文摘

近年来,利益结合的探索肿瘤坏死因子receptor-associated因子4 (TRAF4)和TRAF6免疫细胞和转基因老鼠的出现。虽然已经发现,TRAF4和TRAF6共享相同的TRAF绑定网站,全面研究TRAF4和TRAF6炎症性肠病(IBD)仍然缺乏。本文展示了相似和不同的表达模式TRAF4和TRAF6 IBD患者。结果表明,TRAF4和TRAF6在IBD。TRAF4和TRAF6 IBD的发病机制中起着不同的作用。此外,TRAF4内窥镜疾病活动的可能是一个指标的加州大学和TRAF6 preactivation可以检测到noninflamed结肠段。

1。介绍

肿瘤坏死因子receptor-associated因素(TRAFs)作为适配器分子控制信号通路,如核转录因子(NF -κBκB), interleukin-1受体(IL-1R), toll样受体(TLR)和转化生长因子-β(TGF -β)[1,2]。很长一段时间,TRAF6显示保存功能激活自身免疫和炎症。重要的是,TRAF6有助于CD40-mediated激活NF -κB和c-Jun激酶(物)。协会与CD40 TRAF6 CD40-mediated il - 6表达[至关重要3),这就可以解释的要求膜结合CD40配体诱导il - 6生产由免疫细胞(4]。生存、调节和激活免疫细胞和上皮细胞,通过细胞表面受体激活信号NF -κB和增殖蛋白激酶(MAPKs)通过TRAF6至关重要规定免疫反应(5]。与TRAF6 TRAF4在多个信号通路的分子机制触发TNFR-related蛋白质仍是神秘的。此外,亚细胞定位和功能TRAF4多年来一直有争议。它已经表明,TRAF4增强NF -κB通过激素性TNFR激活(GITR)表情T细胞,B细胞,巨噬细胞(6]。作为一个独特的TRAF家庭成员由TNF介导信号转导,IL-1R,或TLR,发现TRAF4作为骨形成蛋白(BMP)的积极效应和TGF -β信号通路(7]。

肠道上皮细胞和肠道免疫细胞建立活跃的站点的免疫反应性。分解体内平衡肠道菌群与粘膜免疫系统之间,与环境和遗传因素,导致炎症性肠病(IBD)。NF -κB和TLR视为节点点免疫反应的抑制和/或招聘在炎症性肠病(8]。有趣的是,尽管在IBD TRAFs机制尚未充分研究,TRAF-related TGF -炎症介质β或CD40在一系列细胞功能扮演关键角色在炎症性肠病(9,10]。

最近的研究在免疫细胞和转基因老鼠的角色TRAF4和TRAF6透露,他们共享相同的结合位点,然而TRAF4和TRAF6 IBD的全面研究仍缺乏(11]。基于假设TRAF4临床前和TRAF6可能被激活或内窥镜激活IBD患者,我们试图衡量TRAF4和TRAF6表情在IBD患者探索其潜在的作用。

2。材料和方法

2.1。病人和样品

根据临床和内窥镜诊断患者登记。怀孕,患者结直肠切除术为加州大学、疾病只涉及到小肠,可怜的肠道准备的可见区域肠道粘膜< 90%,或使用类固醇、免疫抑制剂或英夫利昔单抗在结肠镜检查前抽样被排除在外。没有诊断改变后至少3个月的跟踪。内窥镜分数是评估使用简化的内窥镜在克罗恩病(SES-CD)或男爵分数CD或UC患者,分别。健康对照组中没有迹象或肠道疾病的症状。

人类肠活检和收集血液样本在胃肠病学和肝脏病学部门,上海交通大学医学院瑞金医院的根据,研究伦理委员会的指导方针的瑞金医院,上海交通大学医学院。所有患者和健康对照组同意提供书面同意。

人体组织标本取自从宏观的结肠发炎和non-inflamed地区。活检的结肠健康的捐赠者也进行了分析。组织标本放入液氮后10分钟内活检对蛋白质提取或保存在RNAlater(试剂盒)RNA隔离。人类外周血分离成等离子体和外周血单核细胞(PBMCs)。等离子体是获得使用商业EDTA-treated管(广东省江门市医疗技术有限公司)和PBMCs孤立根据Lymphoprep (Axis-Shield PoC,挪威)协议。简而言之,稀释血液功能/ 3毫升Lymphoprep和离心机在800 g×20分钟。PBMCs被从一个独特的乐队在样品离心后的界面。然后,PBMCs被保存在RNAlater(试剂盒)RNA隔离根据制造商的协议。

2.2。酶联免疫吸附试验(ELISA)

等离子体得到了全血离心后15分钟在2000×g。样本储存在−80°C之前,通过Elisa分析。样品使用工具对TRAF4和TRAF6进行了分析,根据制造商的规格(Lanji生化和诊断、上海、中国)和微量滴定板阅读器是用于读取吸光度在450海里。实验进行了一式三份。

2.3。RNA隔离,互补脱氧核糖核酸的合成,实时PCR

总RNA PBMCs和组织样本分离试剂盒试剂(Ambion)根据制造商的协议为细胞和组织。的数量和质量RNA检测使用NanoDrop 1000 (NanoDrop技术,威明顿、德、美国)。引物与引物设计5.0 (ABI)软件,因此合成了桑戈语生物科技(上海)有限公司,有限公司的底漆TRAF4 5′-AGGAGTTCGTCTTTGACACCATC-3′(向前)和5′-CTTTGAATGGGCAGAGCACC-3′(反向),与162个基点的产物。的底漆TRAF6 5′-CCTTTGGCAAATGTCATCTGTG-3′(向前)和5′-CTCTGCATCTTTTCATGGCAAC-3′(反向),与140个基点的产物。底漆的GAPDH是5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′(向前)和5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′(反向),提供226个基点的产物。

互补与PrimeScriptTM生产RT试剂盒(大连豆类生物技术有限公司)。简单地说,逆向转录在37°C孵化15分钟和85°C 5秒。SYBR预混料交货Taq装备购买从豆类和实时PCR反应是通过使用StepOne +设备(应用生物系统公司)在95°C 10秒钟紧随其后40 95°C的周期为5秒和60°C 20秒的指令SYBR预混料交货Taq工具包。目标基因的表达水平是规范化GAPDH 2-ΔΔCt方法(12]。

2.4。免疫印迹分析

免疫印迹分析,PMBCs和组织样本细胞溶解在缓冲区里帕(σ)含有蛋白酶抑制剂(罗氏)和激动在冰上30分钟。蛋白质浓度测定用皮尔斯BCA分析工具包(皮尔斯、Wohlen、瑞士)。蛋白质电泳根据协议执行Mini-PROTEA三世(Bio-Rad)。短暂、蛋白质分离在10%聚丙烯酰胺凝胶(三/甘氨酸)和转移到聚偏二氟乙烯膜(微孔)。膜被中小学按顺序标记抗体。西方的屁股;探讨了抗体TRAF4(兔多克隆anti-TRAF4;1:1000年,Santa Cruz), TRAF6(鼠单克隆anti-TRAF6 1: 1000年,Santa Cruz),和β肌动蛋白(鼠标单克隆抗-β肌动蛋白;1:2500,Santa Cruz)。二次抗体购自通用电气医疗集团生命科学。检测被西方SuperSignal Pico增强化学发光底物(皮尔斯)。实验进行了一式三份。

2.5。统计分析

统计学意义是决定使用GraphPad Prism 5.0为Windows (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。一个被认为是显著的与或图基multicomparison方差分析分析。一个双边确切概率法执行测试来分析离散变量。

3所示。结果

3.1。包括学科的特点

从2007年2月到2010年2月,40 CD患者中,42例UC患者和40名健康对照组纳入本研究。IBD患者表示身体质量指数(BMI)显著低于健康对照组()。UC组包含更多的吸烟者比CD患者(22:8)。三回肠炎患者,15回肠结肠炎患者,22结肠炎患者参加CD组。13 proctosigmoiditis患者,20左路结肠炎患者,9例pancolitis患者参加加州大学组。表中描述包括受试者的特征1。

3.2。在等离子体TRAF4和TRAF6表情

调查TRAF4和TRAF6 IBD的诊断价值,我们发现水平的可溶性TRAF4 TRAF6 IBD患者的血浆。我们发现TRAF4和TRAF6在CD和UC患者显著高于健康对照组(数字1(一)和1 (b))。然而,只有超表达的可溶性TRAF4内窥镜疾病活动指数表现出极显著正相关(男爵分数)在UC患者(枪兵,)。

此外,我们发现TRAF4显示显著区分活跃IBD患者诊断价值从健康对照组(,数据2(一个)和2 (b))。虽然TRAF6也表现出显著的诊断价值区分活跃的CD,加州大学健康对照组,较低的曲线下面积(AUC)预测诊断价值低于TRAF4(数字2 (c)和2 (d))。

3.3。TRAF4和TRAF6基因外周血单核细胞表达

识别基因表达式TRAF4和TRAF6 PBMCs患者CD和加州大学,我们从PBMCs孤立的RNA。类似于等离子体表达,TRAF4 TRAF6显示水平明显高于在CD和UC患者比健康对照组(数字1 (c)和1 (d))(所有)。

3.4。不同Upregulation Preactivation TRAF4和TRAF6结肠组织中表达

鉴于节段变化可以展示在IBD患者结肠炎症的发生,在内窥镜缓解肠段会出现组织学结肠炎,我们确定TRAF4的表达式和TRAF6发炎和non-inflamed肠道粘膜。不幸的是,只有回肠炎患者3和9基于排除标准pancolitis患者被排除在外。5 CD患者和三个UC患者也为拒绝活检排除在外。

实时定量PCR(存在)是用来确定基因的表达TRAF4和TRAF6发炎和non-inflamed肠道粘膜的炎症性肠病。发现TRAF4和TRAF6表情明显高于在发炎的肠道粘膜的患者相比,健康对照组(所有的正常黏膜)(数据3(一个)和3 (b))。有趣的是,TRAF6表达式也non-inflamed组织炎症性肠病的患者明显高于健康对照组,这可能表明潜在的preactivation TRAF6在炎症性肠病(图3 (b))。

西方墨点法是用来测量蛋白质表达TRAF4 TRAF6发炎和non-inflamed肠粘膜的炎症性肠病(图4)。我们的数据表明,只有TRAF6表达式non-inflamed组织炎症性肠病的患者明显高于健康对照组,虽然TRAF4和TRAF6蛋白表达在肠道粘膜炎症的患者明显高于健康对照组(所有的正常黏膜)(数据3 (c)和3 (d))。类似于他们的基因表达式,TRAF4和TRAF6蛋白表达显著增加在肠道粘膜发炎non-inflamed粘膜或健康对照组进行比较。此外,TRAF6蛋白表达明显高于在肠道粘膜发炎的IBD患者与健康对照组相比。

4所示。讨论

在当前的研究中,我们证明了两个TRAF家族的成员,TRAF4和TRAF6激活IBD患者。尽管TRAF4和TRAF6显示潜在的诊断价值区分活跃CD和加州大学健康对照组,只能预先激活TRAF6 non-inflamed组织炎症性肠病的患者。虽然TRAFs有相似的整体结构特征包括c端受体结合域和leucine-zipper域,他们自己的结构差异导致独特的互动与受体(13,14]。越来越多的证据表明,TRAFs监管不仅通过自身结构特点,还通过其相互作用的性质,招聘或本地化。

TRAF函数的理解增加了比TRAF4 TRAF6快得多。早期的超表达研究清楚地表明,TRAF6有助于CD40-mediated激活NF -κB和其他信号分子(15]。NF -κB活动调节在固有层免疫细胞和上皮细胞的发炎的肠道炎症性肠病(16]。NF -κB通路调节炎症,调节t细胞生产和DC的功能。然而,激活转录监管机构包括NF -很重要κB和压力激发了蛋白激酶(SAPKs)由TRAF6需要绑定CD40。CD40突变体和转基因小鼠解决TRAF6的角色。细胞质CD40绑定域名TRAF6 CD40-mediated激活是必需的单核细胞和巨噬细胞il - 6生产17白细胞介素6],促炎生物网络是调节在活跃的炎症性肠病(18]。此外,实验与免疫细胞或成纤维细胞分离TRAF6-deficient老鼠表明TRAF6 CD40-mediated所需的激活不仅NF -κB还物和p38 MAPK信号(19,20.]。尽管CD40-mediated物激活B细胞似乎需要细胞质TRAF6 TRAF6突变体缺陷在CD40绑定能够激活物途径和上调CD80,表明TRAF6可能会导致某些物信号没有CD40的绑定(21]。物和MAPK信号通路参与调节淋巴细胞大量涌入在IBD患者通过调节肠道淋巴细胞粘附和轮回22]。此外,只有一个研究筛选的潜在改变TRAF6基因大量CD和UC患者,但未能识别明显致病突变(23]。他们的数据表明,TRAF6可能至关重要的角色在人类生物学,它可能不会容忍任何重大的结构性变化。

TRAF4具有一些独特的特点,不同于其他TRAFs的成员。亚细胞定位的作用和分子机制TRAF4是有争议的。很少有研究涉及TRAF4 IBD或结肠炎。树突细胞从TRAF4-deficient老鼠表现出减少迁移在体外和在活的有机体内实验(24]。这个结果表明TRAF4参与免疫功能可能通过促进免疫细胞迁移。有趣的是,TRAF4增加NF -κB激活通过GITR通过TRAF-binding GITR站点位于胞质域。这一领域负责Treg细胞的抑制和促进t细胞活化。尽管没有NF -κB活动曾被发现通过TRAF4过度,TRAF4已经涉及作为上游调节物的分子通路通过交互和激活的畸形(Msn) SPS1蛋白激酶家族成员(25]。此外,TRAF4积极调节转化生长因子(TGF)β通过其余骨形成蛋白(BMP)和节点信号26]。TGF -β在炎症性肠病的发病机制中发挥作用通过激活其特定的受体(27]。所有TRAFs除了TRAF4已确定与CD40直接或间接法。因此,TRAF4调节B细胞CD40信号后,这表明TRAF4影响下游CD40通路(28]。这也许可以解释我们的结果在non-inflamed TRAF4表情没有显著不同组织的IBD患者与健康对照组相比。

我们理解TRAF4和TRAF6功能在目前的研究表明,重叠和独特的功能最终将归功于每个TRAFs。据我们所知,本文是第一个结合分析TRAF4和TRAF6 IBD患者。然而,目前的研究仍存在一些限制。首先,本研究没有包括组织学标准区分non-inflamed组织发炎组织,这可能混淆显微镜下发炎组织与non-inflamed组织。其次,本研究不包括实验室数据ESR、CRP评估疾病活动,这可能会导致过度依赖的潜在偏差临床表现和内窥镜评估。总的来说,我们的数据显示相似和不同的表达模式的TRAF4和TRAF6 IBD患者。迄今为止,TRAF4之间的相关性和TRAF6没有探讨阐明信号级联。未来的研究来确定可能提供多方面的角色在炎症性肠病的治疗目标。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81000161),上海交通大学医学院科技基金(没有。YZ1036),瑞金医院的重点学科项目,上海交通大学医学院(没有。RJ4101305)。博士Lindholm芝加哥大学的Christopher修改语言和本文的讨论。