文摘

背景。树突细胞调节免疫反应微生物产品和扮演一个关键的角色在溃疡性结肠炎(UC)病理。我们确定益生菌毒株的免疫调节作用干酪乳杆菌(LcS)冻干对人类直流UC患者健康对照组和活跃。方法。从健康人体血液直流控制(控制直流)和UC患者(UC-DC)条件heat-killed LcS,用来刺激同种异体T细胞5天混合白细胞反应。结果。UC-DC显示减少刺激T细胞的能力( CLA)和增强表达skin-homing标记和CCR4刺激T细胞( )为阴性gut-homing标记 7所示。LcS治疗恢复UC-DC的鼓舞人心的能力,反映出控制直流。LcS治疗条件控制直流诱导T细胞结合班 7,生成multihoming概要,但对UC-DC没有影响。最后,LcS治疗增强DC诱导TGF能力 生产控制但不UC患者T细胞。结论。我们演示系统,提供直流功能在加州大学可能占UC患者的倾向发展皮肤表现。LcS多功能免疫调节活动根据炎症状态;在加州大学可能是由于治疗效果报告促进体内平衡。

1。介绍

宿主和微生物群之间的相互作用在粘膜免疫内稳态中起关键作用1]。某些乳酸生产菌株划分为益生菌,因为他们的消费与健康有关,介导通过肠道。目前益生菌的定义是“活的微生物,在管理充足带来一个健康的益处在主机”(2]。益生菌是最常见的乳酸菌或双歧杆菌属物种和物种通常可以发现在正常共生的微生物群。益生菌可以有效治疗某些炎症性肠病(IBD)患者(3- - - - - -7),但这株带来好处的细节及其机制的行动只是慢慢地被定义。

溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD),集体称为炎症性肠病(IBD),结果从一个特异表达的反应腔的微生物群的粘膜免疫系统组件和崩溃的免疫耐受个体疾病的遗传易感性。这些过程导致粘膜的“不合适”的激活T细胞和炎症介质的生产8- - - - - -11]。

树突状细胞(DC)识别和应对细菌和细菌的产品和产生主要的T细胞反应。直流也确定T细胞反应生成的免疫原性或耐受性12- - - - - -14]。特别是肠道DC之间保持微妙的平衡的肠道免疫原性对入侵病原体和宽容的共生的微生物群15];改变肠道DC被发现在炎症性肠病(15,16]。益生菌的影响,所以关键的早期细菌识别,宽容感应,形成T细胞反应,很可能是中央在这些细菌和免疫调节的部分占报道益生菌的功效在炎症性肠病(3- - - - - -7]。

IBD相关的各种extraintestinal表现(EIM),多达三分之一的IBD患者发展皮肤的表现(17]。EIM的原因知之甚少,但有人建议上炎症过程的不同器官(如肠道、皮肤、肝脏)可能与归巢和贩卖的免疫细胞(18]。事实上,淋巴细胞特异表达贩卖据报道在加州大学和CD [19- - - - - -22]。

导航属性是印在T细胞刺激后直流,本土化免疫反应到特定的组织(23- - - - - -26]。效应T细胞迁移到肠道网站gut-homing高水平表达的分子α4β7(27],其配体MAdCAM-1被postcapillary持续表达内皮细胞在小肠28)和结肠固有层(29日]。皮肤T细胞表达E -和P-selectin配体包括皮肤lymphocyte-associated抗原(CLA) (30.]和CCR4 [31日]。EIM与炎症性肠病的发生表明一种全身性疾病,免疫失调而不是局限于肠道网站;然而目前不清楚是否改变循环直流发生在IBD患者,包括直流能力印记特定导航属性刺激T细胞。贩卖的免疫细胞是一个区域有待调查关于特定的免疫调节机制的行动在IBD益生菌或直流特异表达功能。

益生菌的毒株特异性免疫调节效应的本质是建立;一些乳酸菌菌株诱发的生产监管细胞因子,抑制了Th1反应,被认为是参与口腔宽容。相比之下,其他菌株诱导pro炎性细胞因子的生产。然而,人工干预研究表明各种有益的免疫调节作用与消费有关的益生菌菌株干酪乳杆菌(LcS)冻干具体地说,包括加州大学的显著改善疾病活动指数(UCDAI)分数轻中度UC患者管理LcS口头8周,相比,预处理以及患者常规治疗。同样的研究表明,LcS降低il - 6的产量从外周血单核细胞(PBMC)在体外(32]。其他研究表明减少牙龈炎症(33过敏反应(差别),对这些34LcS消费后)。为此,我们旨在确定患者系统性变化存在于健康对照组和活跃的加州大学,关于循环的能力(blood-enriched)直流产生效应T细胞反应和印在T细胞刺激特定导航属性。我们也旨在研究益生菌菌株LcS的免疫调节作用等。

2。材料和方法

2.1。人类外周血

人类外周血收集与任何已知的健康志愿者自身免疫或炎症性疾病,过敏或恶性肿瘤( )或从活跃UC患者知情同意后( )。疾病活动使用加州大学加州大学评估疾病活动指数(UCDAI);患者得分UCDAI 4 - 12,与临床诊断参数,影像学研究和内镜和组织学标准定义为积极的加州大学。患者治疗天真或最小的治疗:5-aminosalicylic酸(5 asa)和/或硫唑嘌呤(AZA)。外周血单核细胞(PBMC)是通过离心/ Ficoll-Paque + (Amersham生物科学,都圣吉尔斯,英国)。人类blood-enriched直流(低密度细胞或LDC) NycoPrep离心后获得隔夜培养PBMC。这些细胞是98% - -100% 形态特征的直流(光学显微镜和电子显微镜),并且幼稚T细胞的有力刺激器。血LDC已经详细描述从我们实验室之前的研究35,36),将在本研究被称为血直流。

2.2。LcS调节人类的鲜血直流

LcS的股票文化(益力多Honsha有限公司,东京,日本)是培养在37°C 24小时汤夫人和太太生长在琼脂(Oxoid、汉普郡、英国)48小时37°C在厌氧内阁(mac 1000毫克;惠特利不科学、英国西约克郡)和10%的气体混合物H2,10%的公司2,80% N2按体积。液体培养,一个纯粹的殖民地被一夜之间从一个营养琼脂板夫人和生长在10毫升预还原汤夫人(Oxoid)与0.05%盐酸半胱氨酸(σ,多塞特郡,英国)震动孵化器在37°C;0.5毫升的隔夜文化是接种到另一个10毫升汤夫人。细菌在指数期收获,resuspended磷酸盐(PBS;Oxoid),离心两次在1960 g(美国哈佛希尔三洋/ MSE微半人马)5分钟,和resuspended RPMI 1640包含所需浓度的0.75毫米谷酰胺。然后heat-killed细菌和可行性做检查以确保没有细菌活了下来,和不同浓度(1×1051×106或1×107)heat-killed LcS是用来条件2.5×105血直流1毫升总量的完全培养基(荷兰修改RPMI 1640包含2毫米谷氨酰胺,10%胎牛血清,和100 U /毫升青霉素、链霉素)为24小时。控制条件包括调节直流成套中只有24小时。调节后,直流清洗和用于mixed-leucocyte(高)与同种异体T细胞的反应。

2.3。浓缩的血T细胞

PBMC在停牌MiniMACS缓冲区(PBS包含0.5% BSA和2毫米EDTA)和T细胞丰富CD14的损耗+,CD19+,HLA-DR+细胞与immunomagnetic珠(英国Bisley Miltenyi生物技术)制造商的指示。

2.4。T细胞增殖试验

二乙酸Carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE,英杰公司有限公司,英国)标记T细胞(4×105/)培养5天在U-bottomed 96 - microtitre板块与丰富,以前条件,同种异体直流为0%,1%,2%,3%在混合白细胞反应(高)。细胞被恢复, 通过流式细胞术增殖细胞识别和量化。

2.5。抗体标记

与下面的特异性单克隆抗体,结合使用:CLA-FITC (heca - 452),β7 integrin-PE (FIB504)、白介素(p40 / p70)体育(C11.5) IL-17A-PE (SCPL1362) CD3-PerCPCy5.5 (SK7) CD3-PeCy5 (UCHT1) IL-10-APC (JES3-19F1)、干扰素γ(25723.11),CLA-biotin (heca - 452),和Streptavidin-APC从BD购买生物科学(英国牛津大学);CCR9 (FITC或APC) (112509), CCR7-PE (150503), CCR10-APC (314315), CCR4-APC(205410),和TGFβ从研发系统(IC388P)购买(英国阿宾顿)。适当的isotype-matched控制抗体购自同一制造商。染色后,细胞被固定在1%多聚甲醛0.85%生理盐水和储存在4°C之前收购流式细胞分析仪,在48小时内。

2.6。流式细胞仪和数据分析

数据获得在FACSCanto II血细胞计数器(BD生物科学)和分析使用WinList 5.0软件(真实性,我,我们)。阳性细胞的比例是衡量减去适当isotype-matched控制染色从测试使用superenhanced直方图 (SED)正常化减法。

2.7。细胞因子分析

刺激T细胞后的细胞内细胞因子的生产高钙用superenhanced测量 (SED)正常化减法在孵化后数据分析+ /−莫能菌素,T细胞permeabilisation,抗体标记和流式细胞术。

2.8。统计分析

数据平均值和标准错误。双向重复测量方差分析和双尾配对 测试图中所应用的传说。对于多个比较,随后特别的Bonferroni调整应用。 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。在加州大学人类直流特性函数
3.1.1。降低T细胞刺激直流在加州大学的能力

我们分析了DC刺激T细胞的5天混合白细胞反应(高)。T细胞来自同一个捐赠者(一个单独的、健康控制)被DC刺激健康对照组和UC患者,在相同的实验。DC刺激强烈,增生性反应存在剂量依赖的相关性在UC患者和健康对照组;T细胞分裂被确定为 CD3+淋巴细胞,流式细胞仪(图1(一))。然而,直流UC患者(UC-DC)刺激明显弱扩散的CFSE-labelled T细胞从健康对照组相比,直流(直流控制;图1 (b))。

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图1
在加州大学限制直流鼓舞人心的能力。(a)的识别划分后T细胞混合白细胞反应(高)根据流式细胞术和侧散点图和随后的CD3和CFSE直方图,分别。(b)剂量反应高钙后T细胞增殖。结果显示平均±SEM ( )。层扩散的比例显示为T细胞分裂,没有直流(0%)。配对后双向方差分析分析(与Bonferroni调整纠正多个比较),直流浓度是统计学意义在两种情况下( ),也就是说,剂量反应发生在两种情况下。UC-DC刺激低于控制直流( DC)为1%,2%,和3%。
3.1.2。DC在加州大学展览一个增强效应T细胞上的印记Skin-Homing属性的能力

我们先前已经表明,T细胞在新鲜PBMC表达要么gut-homing分子β7、skin-homing分子班;多数人表示β7只。新鲜纯净的T细胞表现出相同的归航,coculture之前与同种异体直流(37]。文化后的表达β7除以T细胞( )是默认路径;T细胞刺激控制和UC-DC维护β7表达式,如果T细胞。相比之下,CLA表达诱导T细胞除以两个控制和UC-DC这样大量的T细胞被确定为积极上课,两倍β7后刺激(由于固有的高表达β7在所有条件;图2(一个))。然而,UC-DC展出一个增强' skin-homing T细胞的能力,显著提高CLA总量的比例+T细胞(图2 (b))和T细胞的比例表达skin-homing分子CCR4(图2 (c)在刺激人口)。

(一)
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(c)
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图2
UC-DC增强skin-homing分子刺激T细胞上的表达。(一)班/β7点块划分T细胞,控制或UC-DC刺激后3%。数字在每个点情节代表的比例划分T细胞表达β7只,β7班,班,或者β7、CLA。(b)直方图CLA表达除以T细胞,控制或UC-DC刺激后3%。在右边,总结所有实验的图( )。(c)直方图CCR4表达除以T细胞,控制或UC-DC刺激后3%。在右边,总结所有实验的图( )。配对 以及应用; 值< 0.05被认为是统计学意义(* )。所有直方图代表/点情节从一个实验3代表独立实验执行类似的结果。填充柱状图表示阳性染色;空的直方图代表背景染色。
3.2。LcS治疗对树突状细胞功能的影响
3.2.1之上。LcS恢复T细胞刺激树突细胞在加州大学的能力

优化实验健康控制直流决定生活之间没有显著差异或heat-killed(香港)LcS关于能力提高直流激活/成熟标记CD80和CD83;生活和香港LcS显著增强CD80和CD83表达式(图3(一个))。因此香港LcS是用于所有进一步的实验。

(一)
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(c)
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图3
LcS恢复“正常”的DC刺激加州大学的能力。(a)的识别blood-enriched直流根据流式细胞术和侧散点图和总结图代表的意思是±SEM直流表达CD40和CD86的比例与介质条件后,生活LcS或死LcS ( )。独立的实验进行了调节直流与有限合伙人( )。(b)剂量反应T细胞增殖与控制——UC-DC(高钙后 )。配对后双向方差分析分析(与Bonferroni调整纠正多个比较),直流浓度显著在所有情况下( )。控制和UC-DC刺激能力提高后LcS调节1×10的LcS的浓度5(控制: 为2%,加州大学: 为1%, 为2%, DC) 3%, 1×106(控制: 在2%和3%,加州大学: 为2%, 在3% DC)和1×107(控制: 在1%、2%和3%,加州大学: 在2%和3%)CFU /毫升。(c)没有明显差异的刺激能力控制和LcS-conditioned UC-DC在任何LcS浓度。

我们分析了DC刺激T细胞的5天混合白细胞反应(高)后直流空调只完全培养基和不同浓度的香港LcS (1×1051×106或1×107CFU /毫升)。显著增加存在剂量依赖的相关性,观察DC刺激能力在LcS调节控制和UC-DC(图3 (b))。LcS调节后,UC-DC水平的刺激恢复“正常”的水平,类似于控制直流(图3 (c))。

3.2.2。LcS的直流印记Skin-Homing属性在健康对照组但不是UC患者的T细胞

LcS的调节直流差动效应在健康对照组与加州大学相比,在直流印记导航属性刺激T细胞的能力。在健康对照组,LcS调节增强DC诱导skin-homing概要文件在T细胞的能力,显著增加的比例刺激T细胞表达CLA,剂量依赖性的方式(数字4(一)和4 (b))。然而,在加州大学,CLA表情T细胞已经增强(数字2(一个)和2 (b)),LcS空调没有进一步影响直流能力提高CLA表情T细胞(图4 (b))。LcS条件没有影响直流能力诱导CCR4表达健康对照组或UC患者(数据未显示)。

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(d)
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图4
LcS调节直流CLA的增强表达的刺激T细胞在健康对照组但不是加州大学。(a)直方图CLA表达除以T细胞,刺激后3% DC从健康控制(LcS)和调节后1×105/ 1×106/ 1×107CFU /毫升LcS。例子就是从一个实验但代表三个独立的实验也得到了类似的结果。(b)总结图的所有实验中,代表比例的班+T细胞刺激3%控制和增加剂量的LcS UC-DC条件( )。单向方差分析应用; 值< 0.05被认为是统计学意义(* ,* * )。(c)班/β7点块划分T细胞,刺激后3%控制,控制直流+ 1×107LcS,或者UC-DC (LcS)。例子就是从一个实验但代表三个独立的实验也得到了类似的结果。数字在每个点情节代表的比例划分T细胞表达β7只,β7班,班,或者β7、CLA。所有实验的(d)概要图( )代表的比例划分T细胞(DC在所有情况下刺激3%)只表达课(即,β7负),总班+将T细胞。配对 以及应用; 值< 0.05被认为是统计学意义(* ,* * )。

CLA对T细胞表达增强刺激,未经处理的UC-DC和LcS-conditioned(控制)。CLA诱导T细胞刺激的LcS-conditioned直流控制结合gut-homing标记β7所示。然而,CLA诱导治疗UC-DC上β7 - T细胞(图的分数4 (c))。因此,CLA的比例+β7−T细胞内总班+T细胞分裂与UC-DC池明显更大的刺激后,相比LcS (1×107CFU /毫升)条件(控制)直流(图4 (d))。

3.2.3。LcS条件诱导TGF直流β生产健康对照组但不是UC患者的T细胞

LcS的调节直流对直流能力也差影响诱导细胞因子刺激生产的T细胞,在控制与UC患者相比。虽然有能力之间的差异个人实验控制直流和UC-DC(治疗)诱导细胞因子生产的T细胞(TGF il - 10β,干扰素γ和测量IL-17A),整体没有明显差异(图5(一个))。然而,TGFβ生产的T细胞明显增加,剂量依赖性的方式,当直流条件与LcS健康对照组但不是在溃疡性结肠炎(图5 (b))。

(一)
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(b)
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图5
胞内细胞因子通过刺激T细胞生产。(a)图的实验总结代表T细胞的比例控制和生产TGF UC-DC刺激了3%βil - 10,干扰素γ和IL-17 ( )。配对 测试应用; 值< 0.05被认为是具有统计学意义。(b) TGF的直方图β表达除以T细胞,刺激后3%控制(没有LcS)直流或控制直流+ 1×105/ 1×106或1×107CFU /毫升LcS。例子就是从一个实验但代表三个独立的实验也得到了类似的结果。所有实验的概要图( )代表的比例划分T细胞(DC在所有情况下刺激3%)生产TGFβ。直流来自健康对照组(左图像)或UC患者(图)。单向方差分析应用; 值< 0.05被认为是统计学意义(* )。

4所示。讨论

我们首次证明人类循环直流UC患者表现出限制刺激同种异体T细胞的能力,而这些DC诱导刺激T细胞上的特定skin-homing概要,直流控制不健康。我们的数据支持的研究证明DC函数在炎症性肠病(特异表达11,15,16),此外,证明系统性免疫失调IBD患者而不是在粘膜网站只。extraintestinal表现(EIM)的发生与IBD相关表明,炎症性肠病的确是一种全身性疾病,和我们的数据提供了一个解释发生的EIM影响皮肤(17]。调节与益生菌菌株UC-DC LcS恢复他们的鼓舞人心的能力,反映控制直流。LcS了微分的影响在健康对照组和加州大学DC直流能力印记具体归航概要刺激T细胞,T细胞和诱导细胞因子的生产。这是第一个研究中,据我们所知,探讨益生菌对免疫细胞的迁移特性的影响。我们的数据支持研究证明多功能LcS的免疫调节活动,根据细胞类型和局部微环境的反应(38]。

LcS条件控制直流,但不是UC-DC印记skin-homing分子CLA在刺激T细胞。然而,与skin-homing概要文件由UC-DC诱导T细胞,通过LcS CLA诱导表达条件是结合gut-homing分子β7,暗示感应multihoming概要文件。LcS的微分作用对控制和UC-DC进一步证明了TGF的感应β生产的T细胞刺激与LcS-conditioned直流控制但不UC患者。这些数据表明,LcS的影响对人类直流是灵活的,取决于细胞类型和局部细胞因子的反应环境。恢复UC-DC LcS的刺激能力表明LcS部分可能导致修复/维持体内平衡。

肠道地点LcS,可能也会造就自我平衡的属性(例如,通过口服)这可能是有益的在炎症性肠病;肠道DC发挥核心作用在肠道免疫内稳态39)和展览耐受性属性(15]。改变发生在肠道DC在炎症性肠病(15,16),导致损失的宽容在肠道和结肠微生物群特异表达免疫反应,炎症性肠病的发病的主要因素(11]。恢复体内平衡肠道DC的LcS的属性肠网站可能占的报道疗效LcS在加州大学(32]。然而,局部微环境和响应细胞类型有明显不同的循环和肠道,例如,肠道DC受制于肠道上皮细胞和上皮细胞衍生产品采用他们的耐受性功能(40- - - - - -42]。未来的研究将确定在体外LcS对肠道DC的影响以及对肠道上皮细胞调节直流。

尽管益生菌的定义涉及到生活微生物(当在充足带来健康效益管理主机)(2),我们的数据表明免疫调节heat-killed细菌;此外,我们证明了关于他们的生活和香港LcS之间没有显著差异的能力增强激活标志表情blood-enriched直流健康对照组。这些数据支持的研究证明由益生菌细菌免疫调节产品,包括益生菌细菌DNA的能力诱导监管il - 10生产人类外周血单核细胞(43和树突细胞44)和的能力用益生菌诱导血液和肠道DC明显抗炎作用。此外,我们最近的研究已经证明,免疫调节肽分泌乳杆菌介导的分子肠道细菌和华盛顿之间的对话,诱导血液和肠道免疫调节作用在体外(45]。

炎症性肠病与各种EIM,高达三分之一的病人发展中皮肤的表现包括结节性红斑(EN)和脓皮病gangrenosum (PG) [17]。EIM IBD的鲜为人知的原因,但它已经表明上炎症过程的不同器官(如肠、皮肤和肝脏)可能与归巢和贩卖的免疫细胞。例如,CCL25 gut-homing CCR9受体的配体,表示在肝脏和小肠上皮细胞(18]。失调的淋巴细胞贩运在IBD发病机制中扮演着重要角色19- - - - - -22,46)和炎症性肠病治疗以前证明疗效废除贩卖的效应细胞肠网站(47- - - - - -51]。然而,我们在这个研究证明skin-homing标记CLA CCR4和异常表达β7−UC-DC T细胞刺激,提供一个解释EIM的发生影响皮肤和支持先前的研究证明调节直流与上层清液从UC患者结肠活检的文化使他们印记skin-homing表型刺激T细胞(52]。阻止人口贩卖的效应细胞皮肤的网站EIM IBD的患者也可能是治疗的好处。

虽然没有明显影响的LcS DC诱导T细胞细胞因子在加州大学整体生产能力,LcS是个体之间的变量的影响实验中,根据特定的细胞因子的生产是否增加或减少相比,T细胞刺激控制直流(数据未显示)。这些数据还表明恢复“正常”的表型和支持LcS的多功能免疫调节作用,免疫功能特异表达回到原来的正常状态当宿主免疫力低下或过度激活(38]。事实上,LcS可以赞成或抗炎作用在人工干预的研究[32,53,54),在体外研究[55- - - - - -57)根据上下文。

总之,我们的数据证明系统性改变免疫细胞在加州大学,专门提供DC函数。我们的数据提供了一个解释皮肤EIM UC患者的发生,表明益生菌菌株LcS多功能免疫调节活动,根据疾病和炎症环境状态。我们的数据支持的研究表明益生菌细菌的产品,而不是活细菌,能够诱导免疫调节作用。LcS的疗效报告和其它益生菌乳酸杆菌菌株在加州大学(32,58可能是部分原因是促进体内平衡,恢复免疫细胞的特异表达功能。

确认

这项研究是由欧洲益力多容积(Almere、荷兰)和l .干酪乳杆菌是由冻干益力多Honsha有限公司(日本东京)。拨款支持的纸是来自欧洲益力多的帐面价值、荷兰。