文摘
中性粒细胞胞外陷阱(网)建议发挥病理生理作用在一些自身免疫性疾病。NET-formation以来应对几个生物和化学刺激主要是ROS依赖,理论上任何物质,抑制或进行清除ROS可以防止ROS-dependent净释放。因此,在目前的全面研究,一些抗氧化物质抑制能力进行了评估网络的形成主要人类中性粒细胞在体外。我们可以表明,类黄酮(−)表儿茶素、水合(+)儿茶素、芦丁三水以及维生素C和药理物质N-acetyl-L-cysteine 5-aminosalicylic酸抑制PMA诱导活性氧产量和净形成。因此,广泛的抗氧化物质,减少活性氧的生产主要人类中性粒细胞也抑制ROS-dependent净形成。人们很容易推测,这种抗氧化剂可以有益的治疗效果与ROS-dependent净相关疾病的形成。
1。介绍
中性粒细胞是至关重要的效应细胞的先天抗菌防御。作为专业的吞噬细胞中性粒细胞摄取并杀死入侵微生物。然而,通过抗菌肽的释放和活性氧(ROS),他们也能够杀死病原体独立于其吞噬功能(1]。此外,中性粒细胞可以捕捉并杀死病原体通过释放嗜中性粒细胞胞外陷阱(网)2]。网是复杂的三维结构包含几个抗菌中性粒细胞颗粒蛋白质与DNA骨干(2]。他们大多是接受NETosis从激活中性粒细胞释放,细胞死亡的一种不同于细胞凋亡和坏死3]。这个程序,裂解细胞的死亡是由活性氧,如超氧化物和次氯酸盐(OCl−)产生的酶NADPH氧化酶和髓过氧化酶(MPO) [3- - - - - -10]。尽管ROS的产生和活动NADPH氧化酶和MPO一直声称是必不可少的在网的形成反应几个生物和化学刺激,它也被报道说,一些微生物(金黄色葡萄球菌,l . donovani)和某些刺激(MIP-2)能够诱导网ROS独立的方式(11- - - - - -13]。
一些研究显示网和网络组件的病理生理作用等自身免疫性疾病的小血管血管炎,红斑狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE),牛皮癣,类风湿性关节炎2,14]。因此,抑制的净释放可能导致这些疾病有益的治疗效果。自净释放主要是依赖ROS和NADPH氧化酶,MPO活性生成活性氧(4,9,15),也在自身免疫性炎症性疾病,如风湿性关节炎(16)或系统性红斑狼疮17],任何分子抑制ROS的生成或进行清除ROS应该能够防止ROS-dependent NETosis。众所周知,NADPH氧化酶的抑制剂和MPO,如氯化diphenyleneiodonium (DPI)或叠氮化钠,非特定的或对宿主细胞的毒性(18),分子缺乏这样的毒性作用可以适合医学应用。其中包括激进的食腐动物和药理学的药物。只有少数研究解决这些物质的影响在人类中性粒细胞的净释放9,19- - - - - -22]。在目前的全面研究,广泛的与抗氧化活性物质抑制能力进行了评估ROS-dependent净的形成主要人类中性粒细胞在体外识别分子在NET-related疾病治疗药物的潜力。净生产新鲜分离中性粒细胞被佛波醇诱导十四烷酸酯(PMA),最好的特征ROS-dependent NETosis模型。在这项研究中使用的抗氧化剂可以分为三大组:黄酮类化合物、维生素、和其他药理物质。这些物质的抗氧化作用有关不仅像超氧化物清除活性氧的能力羟基自由基()或次氯酸盐(OCl−)。除了清除影响类黄酮等抗炎药5-aminosalicylic酸和乙酰水杨酸可以抑制MPO、以及(23- - - - - -26]。集团的类黄酮,(+)儿茶酸水合物、三水(-)表儿茶素、芦丁。与著名的抗氧化活动两种维生素,维生素C(抗坏血酸)和E ((α)生育酚),也在我们的研究中进行测试。此外,N-acetyl-L-cysteine,天然抗氧化剂谷胱甘肽的前体27),与活性氧清除剂和松果体激素活动褪黑激素(28)进行了测试。
本研究首次揭示了黄酮类化合物表儿茶素的抑制作用,儿茶酸水合物、三水芦丁和药理学药物5-aminosalicylic酸的ROS依赖网络的形成。相同的抑制作用在ROS和净形成观察维生素C以及药物N-acetyl-L-cysteine。所有这些物质表现出显著的抗氧化活性在活性氧的形成和抑制释放ROS-dependent网从PMA刺激人类中性粒细胞在体外,而其他效应功能,比如吞噬作用、趋化性、脱粒没有影响。乙酰水杨酸,α生育酚,褪黑激素没有影响净形成本研究。
2。材料和方法
2.1。道德声明
血液收集了每个参与者的理解和同意,医学院伦理委员会批准的吕贝克大学的(05 - 124)。
2.2。隔离和文化基本人类中性粒细胞
周边血液的静脉穿刺收集使用lithium-heparin健康成人志愿者。中性粒细胞通过密度梯度离心法分离所述[29日]。细胞制剂包含粒细胞99.9%由形态学检查Giemsa-stained cytocentrifuged幻灯片(Shandon,匹兹堡,美国)。中性粒细胞在完全培养基培养(RPMI 1640中补充了50μM 2-mercaptoethanol, 10毫米玫瑰,10%热灭活胎牛血清(所有从Sigma-Aldrich、Steinheim德国)包含4毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(所有从Biochrom,柏林,德国)37°C在湿润空气的气氛中含有5%的股份有限公司2。
2.3。抗氧化剂
抗氧化剂是食腐动物各种活性氧(ROS),用于本研究评估它们对活性氧的释放的影响以及净形成PMA - (Sigma-Aldrich、Steinheim、德国)刺激中性粒细胞。在所有实验中中性粒细胞被preincubated抗氧化剂为30分钟37°C网前PMA诱导的。如果中性粒细胞治疗与抗氧化剂作为控制排除非特异性影响抗氧化剂的ROS, NET-assays执行。作为抗氧化剂维生素C L-ascorbic酸(0.2 - 2毫米)和维生素E ()- - -生育酚(50μ米,生育酚,Sigma-Aldrich)以及黄酮类化合物(−)表儿茶素(表儿茶素,4 - 100μ米),(+)儿茶酸水合物(儿茶酸水合物,4 - 100μ三水M,从Sigma-Aldrich)和芦丁(0.1 -150μ米卡尔•罗斯、德国卡尔斯鲁厄)。此外,褪黑激素的抗氧化效果,1 - 2毫米,Sigma-Aldrich 5-aminosalicylic酸(0.005,0.25,0.5 mM, 5-ASA, TCI欧洲喷嘴速度德国埃施博恩),乙酰水杨酸(1毫米,屁股),和N-acetyl-L-cysteine(5 - 10毫米,南汽,所有从Sigma-Aldrich)进行了研究。尿素(1毫米),没有清除能力和没有影响ROS-mediated信号通路被用作消极的控制。作为额外的控制,中性粒细胞在中独自和孵化,如果有必要,在介质包含相关的溶剂。DMSO溶液和乙醇(EtOH)代表了类黄酮的溶剂控制,乙酰水杨酸,生育酚,褪黑激素。每个实验和抗氧化剂都准备新鲜无菌过滤。整个实验是在无菌条件下完成的准备工作,在黑暗中。
2.4。检测活性氧(ROS)释放
刚分离人类中性粒细胞(/毫升)被播种在定制修改rpmi - 1640中无酚红和碳酸氢钠含20毫米玫瑰(Biochrom,柏林,德国)在96年nunclon三角洲白microwell板(Nunc、Langensbold、德国)和preincubated有或没有抗氧化剂为30分钟37°C和5%的公司2。两个化验检测活性氧的生产执行。
2.4.1。鲁米诺试验
luminol-amplified化学发光分析是用来检测内部和细胞外ROS的总和。鲁米诺(5-amino-2 3-dihydro-1 4-phthalazindione)由MPO-derived代谢物(兴奋30.]。在激活中性粒细胞布满和释放MPO嗜苯胺蓝的颗粒。由于这些影响,细胞内和细胞外的ROS都检测到这种技术。
中性粒细胞pre-incubated有或没有抗氧化剂与0.06毫米彩色发光氨(Sigma-Aldrich)和20 nM PMA刺激或如果离开了。后立即刺激,产生的化学发光的增加活性氧产量不断分析/ (1 h在37°C到200年无限专业读者和Tecan我控制1.8软件(Tecan, Crailsheim,德国)。样品没有PMA治疗(中)和中性粒细胞pre-incubated溶剂控制被用作控制。DMSO和EtOH用作特定的抗氧化剂溶解在溶剂控制这个媒介。
2.4.2。Lucigenin化验
Lucigenin专门降低超氧化物阴离子自由基和释放能量形式的结果。MPO-derived ROS不要外叶lucigenin [30.,31日]。因此,lucigenin-enhanced试验被用来研究中性粒细胞的过氧化物生产。因为它的大小,lucigenin无法穿透细胞膜,只检测到细胞外而不是细胞内ROS (32]。中性粒细胞被视为前面描述的那样,而是0.06毫米的鲁米诺,0.2毫米lucigenin (Alexis, Loerrach,德国)补充道。
2.5。中性粒细胞胞外陷阱的感应和检测
染色检测细胞外的DNA和DNA非cell-permeable染料SYTOXgreen是一种常用的和完善的方法来研究网的形成(4,33- - - - - -35]。评估ROS-dependent净形成PMA-stimulated中性粒细胞pre-incubated有或没有抗氧化剂刚分离人类中性粒细胞(/毫升)净介质(定制修改rpmi - 1640中没有phenolred和碳酸氢钠含20毫米玫瑰(Biochrom,柏林,德国),补充0.5%的人类血清白蛋白(贝林,马尔堡,德国)和10毫米消息灵通的缓冲区(PAA、派斯克、奥地利))被播种96 nunclon三角洲黑色microwell板(Nunc)和pre-incubated有或没有抗氧化剂为30分钟37°C, 5%的公司2。后来,5μM SYTOXgreen(生活技术,达姆施塔特,德国)补充说,其次是刺激与20 nM PMA (Sigma-Aldrich)。排除非特异性效应,例如NET-assay自发荧光的抗氧化剂,如果中性粒细胞治疗抗氧化剂作为控制。的荧光NET-bound SYTOXgreen(激励:488 nm,排放:510海里)分析了一段5 h每5分钟37°C到200无限读者和Tecan我控制1.8软件(Tecan)。介质和溶剂(DMSO EtOH)被用作控制。
2.6。可视化荧光和扫描电镜的网
荧光显微镜(FM)和扫描电子显微镜(SEM)进行了可视化网络形成和确认SYTOXgreen化验的结果。刚分离人类中性粒细胞(/毫升)净介质preincubated抗氧化剂或介质/溶剂控制在30分钟37°C。中性粒细胞被播种在黑色96μ板(Ibidi Planegg / Martinsried,德国)的荧光显微镜或8μ幻灯片(Ibidi)免疫组织化学染色。预培养后,样本沾100海里SYTOXgreen(技术)。净的形成是由20 nM PMA诱导(Sigma-Aldrich) 3 h。样品没有PMA被用作控制。之后的样品被固定为4%多聚甲醛(σ)在室温下10分钟。上层清液是小心地删除。洗后用nuclease-free水(Sigma-Aldrich),样本固定与安装介质(Ibidi)与荧光显微镜分析BZ9000E使用第二热分析仪软件(从日本基恩士,Neu-Isenburg,德国)。为内部和细胞外中性粒细胞髓过氧物酶免疫组织化学染色,样品与4%多聚甲醛固定(σ)10分钟,permeabilized解决Triton-X 0.5%(默克公司,达姆施塔特,德国)1分钟,洗了三次和PBS (PromoCell,海德堡,德国)。未指明的结合位点是被一个缓冲区包含正常山羊血清(杰克逊ImmunoResearch欧洲,纽马克特,英国)在PBS的比例1:20 30分钟37°C。之后,样本主要抗体孵育鼠标反髓过氧化物酶(AbD Serotec,杜塞尔多夫,德国,1:500)1 h在37°C。 Following washing with PBS three times, the secondary antibody goat anti-mouse (Cy3-conjugated AffiniPure片段山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L),杰克逊ImmunoResearch欧洲)添加(1:500)1 H在37°C。样本清洗三次PBS和沾有100海里SYTOXgreen(技术)在黑暗中10分钟。最后,用nuclease-free水样本洗了三次(Sigma-Aldrich)和固定使用安装介质(ibidi)。
扫描电镜是用中性粒细胞/样本决定thermanox盖玻片(Nunc) 24好培养板(Greiner-Bio-One)。NETosis被20 nM PMA诱导(Sigma-Aldrich)与抗氧化剂预培养后。孵化后为3.5 h在37°C,上层清液被小心地删除和样本固定Monti-Graziadei解决方案(2%戊二醛、0.6%多聚甲醛在0.1甲次砷酸盐缓冲,bpH 7.2) 2天。崛起的酒精系列的样本脱水(30、40、50、60、70、80年,90年为100%,每15分钟),放置在铝幻灯片,用黄金或platin气急败坏,在扫描电镜检查505(飞利浦、埃因霍温、荷兰)。
2.7。统计分析
实验检测活性氧的动力学和净释放进行了分析通过计算曲线下的面积(AUC)每个样本(图1(一))。这些auc表示为条形图(图1 (b))。统计分析与GraphPad棱镜进行软件5使用单向方差分析测试和Bonferroni期末测验。因为donor-dependent差异,所有数据归一化对中性粒细胞和PMA刺激(媒介)。统计分析、媒介或溶剂控制(DMSO, EtOH)被用来作为参考。
(一)
(b)
3所示。结果
3.1。本研究中使用的抗氧化剂在人类中性粒细胞不诱导细胞凋亡或坏死在体外
抗氧化剂的浓度选择要么基于文献[22,23,36- - - - - -41)或自己的初步研究。排除有毒或凋亡诱导效应,新孤立的人类中性粒细胞孵化与抗氧化剂/ 5 h和double-stained膜联蛋白V-FITC propidium碘。膜联蛋白V-FITC结合磷脂酰丝氨酸暴露的凋亡中性粒细胞坏死细胞(碘化而propidium标签42]。没有应用抗氧化剂产生有毒或5 h后凋亡诱导效应相比,适当的溶剂控制网上见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/710239。
3.2。黄酮类化合物、维生素C、5-ASA和南汽抑制PMA刺激ROS人类中性粒细胞释放
分析了细胞内或细胞外ROS的文化PMA刺激中性粒细胞preincubated抗氧化剂使用两种活性氧的检测方法。MPO-derived ROS次氯酸等已被证明参与净释放的感应4,9]。因此,第一种方法,luminol-amplified化学发光分析应用于评估抗氧化剂对内部的影响和细胞外ROS生产。在这种测定过氧化氢和MPO-derived ROS,次氯酸盐和羟基自由基等(30.,31日),氧化鲁米诺,释放光和化学发光检测。
我们观察到,黄酮类化合物表儿茶素和三水合芦丁以及抗坏血酸和5-aminosalicylic酸(5-ASA)强烈和明显抑制中性粒细胞ROS浓度的方式生产(数字2(一),2(c),2(d)2(h)),这表明这些抗氧化剂清除/影响MPO-derived ROS。在暴露于N乙酰半胱氨酸(NAC)降低ROS生产观察到的趋势。然而,在统计学上没有显著的差异(图2(f))。没有观察到主要抑制作用ROS曝光后中性粒细胞儿茶酸水合物,生育酚,褪黑素,屁股,和尿素控制(数字2(b),2(d),2(e)2(g))。
第二种方法,各种抗氧化剂对活性氧的生产研究的影响通过使用lucigenin-amplified化学发光分析检测到细胞外的ROS,主要是超氧化物阴离子(30.,31日]。细胞外超氧化物自发dismutates过氧化氢,这已被证明诱导网当添加细胞外地(3]。此外,在激活/脱粒和/或细胞外释放MPO NETosis过氧化氢转化为次氯酸盐,NETosis的诱导物(9]。次氯酸盐与过氧化氢的相互作用会导致生成单线态氧,据报道是必不可少的净形成(15]。符合luminol-amplified化学发光分析获得的结果,浓度显著抑制作用的黄酮类化合物表儿茶素和三水合芦丁和抗坏血酸和5-ASA ROS生产观察(数字3(一),3(c),3(d)3(h))。因此这些数据表明,这些抗氧化剂不仅影响MPO-derived ROS如次氯酸盐和羟基自由基也超氧化物。暴露在药物相关的浓度NAC也导致一个强大和显著减少中性粒细胞ROS生产(图3(f))。类黄酮素儿茶酸水合物有抑制作用只有在使用100的浓度μM(图3(b))。与鲁米诺的结果分析,褪黑激素也显著降低活性氧的生产方式存在剂量依赖的相关性,当使用lucigenin试验(图测量3(e))。这些结果表明,褪黑激素仅影响细胞外超氧化物,而不是内部的和细胞外MPO-derived ROS。没有抑制作用ROS生产观察照射后中性粒细胞生育酚的屁股,和尿素控制(数字3(d)和3(g))。这是使用鲁米诺与获得的结果分析,表明这些物质没有抗氧化影响过氧化物或MPO-derived ROS在我们实验设置。
ROS-detection化验,如果没有化学发光信号检测中性粒细胞治疗与抗氧化剂或与相关溶剂控制,表明所使用的测试物质没有未指明的影响分析系统(数据未显示)。
3.3。黄酮类化合物、维生素C、5-ASA和南汽抑制PMA刺激人类中性粒细胞的净释放
从化学和生物刺激中性粒细胞主要诱发NETosis ROS-dependent的方式(4,6,9,15),抗氧化剂,减少活性氧的生产也应该减少ROS-dependent净形成。只有那些抗氧化剂的浓度有显著抑制作用在内部和/或细胞外ROS被用来评估影响净释放。抗氧化剂对活性氧释放没有影响被评估的最高浓度测试的效果在网上发布。人类中性粒细胞preincubated表示物质诱导前的30分钟的净形成20 nM PMA,最好的诱导物特征ROS-dependent NETosis。净释放然后量化通过测量SYTOXgreen荧光在一段5 h。
从如果没有荧光信号检测中性粒细胞治疗抗氧化剂或溶剂控制,我们可以排除一个自发荧光或坏死或NET-inducing效应的测试物质(数据没有显示)。与黄酮类化合物表儿茶素预处理的中性粒细胞,三水水合儿茶素、芦丁和PMA刺激前显著降低净释放(图4(a))。相同的抑制性影响净形成观察抗坏血酸,南汽和5-ASA(数字4(b) +4(c))。因此,除了褪黑素,所有物质显著降低PMA-induced ROS生产也抑制PMA-induced净释放(数字4(一)-4(c))。一切物质,没有显示对活性氧的生产产生重大影响,如生育酚,尿素,和屁股,没有抑制作用在网上发布(数字4(b)和4(c))。
加强使用定量NET-assay观察结果,调频和SEM进行。净释放未经处理或antioxidant-treated中性粒细胞是可视化PMA刺激后3 - 4小时。如果中性粒细胞不接受NETosis展示一个清晰的分离细胞核染色质和颗粒/ MPO(图5)。在PMA-stimulation中性粒细胞激活,夷为平地,并释放网(图5)。网作为纤维出现,复杂的三维结构(图5(一个)大箭头和图5 (b))或云雾状外观是几倍的体积比可行的细胞来源于(图5(一个),小箭头)2]。通过为MPO和DNA免疫组织化学染色,我们可以确认网是由decondensed染色质结构包含抗菌颗粒蛋白(图5(一个))。此外,中性粒细胞,接受NETosis从可行的有很大的不同,凋亡或坏死的中性粒细胞和以更大的规模和混合细胞组件(核颗粒)(图5(一个),小箭头)2]。
(一)
(b)
微观分析证实了黄酮类化合物表儿茶素的抑制作用,儿茶酸水合物,分别和芦丁水合物净释放(图6)。少网更脆弱,更完整的中性粒细胞,观察PMA-stimulated文化接触表儿茶酸,儿茶酸水合物或三水芦丁与溶剂控制宽相比,紧凑型网(图6)。5-ASA、南汽和抗坏血酸在网上也表现出强烈的抑制作用形成。媒介控制相比,几乎没有从5-ASA -网发布,NAC -或抗坏血酸洗细胞(图6)。如果中性粒细胞治疗抗氧化剂不接受NETosis,或坏死和显示一个清晰的分离分成小叶的完整的核和颗粒蛋白(数据没有显示)。
综上所述,我们可以显示所有的抗氧化剂减少PMA-induced活性氧释放中性粒细胞能够抑制净释放,除了褪黑激素。
3.4。抗氧化剂用于这项研究不抑制脱粒,人类中性粒细胞的趋化作用和吞噬能力
除了在NETosis扮演一个角色,ROS参与其他中性粒细胞功能以及信号转导(43,44]。主要通过阻断NADPH氧化酶,ROS产生酶在中性粒细胞,中性粒细胞不仅不能产生活性氧和网4)但也显示一个受损的极化,趋化性,粘附和吞噬作用[44]。调查如果抑制活性氧的抗氧化剂——和净产量也影响其他效应机制,我们测试了这些抗氧化剂在中性粒细胞脱颗粒的影响,趋化作用,吞噬作用(见补充材料和方法)。DPI, NADPH氧化酶的抑制剂,用于完全抑制活性氧的生产。
中性粒细胞激活100 ng / mL有限合伙人和200 U /毫升干扰素或20 nM PMA结果在脱粒和一个增强颗粒膜的细胞表面表达标记CD11b(补充图2),既不治疗的细胞与DPI和任何被测试的抗氧化剂受损activation-induced脱粒(补充图2)。
迁移对趋化现象的梯度存在的抗氧化剂在transwell评估系统。使用抗氧化剂以及DPI对中性粒细胞趋化性没有抑制作用通过引发(100 ng / mL)或TNF -(100 ng / mL)作为化学引诱物(补充图3)。
中性粒细胞的吞噬作用的荧光珠被流式细胞仪检测。在刺激100 ng / mL有限合伙人和200 U /毫升干扰素和更强的20 nM PMA,中性粒细胞的吞噬能力增强(补充图4),DPI显著降低中性粒细胞的吞噬能力,以应对有限合伙人和干扰素或PMA,使用的抗氧化剂对中性粒细胞吞噬作用没有显著的影响(补充图4)。
4所示。讨论
虽然据报道,一些刺激能够引发一种ROS-independent净释放(11- - - - - -13),NETosis回应大部分是由活性氧介导的化学和生物刺激生产涉及NADPH氧化酶和MPO [3,4,22,45]。自ROS-dependent NETosis也被认为发挥不利影响自身免疫性炎症性疾病,如风湿性关节炎(16)或系统性红斑狼疮17),药物抑制ROS-dependent净形成可能对这些疾病的治疗效果。因此,在当前全面研究我们评估小组的效果与已知的抗氧化活性物质,如类黄酮、维生素、和药理上的物质形成ROS-dependent网的主要人类中性粒细胞在体外。我们可以令人信服地表明,所有的测试物质显著抑制ROS的产生也抑制网的形成。在这些黄酮类化合物表儿茶素、儿茶酸水合物和三水芦丁,维生素C(抗坏血酸)和5-aminosalicylic酸和物质N-acetyl-L-cysteine。其他效应机制,如脱粒,趋化性,和吞噬作用,并不影响这些抗氧化剂。
测试物质的抗氧化效果与清除活性氧的能力,如超氧化物()、羟基自由基(),或次氯酸盐(OCl−)和/或由于直接抑制作用ROS产生酶NADPH氧化酶或MPO等。描述了类黄酮作为氮的食腐动物,活性氧,氯物种,超氧化物阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢自由基,次氯酸,过氧化氢46- - - - - -48),和MPO的抑制剂24)和NADPH氧化酶(49,50]。观察到的抑制作用的黄酮类化合物表儿茶酸和儿茶酸水合物超氧化物和/或MPO-dependent ROS OCl可以清除活动有关−(48]对NADPH氧化酶的抑制作用以及他们的易位和细胞内ROS生产中性粒细胞(50]。此外,表儿茶素可以与过氧化氢的化合物I和II MPO,导致呼吸困难的过氧化氢epicatechin-driven MPO的过氧化反应周期(39]。因此,表儿茶素的浓度显著的抑制效应MPO-specific ROS的鲁米诺试验可能不仅由于其清除活动,而且由于其抑制MPO活性。MPO-dependent ROS和羟基自由基以及NADPH氧化酶和MPO活性是必不可少的ROS依赖NETosis [3- - - - - -9),我们表明,类黄酮水合儿茶素和表儿茶素通过抑制NETosis OCl的清除活性−和监管功能ROS产生酶,特别是在MPO。在动物肠道炎症模型的抗氧化活性和降低中性粒细胞浸润能力最近被证实了的在活的有机体内系统,表明类黄酮表儿茶素可以用于预防和治疗肠道炎症51]。
三水芦丁,超氧化物的清道夫52),是类黄酮糖苷的槲皮素,可以绑定到一个疏水区域的远端血红素口袋MPO导致MPO的抑制和减少MPO-dependent ROS (24]。绑定和抑制作用的黄酮类化合物MPO、C2 C3双绑定和羟基3、5和4′位置是必需的。三水芦丁满足这些结构性需求除了羟基在C3。在我们的研究中,三水芦丁,显著抑制了ROS-dependent净形成。当我们观察到三水芸香苷的抗氧化效果超氧化物存在剂量依赖的相关性,以lucigenin化验,MPO-dependent ROS,以鲁米诺试验(26,30.],我们可以推测,ROS和三水NET-reducing芦丁的影响不仅是由于它能够清除超氧化物(52但也由于MPO的抑制作用。
维生素C(抗坏血酸)和维生素E (生育酚)是至关重要的抗氧化微量元素在人类生物功能的多样性。ROS的食腐动物,他们有能力抵御氧化损伤蛋白质,脂类、核苷酸和提出了防止细胞损伤(53,54]。数据有关抗坏血酸盐对中性粒细胞生成活性氧的影响是有争议的;两个prooxidant [55和抗氧化作用56)已被描述。旁边一个抗氧化清除活动对次氯酸[57,58),抗坏血酸矛盾已报道施加刺激影响氯化MPO的活性,导致增强活性氧产量(58,59]。行动的方式取决于抗坏血酸的浓度。在低浓度微摩尔的MPO活性催化刺激影响,同时它作为活性氧清除剂在较高的浓度58]。在我们目前的研究中,我们使用了抗坏血酸在毫克分子的浓度,我们可以观察到显著抑制抗坏血酸对中性粒细胞生成活性氧的影响通过使用lucigenin——和luminol-amplified化学发光测定。因此,我们的数据表明,抗坏血酸作为对超氧化物和清道夫以及MPO-dependent OCl−。因为这些ROS已知能够调节净释放(4,9),也就不足为奇了抗坏血酸的抗氧化清除活动导致减少净释放。减少净形成由抗坏血酸单钠尿酸盐中描述最近还应对(21]。因此,维生素C,在它作为活性氧清除剂的浓度,可能对中性粒细胞/ NET-associated疾病治疗效果。支持这一假设的研究辅助治疗的患者与维生素C ANCA-associated血管炎导致减少过氧化物生产中性粒细胞(60]。最近的直接抑制作用抗坏血酸(毫克分子浓度高50 - 200毫米)MPO中所示是一种无细胞系统(61年),我们不能排除,抑制ROS和渔网的抗坏血酸在我们的实验环境只是由其清除活性。
虽然维生素E (α生育酚)被描述为一个chain-braking抗氧化剂,防止脂质过氧化作用通过抑制蛋白激酶C (PKC)的影响和NADPH氧化酶以及通过对过氧化氢自由基的清除活性(62年在中性粒细胞),其抗氧化效果是有争议的。虽然一些研究报道抗氧化维生素E对超氧化物阴离子的影响生产通过抑制PKC和NADPH氧化酶在中性粒细胞(40,56),没有影响被观察到neutrophil-produced ROS在生理刺激反应(56]。在我们目前的研究中我们也观察到氧化的影响α生育酚PMA-stimulated ROS也在网上发布的人类中性粒细胞。在与维生素C,维生素E,无法抑制MPO活性(61年),这并不奇怪,我们不能观察的抑制作用MPO-dependent ROS的鲁米诺化验。因为MPO活性和MPO-dependent ROS NETosis至关重要,这并不奇怪,我们观察到NETosis[没有抑制作用4,6,45]。的解释明显缺乏影响过氧化物生产可以合成生育酚我们使用,其中包含平等的八个不同的立体异构体的混合物(RSR,存款准备金率RRS, RSS, SRR SSR, SRS, SSS) (53]。虽然他们都有抗氧化活动,生育酚2 r-configuration有很强的生物活性,满足人类维生素E的要求(53]。由于这个,因为PMA在这项研究中的应用是一个强大的合成诱导的活性氧和渔网,的活动α生育酚用于这项研究可能不够有效抑制PMA-induced ROS和渔网。
5-Aminosaylicylic酸(5-ASA)是一种细胞渗透抗炎药用于治疗炎症性肠道疾病,如溃疡性结肠炎和克罗恩病(63年]。这些疾病的特点是外渗和大量嗜中性粒细胞的浸润到固有层,导致受伤和上皮细胞损伤特别是合成和释放活性氧的中性粒细胞(64年]。虽然还没有清楚地描述了,一个人可以推测,网也可能在炎性肠道疾病的发病机制中发挥作用。这个假说是强调示范的细胞外DNA大肠组织从患者患有细菌性胃肠感染和克罗恩病(65年)和净释放反应的激活长pentraxin 3 (PTX3) [66年,67年]。5-ASA是一种有效的清道夫neutrophil-derived ROS如超氧化物阴离子、羟基自由基、单线态氧,氨基氯化物,尤其是次氯酸盐(25,36,68年,69年]。讨论了MPO controversly 5-ASA效果。在无细胞系统的直接抑制作用5-ASA MPO被描述(70年),而其他人则发现,抑制中性粒细胞产生活性氧的5-ASA没有关联的耗氧量降低在体外(71年),这表明行动的模式是活性氧的清除,而不是酶抑制。因此,目前尚不清楚5-ASA,除了清除ROS,还能抑制ROS-producing酶在体外。在大多数在体外和在活的有机体内研究抗炎活性5-ASA建议与清除活动而不是由于酶抑制69年]。在我们目前的研究中,我们观察到5-ASA超氧化物和的抑制作用以及MPO-derived OCl−第一次在网上形成。尽管我们不能排除这种可能性,直接抑制作用MPO有助于抑制ROS和网,与文学,我们假设在协议的清除活动5-ASA ROS介导抗炎效应和网(72年]。因此我们的研究结果支持视图5-ASA neutrophil-mediated疾病的治疗效果。
药理的物质N乙酰半胱氨酸(NAC)我们观察到,与先前的研究[9,22抑制作用),PMA-induced ROS和净生产。这些结果,除了观察抗炎NAC对慢性阻塞性肺病患者中性粒细胞的影响(73年),建议广泛抑制作用的NAC ROS-mediated嗜中性粒细胞的功能。作为thiol-containing分子NAC对ROS证据确凿的抗氧化性能,如H2O2和HOCl在体外和在活的有机体内(57,74年- - - - - -77年]。此外,在其直接抗氧化作用作为自由基清除剂,南京有一个间接的抗氧化作用的药物前体gluthathion保持/提高了减少谷胱甘肽的生物合成(谷胱甘肽),主要抗氧化剂在细胞的胞浆水78年]。南汽的直接互动与化合物I和II MPO的显示在体外(75年,79年]。然而,在生理条件下没有形成化合物II可以观察到的75年)和南汽负净电荷的阻碍与带负电荷的MPO交互(79年)理论支持这一事实硫醇/南汽不采取行动的抑制MPO / H2O2/ Cl−由简单的活性氧清除系统,但,尤其是HOCl [75年,79年]。自从次氯酸的酸是重要的球员ROS-dependent NETosis [9),我们建议NAC抑制净释放通过这些活性氧的清除。
虽然乙酰水杨酸的直接抑制作用(屁股)毫克分子浓度在中性粒细胞NADPH氧化酶被描述80年],屁股的抗氧化活性是建议是基于清除ROS但衰减ROS生成(81年]。屁股是一个强有力的清道夫MPO-derived羟基自由基/次氯酸[81年,82年和不重要和过氧化物反应81年我们预计MPO-dependent ROS和净生产的抑制作用。令人惊讶的是我们不能观察到显著的抑制效应的屁股在ROS和净生产人类中性粒细胞浓度达到1毫米。这些发现与最近发表的在体外研究人类中性粒细胞,屁股PMA的抑制作用和肿瘤坏死因子观察全身网只有在高浓度的5毫米,但不是为1毫米(19]。事实上,大多数研究分析抗氧化活动使用的屁股毫克分子浓度(80年- - - - - -82年]。我们使用PMA,强烈的ROS合成诱导物和净生产,可以推测,屁股的抗氧化活性浓度达到1毫米不足以表现出抑制作用。通过使用生理TLR配体酵母聚糖作为兴奋剂,在先前研究中抗氧化效果的屁股ROS生产由人类中性粒细胞是证明(26]。
荷尔蒙褪黑激素的抗氧化效果与羟基自由基等活性氧的清除活动(41,83年,84年)也是一个强有力的抑制作用的催化活性MPO [85年]。2毫米褪黑激素的抑制作用PMA刺激细胞内ROS被描述为人类中性粒细胞(41]。在我们的实验设置我们可以观察褪黑素对中性粒细胞减少细胞外超氧化物,但没有抑制作用的褪黑激素MPO-dependent ROS和净形成。缺乏减少MPO-dependent ROS可能有各种原因。首先,它是表明褪黑素溶解在乙醇抑制luminol-detected发光的影响小于水褪黑激素(86年]。此外,所有最近的研究关于褪黑激素对MPO和/或活性氧的影响进行了在不同的实验设置,包括不同检测方法和细胞ROS免费系统(41,86年]。褪黑激素的抑制作用超氧化物,但不是MPO-dependent ROS在我们的实验环境中,似乎还没有强大到足以抑制网的形成。这些结果支持这一发现MPO和MPO-dependent内部细胞外ROS球员NETosis[至关重要4,45]。
尿素没有清除能力和没有影响ROS-mediated信号通路。因此,它被用作消极的控制。因此,缺乏对活性氧的形成和净影响的形成并不奇怪。
5。结论
在这项研究中,我们已经表明,广泛的抗氧化物质显著抑制活性氧的释放主要人类中性粒细胞也抑制ROS-dependent网的形成,表明两种现象之间存在明确的相关性。测试物质的抑制作用与清除活性氧的能力超氧化物、羟基自由基、次氯酸盐和/或由于直接抑制作用ROS产生酶NADPH氧化酶或MPO等。三水儿茶素类黄酮的水合物、表儿茶素、芦丁、药理物质5-ASA,我们首次提供证据关于他们对网络形成的抑制作用。治疗这些物质可能被视为neutrophil-mediates疾病的治疗策略,ROS和/或ROS-dependent NETosis在发病机制中发挥作用。
缩写
| OCl−: | 次氯酸盐 |
| : | 羟基自由基 |
| : | 过氧化物 |
| 5-ASA: | 5-Aminosalicylic酸 |
| 驴: | 乙酰水杨酸 |
| AUC: | 曲线下的面积 |
| DPI: | Diphenyleniodiniumchlorid |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| EtOH: | 乙醇 |
| FM: | 荧光显微镜 |
| HOCl: | 次氯酸 |
| 地中海。 | 媒介 |
| MPO: | 髓过氧物酶 |
| 南京: | N-acetyl-L-cysteine |
| 网: | 中性粒细胞胞外陷阱 |
| PMA: | 十四烷酸佛波醇酯 |
| ROS: | 活性氧 |
| 扫描电镜: | 扫描电子显微镜 |
| 求解: | 溶剂。 |
作者的贡献
Tamas Laskay和玛蒂娜Behnen同样起到了推波助澜的作用。
确认
这项工作是支持的吕贝克大学授予e14灯头- 2010“Mechanismen冯humanen中性粒细胞胞外陷阱(网)”和重点项目“自身免疫”。作者感谢Orun克里斯托研究所的解剖学、吕贝克大学技术援助。本文提出了部分在德国北部免疫学家35研讨会,Borstel,德国,11月23日,2012年,在第47届年度科学会议的欧洲社会的临床调查,Albufeira,葡萄牙,2013年4月17日。
补充材料
图S1。抗氧化剂用于这项研究不是有毒,不诱导细胞凋亡中性粒细胞。
图S2。抗氧化治疗不抑制activation-induced人类中性粒细胞的脱粒。
图S3。抗氧化治疗不抑制人类中性粒细胞的趋化迁移。
图S4。DPI但不抗氧化治疗可以减少人类中性粒细胞吞噬活动的刺激。