文摘

神经退化的一个特点是大部分的中枢神经系统(CNS)疾病包括中风。最近炎症与神经退化和神经退行性疾病的发病机理。本研究的目的是分析一些炎症标记物的表达及其与发展相关的神经退行性变的早期阶段的实验中风。颅内注射引起的缺血性中风模型立体定位vasoconstricting代理endothelin-1 (ET-1)。是观察到神经退行性变的早期出现在模型和关联与炎症淋巴细胞和巨噬细胞的迁移到大脑。虽然一些研究趋化细胞因子的表达(趋化因子)显著增加ET-1诱导中风早期阶段的模型,没有明确的相关性观察神经退化的表达式。这些数据可能表明,趋化因子不会直接诱导神经退化。调节大脑缺血性趋化因子可能是一个潜在的目标为未来疗法减少炎症细胞迁移到大脑早期中风。抑制炎症细胞在大脑中积累在中风的早期阶段可能导致改善缺血性神经退化。

1。介绍

中风仍然是全球死亡和长期残疾的主要原因,它与重要的临床和socioeconomical问题相关联。尽管不断努力发展新的药理策略,目前没有有效的神经保护治疗缺血性中风。新方法需要改善复苏和中风患者的生活质量。发展组织损伤后缺血性侮辱不仅依赖持续时间和强度的血流量减少,但也流独立机制,尤其是在peri-infarct大脑区域。组织损伤的血流依赖性机制发展大脑缺血性集中爆发后的短时间内血流量减少。当时的细胞死亡是一个能量衰竭和永久的结果缺氧细胞去极化引起的离子梯度的损失。几个小时后,梗塞扩展到相邻的半影,与细胞损伤主要是由会触发,线粒体紊乱,活性氧产量,和程序性细胞死亡1,2]。

会是一个病理过程基于大量激活AMPA和NMDA受体在大脑中。不当AMPA和NMDA受体的激活触发后续神经元的钙离子内稳态失调,最终导致神经元的损失。观察到大量激活这些受体在许多中枢神经系统障碍包括中风、癫痫、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化、帕金森、阿尔茨海默症,亨廷顿疾病。最重要的因素导致AMPA和门冬氨酸upregulation谷氨酸。在生理浓度谷氨酸是一种重要的神经递质,但在病理上高浓度神经毒性(3- - - - - -5]。

最近,建议中风触发免疫反应导致炎性细胞激活和脑实质的渗透。中风大脑upregulation的多种细胞毒性药物如细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPs),一氧化氮(NO),和更多的活性氧可以检测到6- - - - - -8]。还有upregulation CCL2等趋化因子的表达的CSF (9,10和中风患者的血清11]。研究在实验中风(大脑中动脉阻塞(MCAo)模型证实趋化因子的参与CCL2及其受体CCR2在中风发展(12]。调节血清中表达CCL5缺血性中风患者是有争议的。扎等人报道没有区别CCL5水平(13]但Montecucco和他的同事发现的表达增加等离子体CCL5在症状与无症状患者相比(14]。此外,Canoui-Poitrine证实,较高的系统性CCL5水平和CXCL10在无症状男性缺血性中风的独立预测指标15]。还有最近的一份报告从Tokami等人支持CCL5可能在中风神经发展的概念(16]。他们显示upregulation CCL5但不是CCL2, CCL3和亚兰在中风病人在0天。这upregulation BDNF与等离子体浓度的神经因素,表皮生长因子,VEGF (16]。其他数据从MCAo模型还显示upregulation几种趋化因子及其受体包括CCL7 [17],CXCL10 [18],CCL20 [19],趋化因子受体CXCR4 (20.]和CCR6 [19]。

ET-1诱导中风模型已经被安东尼等人先前描述诱导急性大鼠的脑血容量变化后静脉和颅内注射血管收缩剂(21,22]。ET-1显微镜下注射后到选定的大脑区域他们观察到使用磁共振成像(MRI)急性减少注射局部灌注的半球,灰质神经元和巨噬细胞的损失/小胶质细胞和星形胶质细胞的反应。后注入ET-1皮质白质,那些作者观察淀粉样前体蛋白阳性免疫染色(表明轴突中断)和增加tau-1寡树突胶质细胞免疫染色。类似于灰质病变,没有现在的中性粒细胞和巨噬细胞和小胶质细胞反应没有发生。此外,没有破坏血脑屏障是白色和灰色物质检测(22]。

在这项研究中几种趋化因子的表达,包括:CCL2, CCL3, CCL5, CXCL2以及表达CD3、标记的神经炎症F4/80, il - 1测试进行了研究。这个表达式与早期强度的相关性在大脑中检测到的神经退化在ET-1诱导中风模型也进行了分析。

2。材料和方法

2.1。动物

在所有的实验中,8 - 12个月大的雌性SJL / J小鼠(n每个时间点= 5)。所有的动物都被安置在动物设施罗兹的医科大学,罗兹,波兰,在标准条件下。所有的动物都是依照制度动物保健和使用指南。所有实验在这个研究当地伦理委员会批准的动物实验。

2.2。Endothelin-1诱导中风模型的感应

中风动物模型诱导,立体定向颅内注射endothelin-1 (ET-1 Sigma-Aldrich,波兹南,波兰,)(20 pmol 1μL (PBS /鼠标)进入大脑的左半球。ET-1是一种有效的血管收缩剂剂的小型和大型船只。之前注射小鼠麻醉与氯胺酮的混合物(1、15毫克Biowet、Pulawy、波兰)和ksylazine(0, 1毫克,Biowet、Pulawy、波兰)/鼠标。完成后麻醉老鼠放在立体框架(大卫·科夫仪器、钙、美国),皮肤的头被切断,在头骨和一个小洞使用手术钻。ET-1管理了汉密尔顿注射器(32 g针)(汉密尔顿公司,Bonaduz、GR、瑞士)。注射部位出现的(a - mm, l - 1、2毫米,d2, 5毫米)选择使用立体定向地图”老鼠脑立体定位坐标”第二版乔治Paxinos和基思B.J.富兰克林。组织样本收集24和72小时后模型归纳。控制,大脑从uninjected老鼠和老鼠注射以同样的方式与PBS。

2.3。提取的RNA和蛋白质

获得RNA动物,与生理盐水灌注。组织称重,然后使用机械均质机均质超Turrax(德国IKA, Staufen)。组织是均相的体积1毫升的试剂盒LS试剂(Gibco BRL表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)。匀浆储存在−80°C到使用。RNA从匀浆分离试剂盒LS试剂使用phenol-chloroform方法被Chomczynski和萨基(Chomczynski萨基,1987)。RNA分离后,其浓度估计采用光度法(BioPhotometr +埃普多夫公司,维也纳,奥地利)。获得的蛋白ELISA试验,用生理盐水灌注动物。收获器官重使用实验室的平衡(Radwag波兰,波兰)和均质使用机械均质器超Turrax (IKA)。均化作用进行了体积的1毫升消息灵通的缓冲pH值7.4包含:玫瑰−20毫米;EDTA−1.5毫米; benzamidynę −0.5 mM; chicken egg owoinhibitor −10 ug/mL PMSF (phenylmetylsulfonyl fluoride) −0.1 mM (Sigma-Aldrich, Poznan, Poland). After homogenization homogenates were frozen and stored at −80°C. Supernatants were obtained after centrifugation (20 000 × g, time 30 minutes at 4°C MPW, Warsaw, Poland).

2.4。分析RNA的基因表达水平的实时PCR

RNA表达的分析都使用了Corbett实时PCR机转子基因3000设备(Corbett研究,悉尼,澳大利亚)。这个反应中使用的关键酶是Taq 5 U /毫升的活动。额外的缓冲了聚合酶反应组件,MgCl2 25毫米,10毫米核苷酸,荧光染料EvaGreen (Biomibo,华沙,波兰),10μM引物的重复序列,和核糖核酸酶/ DNase免费供水。为每个反应2μL (cDNA来源于使用逆转录反应和总成交20μl .作为控制组蛋白H3基因和参考RNA (QPCR鼠标参考细胞总RNA, Stratagene,拉霍亚,CA,美国)。

2.5。分析基因表达的蛋白质水平ELISA

定量分析基因表达的蛋白质含量进行了使用ELISA方法和商用immunoenzymatic Quantikine工具包(R & D系统、MN、美国)。每组由96孔板涂层制造商,用于准备校准标准蛋白质,二、三级抗体结合辣根过氧化物酶酶,和洗涤缓冲和颜色过氧化物酶的底物。试验过程是根据制造商提供的协议执行。停止后的颜色反应蛋白浓度是评估使用光度读者VICTOR2 Wallac 1420(美国PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)与450纳米过滤器,纠正在595海里。都在重复的样本进行了分析。

2.6。量化的评估使用ELISA方法神经退化的程度

神经退化强度的定量评估是使用ELISA方法和执行主要针对磷酸化神经纤维细丝的抗体。第一步是96年的涂料以及Maxisorb Microtitre板(Nunc、鲁开德、丹麦)单克隆anti-NfH抗体(单克隆抗体SMI35R,斯特恩伯格,Convance普林斯顿,纽约,美国),在4°C隔夜孵化。主要抗体稀释在碳酸盐缓冲,pH值9.6。第二天测试样品和标准曲线样品(神经丝200 kD, Progen,海德堡,德国)被添加。作为一个次要的兔多克隆抗体antineurofilament 200抗体(Sigma-Aldrich,波兹南,波兰)使用。作为三级猪兔抗体免疫球蛋白抗体与辣根过氧化物酶共轭(Dako、斯特鲁普、丹麦)。最后一步是添加颜色为辣根过氧化物酶底物,3,3 5′,5′-tetramethylbenzidine (Sigma-Aldrich,波兹南,波兰)。抑制反应的进行,1 M盐酸最后颜色光度评估使用VICTOR2读者Wallac 1420(美国PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。分析了使用450纳米过滤器和修正在595海里。所有样本分析重复和NfH的浓度指的是由标准曲线。

2.7。使用C Fluoro-Jade染料检测定位的神经退化

神经退化的本地化和严重性的评估水平的蛋白质进行使用荧光染料Fluoro-Jade C (Chemicon,微孔,华沙,波兰)。动物灌注4%的缓冲福尔马林溶液和组织样本嵌入在石蜡块。10μ米厚的部分应用于抛光超级霜幻灯片(Menzel-Glaser布伦瑞克,德国)。最终染色石蜡之前被孵化一小时60°C和二甲苯两分钟孵化项目。组织在一系列醇水化。Fluoro-Jade C染色根据制造商提供的协议执行(Chemicon)。细胞核染色的部分是用蓝色的荧光染料复染色DAPI (Sigma-Aldrich,波兹南,波兰)。然后使用DPX组织安装和盖玻片(Sigma-Aldrich,波兹南,波兰)。

2.8。图像采集

图像的分析和收购一个倒置显微镜AxioObserver A1(卡尔蔡司Inc .,哥廷根,德国)使用。使用以下镜头由卡尔蔡司公司:Plan-Achromat: 4 x / 0.10, A - 10 x / 0.25 Ph1计划;LD计划20 x / 0.3;LD Plan-Neofluar 40 x / 0.6, Ph2 Korr。使用数码相机时,获得的图像是AxioCam MRc5(卡尔蔡司集团、哥廷根、德国)连接到显微镜。图像采集我们使用Axio-Vision Rel。4.6软件(卡尔蔡司集团)。获取图像后没有进一步的处理是必要的。

2.9。统计分析

非参数统计分析克鲁斯卡尔-沃利斯和Mann-Whitney测试。相关性分析肯德尔τ测试使用。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。大脑的炎症标记物的表达在中风的早期阶段的动物模型

重要的T细胞株表达upregulation标记,观察CD3 ET-1-injected半球在72 h后注入(Mann-Whitney测试(图)1(一))。当时的显著差异表达CD3发现同侧和对侧半球之间(Mann-Whitney测试(图)1(一))。表达CD3的同侧半球相比也增加了PBS注入半球(Mann-Whitney测试)。

单核/巨噬细胞系的表达标记F4/80显著升高仅在ET-1注入半球在72小时后注射。当时显著差异中观察到的表达F4/80 ET-1注入半球与未经治疗的对照组(;Mann-Whitney测试)(图1 (b))。我们还发现显著差异表达的同侧和对侧半球之间F4/80 ET-1注入小鼠在注射后72小时(Mann-Whitney测试(图)1 (b))。

Upregulation的细胞因子il - 1β表达在ET-1注入半球只在注射后24小时。在il - 1的表达显著差异β观察侧半球与正常对照组之间在72小时后注入(和0.019,分别地;Mann-Whitney测试)(图1 (c))。我们还检测到表达il - 1的显著差异β同侧和对侧半球之间ET-1注射小鼠注射后72小时(,、职责;Mann-Whitney测试)(图1 (c))。

3.2。趋化因子的表达ET-1-Induced中风模型

Upregulation趋化因子CCL2表达在同侧半球在24和72 h后注入ET-1 (,、职责;Mann-Whitney测试)(图2(一个))。同侧半球在24 h CCL2表达显著高于72 h (;Mann-Whitney测试)。显著差异在CCL2表达式ET-1注射后也观察到同侧和对侧半球之间在24 h和72 h (和0.036,分别地;Mann-Whitney测试)(图2(一个))。

我们还表明,在早期阶段CCL3 ET-1-injection中风模型表达的显著调节在24和72 h后感应(图模型2 (b))。有重大upregulation CCL3表达同侧半球ET-1注射小鼠与正常对照组相比,侧半球在注射后24小时(和0.012,分别地;Mann-Whitney测试)。在72 h模型归纳后,我们观察到显著upregulation CCL3表达ET-1-injected相比正常的大脑半球和侧半球(和0.019,分别地;Mann-Whitney测试)(图2 (b))。

的表达增加第三分析观察炎性chemokine-CCL5 ET-1-injected半球相比uninjected动物在24和72 h (和0.008职责。Mann-Whitney测试)(图2 (c))。显著差异也观察到同侧和对侧的CCL5表达式之间的半球在注射后24 h和72 h ET-1 (和0.012,分别地;Mann-Whitney测试)(图2 (c))。

最初增加表达CXCL2 ET-1注入半球与峰值检测24小时72 h和随后的减少,但仍明显高于正常对照组(和0.036,分别地;Mann-Whitney测试)(图2 (d))。同侧半球在24 h CXCL2表达显著高于72 h (;ET-1 Mann-Whitney测试),然后在24小时后注射侧半球(;Mann-Whitney测试)(图2 (d))。

的表达ET-1 CXCL12和PBS-injected大脑和正常对照组分析组之间并没有表现出显著差异(数据没有显示)。

3.3。分析神经退化的强度和本地化ET-1-Induced中风模型

最严重的神经退化观察ET-1-injected半球在24和72 h后模型归纳(和0.029,分别地;Mann-Whitney测试)(图3(一个))。也有增加侧半球的神经退化ET-1注入小鼠在24和72 h,但它明显低于同侧半球(和0.03,分别地;Mann-Whitney测试)(图3(一个))。

缺血性病变的定位是在ET-1发现注射用甲苯基侧半球紫染色(图3 (b)大盒)。在缺血性焦点受伤神经元丰富(被Fluoro-Jade和被箭头)细胞细胞核复染色与DAPI标记在图片的箭头(图3 (c))。

3.4。炎症标记物之间的相关性和神经退化ET-1中风模型

我们观察到淋巴细胞谱系标记的表达CD3之间的正相关关系(Kendallτ=−0,62;)(图4(一))以及单核细胞/巨噬细胞谱系标记F4/80 (Kendallτ=−0,56;)(图4 (b))和神经退化的严重性ET-1注入大脑半球。

尽管一些研究趋化炎症介质的表达(CCL5,趋化因子CCL2, CCL3和CXCL2)明显增加中风的早期模型中,没有明确的表达式和强度之间的相关性神经退化(数据没有显示)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们分析了潜在的神经炎症和神经退化之间的关系的实验模型缺血性中风引起的颅内ET-1注入。我们专注于一群促炎趋化因子,特别是古典CCL亚科分部的代表。选择这些趋化因子的原因是他们确认参与许多中枢神经系统疾病的发病机制。前几天我们观察到越来越多的神经退化的实验性脑缺血ET-1注入半球。有几项研究表明,神经退化发生在脑缺血早期(23,24]。当时也炎症变化出现在缺血性脑区(25]。这两个过程之间的关系是复杂的,仍然需要进一步的研究。衡量神经炎症炎症细胞标记物的表达强度为T细胞(CD3和F4/80单核细胞/巨噬细胞)同时测量。这个分析显示增加淋巴细胞迁移在72 h后缺血性脑半球模型归纳。同样,渗透侧半球的单核细胞/巨噬细胞显著增加在脑缺血后的72 h。比较观察其他人的报道显示巨噬细胞的存在/活化的小胶质细胞在72 h后颅内注射ET-1老鼠大脑(22]。使用MCAo中风模型的另一项研究中,单核细胞的大量涌入的网站记录脑缺血后15天2和模型之间感应(26]。

在脑缺血早期神经炎症的存在在我们的研究也证实了炎性mediator-cytokine表达升高il - 1β。观察它的存在早在24小时后模型归纳。il - 1的表达β在脑缺血巴龙等人发现了在几个细胞类型包括星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和内皮27]。在另一项研究中增加il - 1的生产β据报道甚至诱导脑缺血后3 - 6小时。这个表达式的峰值是观察到12 h,它回到基线水平后5天。其他的研究也证实,炎症介质,如il - 1β和肿瘤坏死因子α是重要的贡献者,中枢神经系统缺血引起的神经组织损伤(28,29日]。

在中风模型分析缺血性脑的渗透之间的关系由单核炎症细胞和神经退化强度测量的存在磷酸化神经纤维细丝显示正相关。这可能表明存在炎症和神经退行性变的有紧密联系在缺血性中风。炎症细胞的迁移从血液到大脑缺血性cytokines-chemokines可能至少部分引起的趋化作用。研究这个概念我们分析了大脑中某些趋化因子的表达。的最高表达CCL2观察在我们的模型在脑缺血后的24小时。增加表达CCL2还观察到72 h,但显著降低。增加表达CCL2 MCAo模型同侧半球的观察神经元在12 h和星形胶质细胞在心脏骤停后24小时,这表明这些细胞CCL2在缺血性中风的潜在来源30.]。并使用双Satoh。南原位杂交的方法指出,小神经胶质细胞来源CCL2在MCAo [31日]。MCAo的另一项研究中显示,CCL2导致中枢神经系统浸润的单核细胞,从而提高缺血引起的脑损伤(30.]。也在人类中风患者高水平CCL2脑脊液和血清中检测出的9,11]。

最高CCL3表达发现ET-1注射后24小时。在72 h这个表达式仍在增加,但远低于24小时。还我们观察到的蛋白质水平显著增加在缺血性脑CCL3生产。我们的结果符合Gourmala等人的报告,他们发现增加CCL3表达式在mRNA水平已经在1 h在大鼠MCAo后,分裂到8 - 16个h与峰值表达式(32]。此外,他们观察到的高表达CCL3期间临时MCAo比永久MCAo,建议再灌注的影响在神经炎症受损组织。Gourmala等人使用原位杂交本地化CCL3的表达对小胶质细胞/巨噬细胞在脑缺血(32]。此外,另一个研究得出结论,CCL3应用程序完成MCAo后大脑心室增强MCAo有害影响(33]。

我们观察到几乎46-fold和30倍增加CCL5表达式在24 h和72 h,分别诱导后ET-1诱导中风模型。只有少数报告有关的角色发展的CCL5缺血性中风(15]。扎等人没有区别的CCL5水平从中风患者血清13]。建议CCL5调节血脑屏障(BBB)破坏中枢神经组织损伤和炎症后再灌注期间MCAo模型。Terao等人表明,血小板的潜在来源CCL5与MCAo大鼠(34]。这些数据都没有证实Tokami和同事观察到神经保护作用在缺血性中风CCL5表明CCL5表达在神经元(中风主要16]。

在ET-1诱导实验性中风在CXCL2表达显著增加脑缺血诱导后24 h也观察到。这一增长48 h后回到基线水平。Rabuffetti等人观察到的表达增加CXCL2与永久MCAo大鼠的大脑(35在大脑和脾脏)以及临时MCAo老鼠。在其他研究中增加CXCL2表达观察再灌注6 h时,减少了近一半的22小时后再灌注(36]。Vikman等人显示增加CXCL2表达大脑血管模型的蛛网膜下腔出血和organotypic文化中37]。CXCL2在中枢神经系统参与炎症过程MCAo也证实在SCID小鼠。MCAo SCID小鼠诱导导致发展显著降低脑损伤和炎症浸润在同侧半球低。降低许多炎症介质的表达包括CXCL2也观察到T -和B-cell-deficient老鼠MCAo研究[38]。不幸的是,治疗缺血性中风的CXCL2 receptor-CXCR2拮抗剂SB225002不成功(39]。在报告Copin等人处于受控/ CXCL2 chemokine-binding蛋白质Evasin-3治疗与减少小鼠中性粒细胞炎症MCAo模型。然而,脑缺血发作后Evasin-3政府未能改善卒中后结果(40]。

虽然在我们的研究中几个研究趋化因子的表达显著增加在ET-1诱导中风的早期阶段模型中,没有明确的相关性观察神经退化的表达式。这些数据表明,趋化因子不会直接诱导神经退化。相反的,他们认为,抑制炎症细胞在大脑中积累中风的早期阶段可能导致改善缺血性神经退化。调节大脑缺血性趋化因子可能是一个潜在的目标为未来疗法减少炎症细胞迁移到大脑早期中风。

确认

本研究由欧盟支持FP6 (INNOCHEM,格兰特lshb - ct - 2005 - 518167)和研究格兰特N N401 1275 33从波兰科学和高等教育。