓鞘脱失,神经细胞死亡(3,4]。

BBB由基底膜,interendothelial紧密连接(套)和血管周的星形胶质细胞5]。基底膜,它是由两个截然不同的类型,即内皮基膜和薄壁组织的基底膜,是一个紧凑的专门的细胞外基质分子组装6]。这个膜,与内皮细胞单层,形成结构性障碍,选择性地过滤血液元素(6,7]。胶原IV由基底膜蛋白总量的90%,起着决定性的作用在维持血管壁的结构完整性8,9]。胶原IV,大脑微血管基底膜的主要组成部分,被广泛用作标记来确定基底膜的破坏的程度。

套,由大型multiprotein复合物,密封间隙生物障碍(4]。改变分布或损失套是常见的缺血性脑微血管,导致减少BBB完整性(10]。Zonula occludens-1 (ZO-1)是主要的cytoplasmatic蛋白质与套,连接c端occludin的两端和claudins底层肌动蛋白细胞骨架7]。减少ZO-1表达式结果在BBB通透性增加11]。此外,疾病严重程度在急性期直接相关的实验性自身免疫性脑脊髓炎的BBB通透性(12]。

它已经表明,BBB破坏伴随着过度表达基质金属蛋白酶(MMPs) (13]。基质金属蛋白酶,包括MMP-9 MMP-2,属于一类zinc-bound蛋白酶,其功能包括诱导炎症,乳沟的髓磷脂蛋白,激活或退化疾病修饰的细胞因子,直接损害中枢神经系统细胞(14]。异常MMP-9和MMP-2集体在内皮细胞可能会损害内皮屏障功能通过降解血管基底膜和套(10,14,15]。此外,MMP-9和MMP-2调节的中枢神经系统(鼠模型实验性自身免疫性脑脊髓炎16]。

金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是内源性的基质金属蛋白酶抑制剂。TIMP-1控制MMP-9活动通过高亲和力,共价结合MMP的催化领域,而MMP-2受TIMP-2 [17]。它已经表明,[TIMP-1缺乏提高疾病严重程度在实验性自身免疫性脑脊髓炎18]。在正常生理条件下,存在一个常数MMP与TIMP活动之间的平衡,这是至关重要的维持有机体的生理功能(19]。相比之下,MMP / TIMP比率的不平衡是发现人类在各种病理条件下,如癌症、类风湿性关节炎、血管疾病(20.]。例如,复发缓和医学患者的血清MMP-9 / TIMP-1比率与疾病的发展(17]。MMP-2和TIMP-2之间的不平衡造成的辐射在脑损伤的发病机制中发挥作用(21]。

目前,治疗仅限于女士免疫调节或免疫抑制治疗,这并不总是成功的,经常有严重的副作用22]。因此,寻找更有效、更可容忍的化合物是非常重要的。苦参碱(垫)是一种天然的生物碱成分从草中提取基数Sophorae单位,258.43兆瓦(C₁₅H₂₄N₂啊,图1(一))。据报道,垫抑制T细胞的免疫活动,B细胞,巨噬细胞(23]。苦参碱长期以来一直用于治疗病毒性肝炎,心律失常,和皮肤炎症,没有已知的副作用(24,25]。而垫抑制发展的运算单元,其神经保护机制尚未阐明。本研究的目的是确定是否垫治疗抑制BBB破坏通过减少BBB泄漏,加强基底膜,提高套,调节基质金属蛋白酶之间的平衡和TIMPs。在疾病进展的实验性自身免疫性脑脊髓炎

2。材料和方法

2.1。动物

Wistar鼠女,6 - 7星期从上海Xipuer-Bikai实验动物公司购买,中国,和安置在无菌实验室实验动物中心的河南,中国。都是努力减少实验用动物的数量,以确保最小的痛苦。

2.2。运算单元感应和治疗

运算单元是诱导如前所述23只有一些小的修改。豚鼠脊髓匀浆(河北)实验动物中心重300 - 350克与同样体积的乳化完全弗氏佐剂(CFA)(美国σ)包含6毫克/毫升卡介苗疫苗(上海生物制品研究所、中国)。每个老鼠收到0.5毫升的皮下注射乳剂分给5网站排到后颈和背部。所有程序都是郑州大学生物伦理学委员会批准。

免疫小鼠被随机分为四组(每组)对不同的治疗方法。短暂,垫(江苏贾大专业制药有限公司、江苏、中国)在生理盐水溶解,腹腔内注射(i.p)每日两剂:低(150毫克/公斤;MAT-L)和高(250毫克/公斤;MAT-H),剂量在6.7毫升/公斤计算,从第一天到免疫接种后17天(p)。地塞米松(DEX)(河南Hongrun药业有限公司、河南,中国),作为阳性对照药物,是溶解在生理盐水(6.7毫升/公斤)和注射(i.p)日报》从第一天到天17 pi 1毫克/公斤。免疫大鼠只收到等量的生理盐水ip作为车辆控制,和16个没有免疫天真的老鼠获得等量的生理盐水ip作为天真的组。

2.3。临床评分和重量

老鼠每天监测和重两个独立观察员评估临床免疫后大量的实验性自身免疫性脑脊髓炎。神经系统体征评估如下(23):0 =没有临床评分;1 =失去尾巴基调;2 =后肢无力;3 =后肢瘫痪;4 =前肢瘫痪;5 =垂死的或死亡。

2.4。组织病理学评价

在17天皮。,two independent observers randomly selected 8 rats from each group. When animals were sacrificed, sera and spinal cords were collected after extensive perfusion. The lumbar enlargement of spinal cords was embedded in paraffin. After embedding, 2-3 μ米厚的部分准备和沾hematoxylin-eosin(他)炎性浸润和铬变素2 r-brilliant绿色(C-2R-B)脱髓鞘。盲法的方式进行组织病理学检查,取得了如下(22炎症::0,没有炎症细胞;1、几个分散的炎性细胞;2、血管周围组织炎性浸润;3、广泛的血管周的成套与扩展到相邻的薄壁组织,或实质;髓鞘脱失:0,没有;1、罕见的焦点;2,一些地区的髓鞘脱失;3,大(支流)脱髓鞘。

2.5。评价BBB泄漏

BBB泄漏评估使用伊文思蓝(EB)染料如前所述26]。在17天皮。,the 8 rats remaining in each group were anesthetized. EB dye (2%; 4 mL/kg; Sigma, St. Louis, MO, USA) was injected slowly into the tail vein and was allowed to circulate for 60 minutes. When the rats were sacrificed, brains were removed and immediately weighed. The EB dye was extracted in 2.5 mL of PBS, and 2.5 mL of 60% trichloroacetic acid was added. The mixture was then vortexed and centrifuged for 40 min at 4000 rpm, and the amount of EB dye in supernatants was determined at 610 nm by spectrophotometry and quantified toμg / g脑组织。

2.6。rt - pcr分析胶原IV和ZO-1 mrna

颈脊髓收获17天pi,准备分析胶原IV和ZO-1 mRNA使用实时聚合酶链反应(PCR)。从这些组织细胞总RNA是孤立使用试剂盒试剂(北京TransGen生物技术有限公司、北京、中国)以下的标准协议。互补脱氧核糖核酸的合成是由逆转录使用Promega逆转录工具包。每个基因的互补dna拷贝数是决定使用标准曲线相应的PCR产物。胶原IV的引物5′-GGCCCCTGCTGAAGCGTT-3′(向前)和5′-GTTCCCCGAGCACCTTAG-3′(反向),产生306个基点PCR产品。了ZO-1引物5′-CCATCTTTGGACCGATTGCTG-3′(向前)和5′-TAATGCCCGAGCTCCGATG-3′(反向),产生372个基点PCR产品。基因表达是规范化内生看家基因的表达β肌动蛋白。的β肌动蛋白引物5′-CCTCTGAACCCTAAGGCCAAC-3′(向前)和5′-TGCCACAGGATTCCATACC-3′(反向),产生564个基点PCR产品。确定目标基因表达的相对定量,我们使用这种凝胶成像分析系统(辽宁大连靖生物技术有限公司,中国)。

2.7。ELISA分析MMP-9 TIMP-1

血清收集17天pi是MMP-9浓度化验,ELISA TIMP-1遵循制造商的指令(R & D系统,美国)。样本与标准曲线比较量化的MMP-9和TIMP-1 (0 - 200 ng / mL)。

2.8。免疫组织化学分析MMP-2 TIMP-2

石蜡包埋组织的脊髓从每组切成5μ米厚的部分。抗体免疫组织化学进行这些片,使用anti-rat MMP-2和TIMP-2(从北京TransGen生物技术有限公司;北京,中国)。部分被冲洗和孵化nonbiotinylated山羊anti-rabbit免疫球蛋白二级抗体。发色团产品民建联的解决方案是使用一个简单的污点(北京TransGen生物技术有限公司、北京、中国)。积分光密度(IOD)阳性细胞在禁区决心代表MMP-2的表达式并使用Biosens TIMP-2 v1.6数码影像系统。

2.9。统计分析

所有数据提出了平均数±标准差。统计分析了SPSS 16.0(美国芝加哥SPSS)。多个比较进行利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验,方差分析,其次是LSD -t测试,适当的。一个值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。垫治疗缓解临床运算单元的严重性

vehicle-treated组、临床下降通常开始在10天皮。,while EAE onset for MAT-treated rats occurred on day 12 p.i. (low dose) and 13 p.i. (high dose) (Figure1 (b))。相比vehicle-treated组,MAT-treated组表现出显著降低意味着最大的临床评分(图1 (c)(表)和体重损失1)。敏捷也推迟治疗疾病进展,减少临床分数相比vehicle-treated组()。没有显著区别动物接受敏捷和两种不同剂量的垫子上。

3.2。垫治疗中枢神经系统组织病理学的影响

神经病理学评估实验性自身免疫性脑脊髓炎,腰椎脊髓样本的使用)和髓鞘染色(图检查2)。血管周的成套和单核细胞浸润到中枢神经系统实质是观察到大鼠的脊髓vehicle-treated组(图2),而细胞浸润的程度明显降低MAT-treated组(两种)。敏捷治疗显示了强烈的抑制比MAT-treated团体(包括细胞浸润)。细胞渗透不是天真的组中观察到。此外,如图2,大面积的髓鞘脱失vehicle-treated组中观察到,虽然垫——和DEX-treated组脱髓鞘只有少数地区展出。之间无显著差异,观察髓鞘脱失MAT-H和敏捷团体。

3.3。垫抑制伊文思蓝(EB)通过BBB泄漏

BBB的破坏是女士和运算单元的重要特征之一。我们量化EB染料进入大脑的外渗BBB通透性的一项指标。EB溢出进入大脑的老鼠在天真的大脑明显高于vehicle-treated实验性自身免疫性脑脊髓炎()(图3)。EB含量显著减少垫,DEX-treated组相比vehicle-treated组(所有),而更深刻的EB含量降低的小鼠观察与MAT-L MAT-H和敏捷比()。没有观察到显著差异之间接受高剂量的垫子和敏捷。

3.4。垫保护胶原IV和ZO-1 mRNA的表达

确定基底膜破坏,我们评估的mRNA表达胶原IV,脑微血管基底膜的主要成分,用rt - pcr分析。如图4(一),最亮的乐队表现出天真,虽然微弱的乐队vehicle-treated组,与定量分析(图一致4 (c))。第四剂量依赖性增加胶原蛋白表达在MAT-treated组。虽然MAT-L-treated组胶原IV表达式显示低于敏捷集团(),没有明显区别MAT-H和敏捷团体。

我们也评估ZO-1 mRNA表达确定TJ中断。类似的模式的mRNA的表达ZO-1观察胶原IV(数字4 (b)和4 (c))。

3.5。垫调整MMP-9和TIMP-1血清之间的平衡

血清浓度MMP-9 ELISA测定。MMP-9的数量显著增加vehicle-treated组相比单纯组()(图5)。垫治疗很大程度上减少MMP-9相比vehicle-treated组(包括的内容),剂量依赖效应。此外,显著降低数量的观察MMP-9 DEX-treated组比MAT-treated组()。

我们也测量血清浓度的TIMP-1不同的基团。图5显示明显降低在vehicle-treated TIMP-1浓度组相比单纯组()。TIMP-1 MAT-treated组的血清水平明显高于vehicle-treated组()。而低剂量的垫诱导血清TIMP-1水平低于敏捷(),高剂量的垫增加血清TIMP-1水平更大程度上比敏捷()。

3.6。垫调节MMP-2之间的平衡和TIMP-2在中枢神经系统

确定MMP-2 / TIMP-2平衡中枢神经系统,其表达在脊髓通过免疫组织化学方法测定。如图6,MMP-2表达显著增加vehicle-treated组在天真的集团()。MMP-2表达式vehicle-treated之间的差异和两个MAT-treated组显著()。此外,敏捷的影响在减少MMP-2内容比低剂量垫(),但与MAT-H组相比无显著性差异。

然后,我们使用同样的方法测量TIMP-2内容。如图6,TIMP-2表达式vehicle-treated组显著低于单纯组()和MAT-treated组(-0.01)。数量显著降低了MAT-L组比MAT-H集团()。虽然MAT-L-treated组TIMP-2表达式显示低于DEX-treated集团(),没有明显区别MAT-H和敏捷团体。

4所示。讨论

尽管政府垫减少中枢神经系统炎性浸润和髓鞘脱失,这对BBB天然化合物的影响还没有被研究过。在目前的研究中,我们提供了证据表明,垫的治疗效果,至少部分,通过加强BBB的完整性,基底膜的保护以及TJ蛋白,调节基质金属蛋白酶之间的平衡能力和TIMPs周边和中枢神经系统。

BBB破坏已经涉及到许多中枢神经系统的疾病,如女士和中风(4,11]。模型,在MS患者和实验性自身免疫性脑脊髓炎的BBB是早期关键事件,这与大量炎症细胞,最终,一个贫穷的结果(3]。我们因此量化EB染料进入大脑的外渗BBB通透性的一项指标。事实上,我们的研究表明,EB泄漏模型,显著增加在实验性自身免疫性脑脊髓炎与减少胶原IV和ZO-1表达vehicle-treated老鼠而天真的老鼠。垫治疗主要和大脑中显著降低EB含量与汽车集团。在一起,这些结果说明BBB的完整性被破坏,在开发的实验性自身免疫性脑脊髓炎垫治疗保护BBB。

BBB完整性取决于足够的支撑结构的基底膜,和胶原IV包含多达90%的总蛋白在基底膜7]。此外,胶原IV是至关重要的细胞信号的相互作用与各种受体和粘附分子,因此它的表达式是一个屏障损伤和损伤的标志(27]。李等人的研究清楚地表明,降解胶原IV的角色在BBB破坏和脑损伤的发病机制28]。到目前为止,尚不清楚是否减少胶原IV。有助于BBB破坏引起的实验性自身免疫性脑脊髓炎我们在目前的研究表明,胶原IV mRNA的表达明显减少vehicle-treated组相比,天真的集团和胶原IV mRNA表达的增加存在剂量依赖的相关性在MAT-treated组。这些结果表明,胶原IV降解中发挥着重要作用BBB破坏和垫治疗有效地保留胶原IV的内容。

BBB,套是由大型multiprotein复合物调解紧密相邻细胞之间的细胞间接触和发挥重要作用在维护BBB函数通过改善内皮屏障功能的水平(29日]。以前的出版物已经不同程度的报道(TJ病理学在实验性自身免疫性脑脊髓炎30.,31日]。班奈特等人发现,relocalization ZO-1,这是一个多畴的多肽的组装所需的套(32],先于疾病发病与中枢神经系统浸润[在实验性自身免疫性脑脊髓炎33]。类似于这些观察结果,我们的研究发现降低ZO-1 mRNA表达vehicle-treated组相比,天真的组,ZO-1 mRNA水平显著提高了垫治疗剂量依赖性的方式。这些结果符合保存胶原IV水平,表明保护BBB基底膜。

为了进一步研究BBB的机制引起的保护垫治疗,我们评价基质金属蛋白酶的活性和平衡和TIMPs。基质金属蛋白酶,一群zinc-containing肽链内切酶,打通大多数的基底膜组件包括纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖和胶原IV (34,35]。人们已经发现,焦MMP-2和MMP-9活动密切相关的通过实质浸润T细胞穿透基底膜(5,6]。Upregulation MMP-2和MMP-9导致退化的局部缺血/再灌注后套,可逆转的MMP的抑制(36,37]。此外,选择性upregulation MMP-9在MS疾病活动被描述17]。同样,显著增加MMP-2表达式在颈脊髓中央管是炎症的标志(在急性实验性自身免疫性脑脊髓炎38]。此外,中MMP的家庭、MMP-9 MMP-2一起,胶原酶IV家族中的一员,一直与组分的降解基底膜(15]。针对基质金属蛋白酶和趋化因子被认为是一个重要的治疗方法,单独或结合当前药物,增强他们的影响在神经系统疾病如女士(39]。在目前的研究中,观察血清中重要的MMP-9 upregulation vehicle-treated组相比,天真的集团和垫治疗减少MMP-9的水平。第四,胶原蛋白的丧失和ZO-1减少了阻塞MMP-9 MMP-2运算单元。这些研究表明,过度可能是MMP-9和MMP-2实验性自身免疫性脑脊髓炎病原体在胶原IV和ZO-1强度降低;垫治疗抑制MMP-9 MMP-2水平将保持水平的胶原IV和ZO-1从而为BBB的完整性是有益的。

所有基质金属蛋白酶的活性形式是由家庭的特定抑制剂,抑制组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs) [18,19]。MMP-9和MMP-2优先抑制TIMP-1 TIMP-2,分别,17]。人们已经发现,正常的体内平衡中枢神经系统需要一个基质金属蛋白酶和TIMPs之间的平衡,而这些分子之间的不平衡是经常与中枢神经系统相关的病理(40]。例如,放射性脑损伤是增加比率MMP-2和TIMP-221,显著增加MMP-9 / TIMP-1比率也与活动[女士17]。在我们的研究中,一个失衡MMP-9和观察TIMP-1集团vehicle-treated实验性自身免疫性脑脊髓炎的upregulation MMP-9 TIMP-1;差别和对这些这也是MMP-2和TIMP-2之间的平衡。我们可以推测,超表达是MMP-9 / 2的实验性自身免疫性脑脊髓炎MAT-mediated TIMP-1 / 2的增加抵消了表情,构成稳定平衡的基质金属蛋白酶和TIMPs可以归因于提高BBB的功能。

为了进一步调查,垫在实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗效果我们与敏捷垫相比,糖皮质激素,被选为阳性对照药物抑制炎症,是因为其强大的能力。时垫在低剂量显示效果低于敏捷,敏捷和MAT-H团体之间的类似的效果观察,有更强的影响垫在改善血清TIMP-1内容。我们相信垫将被证明是优于敏捷,其长期使用带有系统性糖皮质激素的副作用常见的风险发生在相对较长时间。这些副作用包括高血糖、高血压、负钙平衡,骨质疏松症,体重增加,甚至免疫缺陷(41,42]。敏捷的广泛使用的治疗严重急性呼吸系统综合症(SARS)经常症导致低皮质醇症,该病可以股骨头骨坏死,使病人失去工作能力(43]。相比之下,乙肝患者使用垫很长一段时间显示显著的治疗效果和良好的宽容,只有轻微副作用如罕见的、短暂的眩晕和恶心。长期使用垫是否安全,副作用比敏捷需要进一步调查。

总之,我们的研究表明,改善BBB完整性是一种治疗垫在实验性自身免疫性脑脊髓炎的机制。这种影响至少部分是通过抑制MMP-2活动/ 9和保护基底膜和紧密连接蛋白,从而提高BBB的完整性。因此,炎性浸润到中枢神经系统在很大程度上减少,从而保护中枢神经系统组织促炎细胞/ mediator-induced损伤。虽然部分免疫细胞外渗的过程是一个内皮细胞介导的过程(44),是否垫降低这个途径免疫细胞的渗透还不知道。然而,从目前的研究结果,结合垫Th1 / Th17细胞的抑制效应(23)和它的安全,建议垫可以成为一个有效的,女士替代药物治疗和进一步的研究来测试这个可能性是必要的。

利益冲突

作者都没有利益冲突,本文中提到的任何商标。

确认

这项研究得到了河南省科学技术发展计划(没有。122102310229)和赠款河南、实验动物中心的中国。这篇社论作者谢谢凯瑟琳·里根援助。