文摘

骨骨髓来源间充质干细胞(bmMSCs)是最重要的细胞来源干细胞移植疗法。msc的迁移能力的决定因素之一MSC-based移植治疗的效率。我们最近的研究表明,低浓度的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可以刺激bmMSCs扩散。在这项研究中,我们调查了ox-LDL bmMSC迁移和附着力的影响,以及相关机制。我们的结果表明,轮回bmMSCs率,和bmMSCs和单核细胞之间的粘附与ox-LDL明显增加了治疗剂量和时间的方式。的表情ICAM-1、PECAM-1 VCAM-1以及细胞内钙的水平^{2 +}也明显增加了ox-LDL剂量依赖性的方式。细胞骨架分析表明,ox-LDL治疗好处扩散bmMSCs和组织的f -肌动蛋白纤维镀后6小时。更有趣的是,治疗与ox-LDL LOX-1表达式也明显增加,MCP-1, TGF -β;然而,LOX-1抗体和MCP-1成分显著抑制ox-LDL-induced bmMSCs的迁移和附着力,这表明ox-LDL-induced bmMSC迁移和粘附依赖LOX-1激活和MCP-1表达式。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是多能祖细胞,可以分化成多种类型的细胞,包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞、神经细胞暴露在适当的条件下(1,2]。骨髓衍生msc (bmMSCs)是使用最广泛的msc在组织再生医学。据报道,bmMSC移植疗效,各种各样的疾病,如阿尔茨海默氏症,心脏梗塞、中风,和风湿性关节炎(3- - - - - -6]。bmMSCs的迁移能力是最重要的行列式bmMSC移植治疗的效率。已经表明,少于1.5% bmMSCs冠脉内注射后可以达到受伤的组织(7]。移植后的归巢率低bmMSCs严重限制了其临床应用。bmMSC移植治疗的另一个限制是穷人的可行性bmMSCs移植后(8]。细胞粘附是移植bmMSCs生存的先决条件,也是负责bmMSC迁移(8- - - - - -10]。

细胞内钙^{2 +}是一种细胞粘附和迁移的重要调节器。细胞内钙的增加^{2 +}需要integrin-mediated细胞粘附[11,12]。细胞内钙^{2 +}还参与调节细胞骨架组织(13]。细胞骨架的动态重排需要细胞粘附和迁移。Ox-LDL是一种重要的炎症和细胞粘附刺激器。以前的研究已经表明ox-LDL诱导单核细胞和平滑肌细胞的迁移14]。我们组最近的一项研究显示,LOX-1 ox-LDL的受体,是bmMSCs中高度表达,其激活bmMSCs [ox-LDL刺激增殖的1]。实际上,LOX-1本身也作为炎症和粘附分子,并参与白细胞的迁移15]。

单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)是一种重要的监管机构的起源急性和慢性炎症。它扮演了一个关键的角色在单核细胞活化和招聘受伤的网站。以前的研究已经表明MCP-1介导单核细胞的轮回和THP-1细胞(16]。据报道,通过激活ox-LDL LOX-1增强MCP-1表达培养的软骨细胞,血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞(17- - - - - -21]。的ox-LDL-mediated MCP-1 upregulation参与内皮细胞粘附分子的表达(19,20.]。ox-LDL是否会影响bmMSC迁移和附着力和MCP-1表达式bmMSCs还没有检查。在目前的研究中,我们调查了ox-LDL bmMSC迁移和附着力的影响,以及其可能的机制。

2。材料和方法

2.1。材料

Ox-LDL和Dil-ox-LDL从生物医学技术,购买公司(美国马斯托顿)。Fluo-3 / AM、罗丹明phalloidin Lipofectamine第装备,RNeasy Mini-Kit,上标2 1 st-strand DNA合成装备和细胞追踪得到从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。LOX-1和MCP-1抗体购自Abcam(美国Cambridge, MA);TGF -β,PECAM-1 ICAM-1 VCAM-1,β肌动蛋白抗体购自圣克鲁斯生物技术,(美国圣克鲁斯,CA)。MCP-1 shRNA装备购买从OriGene技术(美国马里兰州罗克维尔市)。发射极耦合逻辑免疫印迹基质是购自热科学(美国罗克福德,IL)。PVDF膜购买从通用电气医疗集团(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。

2.2。隔离和bmMSCs文化

分离、培养BmMSCs如前所述[1]。(C57BL / 6 j小鼠,8周)被颈椎错位。动物在70%乙醇冲洗20秒钟尸体消毒,然后收集的四肢手术在冰上DMEM培养基。清洗后的肌肉,胫骨和股骨骨髓腔的两端下方。骨髓是使用DMEM培养基中揪出了一个10毫升注射器25针和收集15毫升管在冰上。离心后,骨髓被多次移液悬浮在DMEM和70毫米滤网过滤去除骨骨针和细胞团。细胞密度的计算是在显微镜下细胞计数。然后,这些细胞被镀成100毫米培养皿10×10的密度⁶/毫升与15%的边后卫,完全DMEM培养基2毫米谷酰胺,100μ青霉素g和100μg链霉素,他们培养的3 h。3 h后,不依从细胞被移除,新的媒介所取代。此后,媒介是每2天更换一次。后可获得纯化bmMSCs人口三星期的文化时期。

2.3。Dil-ox-LDL吸收测量

主和3 rd-passage bmMSCs镀在24-well盘子和孵化与5μ在黑暗中g / mL Dil-ox-LDL在37°C为30分钟。然后,细胞与PBS轻轻洗3次,他们用荧光显微镜成像。

2.4。Transwell迁移分析

在这项研究中,迁移bmMSCs测量使用Transwell板块(美国康宁合演)8μ米孔隙过滤器。总之,人类脐静脉内皮细胞播种(通过传代形成细胞的上部插入Transwell室(4×10⁴细胞/),他们培养24小时。BmMSCs服用0、5、10和20μg / mL ox-LDL 6 h或处理10μg / mL ox-LDL 0、3、6和12 h,然后他们用PBS。洗细胞(1×10⁵)镀上HUVECs Transwell上插入的盘子。coculture 6 h后,迁移的数量bmMSCs被数较低的一侧的过滤器。

2.5。细胞粘附试验

BmMSCs镀在12-well盘子。单核细胞与细胞追踪黑暗preincubated 37°C和PBS为30分钟,洗3次。bmMSCs近80%汇合的时,他们孵化与0,5、10和20μg / mL ox-LDL 6 h。然后,predyed单核细胞(2×10⁴)被播种到bmMSCs(用PBS)和在黑暗中coincubated 30分钟。然后,细胞与PBS轻轻洗3次,随机用荧光显微镜成像。

2.6。rt - pcr分析

在这项研究中,在bmMSCs LOX-1表达式是通过rt - pcr分析来衡量的。总之,总RNA隔绝bmMSCs使用RNeasy Mini-Kits根据装备的指令;1μ应用g RNA合成cDNA上标2 1 st-strand DNA合成板。使用20 PCR试验进行μL反应体积包含100 ng cDNA、10μL 2×PCR反应混合物,0.5μ引物。产品1.5%琼脂糖凝胶电泳分离和可视化的溴化乙锭紫外线透照器。LOX-1的引物如下:转发:5′-GAGCTGCAAACTTTTCAGG-3′,相反:5′-CTCTTTCATGCGGCAACAG-3′;的引物β肌动蛋白是以下:转发:5′-TTCTTTGCAGCCCTTCGTTGCCG-3′,逆转:5′-TGGATGGCTACGTACATGGCTGGG-3′。

2.7。免疫印迹分析

蛋白质提取bmMSCs和12% sds - page分离。电泳后,蛋白质被转移到PVDF膜。5% BSA的膜被封锁或5%无脂肪牛奶在TBS-T(根据制造商的说明),然后他们孵化与LOX-1 MCP-1 TGF -β,VCAM-1 ICAM-1 PECAM-1,β肌动蛋白抗体(1:2000)主要在一夜之间在4°C。然后,墨迹都孵化HRP-conjugated二级抗体(1:10000)在室温下1 h。通过增强化学发光免疫反应性的乐队是可视化。

2.8。免疫荧光染色

疣状进行了使用标准的协议。总之,bmMSCs生长在10毫米轮盖玻片处理0,5、10和20μg / mL ox-LDL 6 h。然后,细胞被固定为4%缓冲为15分钟,用0.1%多聚甲醛Triton x - 100在室温下10分钟。然后,细胞被封锁的1% BSA 1 h和孵化的兔子anti-mouse ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1抗体(1:200)在室温下1 h。与PBS洗涤后,这些细胞被孵化与TR -或FITC-conjugated鸭anti-rabbit二级抗体(1:1000)在黑暗中。洗涤后,细胞被安装在幻灯片使用ProlongH黄金不变色试剂与DAPI荧光显微镜成像。荧光ICAM-1密度、VCAM-1 PECAM-1测量使用图像J 1.34软件在一些随机的字段。从100个细胞的平均荧光密度计算每个样本。

2.9。Flowcytometry化验

在这项研究中,细胞内Ca^{2 +}测量了bmMSCs flowcytometry化验。简而言之,bmMSCs镀在6-well盘子和处理0,5、10和20μg / mL ox-LDL 6 h。然后,细胞被装满5μ米Fluo-3 / AM和黑暗孵化为30分钟37°C。PBS的细胞被收集和洗3次。500年洗细胞resuspendedμL flowcytometer PBS和分析。

2.10。细胞骨架的分析

BmMSCs镀在24-well盘子和立即暴露于ox-LDL。6小时曝光后,细胞使用缓冲4%甲醛固定,治疗0.1% triton - x - 100,然后贴上2 u罗丹明phalloidin 30分钟在黑暗中。洗3次后,荧光成像与laser-inverted共焦显微镜。

2.11。MCP-1成分

BmMSCs被镀在6-well或12-well盘子。当细胞达到80%融合,shRNA使用Lipofectamine执行2000年Opti-MEM介质和CCL2 (MCP-1) shRNA工具包包括CCL2 shRNA工器和无效29-mer炒shRNA根据设备的指令。

2.12。统计分析

用SPSS 11.5软件进行统计分析。数据提出了均值±标准差(SD)。单变量的比较方法是使用适当的学生的评估测试和/或单向方差分析与图基的事后调整多个比较;被认为是一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。Dil-ox-LDL吸收和LOX-1表达主要和3 rd-passage bmMSCs

在最近的一项研究中,我们发现bmMSCs的特点,发现的主要占用ox-LDL bmMSCs有潜力和高表达LOX-1受体(1]。在目前的研究中,我们观察到通道(第三段)占用ox-LDL bmMSCs有相同的潜力和表达与主bmMSCs LOX-1受体(图1)。

3.2。Ox-LDL刺激轮回bmMSCs的剂量和时间的方式

的迁移能力bmMSCs使用Transwell测量系统。如图2(一个),ox-LDL剂量的5 ~ 20μg / mL显著增加轮回bmMSCs (以剂量依赖性的方式)。从轮回的初步数据bmMSCs接触后5 ~ 20μ10 g / mL ox-LDL,我们看到μg / mL ox-LDL接触细胞轮回的中等水平的增加引起的。所以,10μg / mL ox-LDL bmMSCs轮回选择学习时间。当暴露于10μg / mL ox-LDL, bmMSCs也表现出时间的方式增加轮回(图2 (b))。

3.3。Ox-LDL增强bmMSC粘附能力和粘附分子的表达

众所周知,细胞粘附细胞轮回,是一个关键因素和细胞迁移的能力依赖于表达粘附分子(22]。在这项研究中,bmMSCs粘附能力是衡量评估信息bmMSCs和单核细胞之间的粘附。如数据所示2 (c)- - - - - -2 (f)单核细胞的数量,坚持bmMSCs(使用μg / mL ox-LDL)显著(与ox-LDL)增加了治疗剂量依赖性的方式。当bmMSCs暴露在10μg / mL ox-LDL,坚持单核细胞的数量也显著增加(时间的方式)。

信息的附着力取决于表达粘附分子。我们的结果表明,表达粘附分子ICAM-1, PECAM-1, VCAM-1 bmMSCs显著增加()通过感应ox-LDL剂量依赖性的方式(图3)。

3.4。Ox-LDL增加细胞内钙^{2 +}

细胞内钙^{2 +}是一个重要的监管机构的细胞迁移。据报道,ox-LDL引起细胞内钙增加^{2 +}在其他细胞谱系,如内皮细胞和平滑肌细胞(23,24]。在目前的研究中,我们还发现,ox-LDL (5 ~ 20μg / mL)引起细胞内钙增加^{2 +}在bmMSCs剂量依赖性的方式(图4)。

3.5。在bmMSCs Ox-LDL介导的细胞骨架重组

细胞骨架已经知道调节细胞迁移和附着力25]。在这项研究中,细胞骨架组织研究了染色使用罗丹明phalloidin f -肌动蛋白。与对照组相比,bmMSCs对待ox-LDL最好传播和丝(图构成的综合网络5)。

3.6。MCP-1 Ox-LDL LOX-1的诱导表达,TGF -β

我们之前的研究表明,ox-LDL刺激LOX-1表达bmMSCs [1]。按照先前的研究中,我们观察到在这项研究中,ox-LDL (5 ~ 20μg / mL)诱发LOX-1表达式在剂量依赖性的方式(图6(一))。此外,ox-LDL也增加MCP-1和TGF -β表达式在bmMSCs剂量依赖性的方式(数字6 (b)和6 (c))。

更重要的是,预处理与LOX-1抗体抑制ox-LDL-induced MCP-1表达式(图6 (d)),细胞迁移(图6 (e)),粘附(图6 (f)),并表达ICAM-1(图6 (g))、PECAM-1和VCAM-1(数据没有显示)。这些数据表明,ox-LDL-induced粘附和迁移LOX-1 bmMSCs至少部分通过激活的受体。

3.7。MCP-1击倒抑制Ox-LDL-Induced细胞迁移和附着力

进一步调查的角色在ox-LDL-induced MCP-1 bmMSC迁移和附着力,我们在bmMSCs表现MCP-1成分。如图6 (h)无效的,与之相比,转染煎成分,MCP-1成分明显会使MCP-1 bmMSCs表达式()。更有趣的是,MCP-1击倒也显著减少ox-LDL-induced bmMSC轮回和粘附,以及粘附分子的表达(数字6(我)- - - - - -6 (k);)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查的影响,首次ox-LDL bmMSCs迁移和附着力。我们发现治疗ox-LDL提高bmMSCs的迁移和粘附能力。我们还观察到治疗ox-LDL增加细胞内钙^{2 +}和表达的LOX-1 MCP-1, TGF -β,它促进细胞骨架重组。更重要的是,使用LOX-1抗体和击倒的MCP-1显著抑制ox-LDL-induced bmMSC迁移和粘附,以及粘附分子的表达。这些发现表明,ox-LDL能促进bmMSCs迁移,这是依赖LOX-1激活和MCP-1表达式。

bmMSCs的迁移能力是最重要的决定因素之一bmMSC-based移植治疗的效率。据报道,通过静脉注射bmMSCs有一个稳定的能力回到骨髓和家庭迁移到受伤的器官通过跨内皮迁移(26]。但是,注入的归巢率bmMSCs受伤的组织非常低(< 1.5%)7]。归巢率低的bmMSCs将严重影响其治疗移植治疗的效率。因此,有必要找到更有效的方法来刺激bmMSCs迁移。据报道,ox-LDL可以诱发炎症分子的生产(MCP-1、il - 6和胶粘剂分子),随后促进巨噬细胞和内皮细胞迁移27- - - - - -29日]。

细胞粘附是轮回的先决条件的循环细胞。通过静脉注射的第一步bmMSCs受伤的器官是坚持内皮和克服内皮屏障。稳定细胞粘附影响细胞骨架重组和肌动蛋白聚合,促进细胞突出物,导致定向细胞运动(30.]。所以,表达粘附分子对细胞迁移是至关重要的。据报道,需要PECAM-1 TNF -α全身的白细胞的轮回31日]。使用PECAM-1抗体可以抑制白细胞的迁移31日]。此外,信息附着力也生存所需的移植bmMSCs靶器官或组织。在目前的研究中,我们发现,低浓度(5 ~ 20μox-LDL g / mL)的潜在刺激bmMSC迁移和附着力和调解的表达粘附分子(ICAM-1、PECAM-1和VCAM-1)。

钙离子(Ca^{2 +})是一个非常重要的细胞第二信使,在信号转导和细胞生理学中起着重要的作用。大量的研究表明,细胞内Ca^{2 +}调节细胞粘附和迁移。细胞内钙的增加^{2 +}是与增加附着力的淋巴细胞,红细胞,巨噬细胞和癌症细胞(32- - - - - -35]。增加细胞内钙^{2 +}也会导致upregulation胶粘剂分子如ICAM-1 PECAM-1, VCAM-1, E-selectin [36- - - - - -39]。此外,粘附分子的表达也传播所需的钙(37,39]。在这项研究中,我们还注意到,ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1与增加细胞内钙^{2 +}在bmMSCs。Cook-Mills等人的研究表明,细胞内钙的反应^{2 +}VCAM-1刺激依赖NADPH氧化酶的活化内皮细胞(39]。毫不奇怪,NADPH氧化酶的强烈刺激,ox-LDL可以增加粘附分子的表达和细胞内钙^{2 +}在bmMSCs。Ca治疗^{2 +}或Ca^{2 +}离子载体A23187也观察到刺激平滑肌细胞的迁移;和使用Ca^{2 +}条目阻滞剂nicardipine抑制细胞迁移的细胞(40]。calcium-mediated细胞迁移是依赖于它的作用在调节细胞骨架重排(36]。众所周知,细胞骨架的动态组织是细胞迁移的先决条件。在目前的研究中,治疗ox-LDL促进bmMSC传播和组织的f -肌动蛋白纤维。以前的研究报道,ox-LDL的调节肌动蛋白组织参与激活ρgtpase和PI3K / Akt通路41]。然而,一些其他的研究报道,高浓度的ox-LDL (100μg / mL)造成混乱的平滑肌细胞的细胞骨架和死亡42]。在我们的其他正在进行的研究中,我们还观察到高浓度的ox-LDL(> 40岁μg / mL)毒性bmMSCs bmMSCs并导致细胞凋亡。

据报道,ox-LDL通过激活的受体LOX-1刺激细胞迁移。我们最近的研究表明,主bmMSCs LOX-1高度表达。在目前的研究中,我们还发现,LOX-1高度通道中表达bmMSCs。更有趣的是,封锁LOX-1使用LOX-1抗体显著抑制ox-LDL-induced MCP-1表达、细胞粘附和迁移bmMSCs。这表明ox-LDL-induced bmMSC迁移是通过激活LOX-1至少部分。

MCP-1是炎症的一个重要调节器事件。之前的研究表明,通过激活ox-LDL LOX-1增强MCP-1表现在许多细胞谱系等人关节软骨细胞,血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞(17- - - - - -21]。治疗外源性重组MCP-1或增加内源性MCP-1表达可以诱导transendothelial迁移的T细胞,单核细胞,平滑肌细胞和成年神经干细胞(43- - - - - -45]。TGF -β细胞迁移是另一个重要因素。TGF -β刺激细胞迁移通过调节MCP-1表达式(44,46]。在目前的研究中,我们还发现,ox-LDL刺激MCP-1和TGF -β表达bmMSCs剂量依赖性的方式。更重要的是,击倒MCP-1表达显著抑制ox-LDL-induced bmMSC轮回,信息粘连和粘附分子的表达。这些数据表明,炎症因子MCP-1扮演着一个重要的角色在ox-LDL-induced bmMSC迁移和附着力。

5。结论

在这项研究中,我们调查了ox-LDL bmMSC迁移和附着力的影响。我们的结果表明,ox-LDL增强bmMSCs轮回和粘附能力,这是由LOX-1激活和MPC-1表达式。封锁LOX-1受体使用抗体明显减少ox-LDL-induced MCP-1表达和抑制bmMSC轮回和附着力。更重要的是,MCP-1击倒也显著抑制ox-LDL-induced bmMSC轮回和细胞粘附。这些发现表明MCP-1扮演着一个重要的角色在ox-LDL-mediated bmMSCs的迁移和附着力。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

张f和c·王同样贡献了这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金的资助中国没有。31000475)和格兰特河南省科学技术基金会(没有。122101310100)。