文摘

Dexmedetomidine一直报道减少脓毒性大鼠的死亡率。本研究旨在探讨,影响血浆浓度美托咪定对于炎症反应引起的脓毒性大鼠CLP的肺组织。脓毒症诱导后,老鼠用生理盐水或dexmedetomidine(5 10或20μ克/公斤)。脓毒性大鼠的存活率在24 h被记录。肺组织的炎症是评价他污点。il - 6和TNF -的浓度α在BALF和等离子体通过ELISA测定。TLR4的表达和MyD88被西方墨点法测量。NF -的激活κB在大鼠肺组织进行免疫印迹和免疫组织化学。发现死亡率和肺部炎症在脓毒性大鼠显著增加。il - 6和TNF -αBALF和等离子体,NF -κB活动,TLR4 / MyD88 CLP后大鼠肺组织中表达明显增强。Dexmedetomidine(10和20μ克/公斤)显著降低死亡率和肺部炎症感染性的老鼠,以及抑制CLP-induced海拔TNF -α和il - 6和抑制TLR4 / MyD88表达和NF -κB激活。这些结果表明,dexmedetomidine可能会降低死亡率和抑制炎症反应在脓毒性大鼠肺组织通过抑制TLR4 MyD88 / NF -κB通路。

1。介绍

脓毒症是一个主要的问题在重症监护室(ICU)和有很高的死亡率。它涉及网络的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α和il - 6中各种有毒的侮辱后,尤其是细菌感染(1- - - - - -4]。增强在肺组织炎症反应被认为是脓毒症的病理生理学的一个重要组成部分5]。内毒素hyperstress状态下,患者通常需要镇静和镇痛药物,以减少焦虑和压力。

Dexmedetomidine,选择性受体激动剂的肾上腺素能受体,是一种有效的镇静剂剂对危重病人,还提供了有效的镇痛(6]。行动的网站dexmedetomidine镇静剂的效果被认为是中脑的蓝斑核,它可以抑制释放神经传递素,从突触终端,从而抑制神经信号和减少觉醒。Dexmedetomidine镇痛效应介导的脊髓背角,它被认为是减少提升疼痛的神经元。这些行动导致有效的镇静和镇痛没有呼吸抑郁和六十问题。据报道,连同它的有利影响,dexmedetomidine在内毒素产生潜在的抗炎效果。先前的研究显示,dexmedetomidine,一个新的镇静剂代理,显著降低死亡率和减少炎性细胞因子在大鼠内毒素的水平(7]。然而,dexmedetomidine调节炎症反应的详细机制中内毒素显然没有被透露。

toll样受体(通常是一个家庭的跨膜蛋白和作为信号转导分子。toll样受体4 (TLR4)一直被视为其为病原体的主要传感器识别的分子模式(pamp)。TLR4是IL-1R / TLR总科的一员,要求有限合伙人的响应能力和参与宿主防御革兰氏阴性细菌(8]。TLR4的刺激可以通过骨髓分化因子激活NF-kappaB蛋白88 (MyD88)的依赖或独立的途径。配体结合后,通常/ IL-1Rs二聚并接受所需的构象改变招聘的下游信号分子和刺激下游激酶,包括激活转录因子NF -κB (9]。NF -的激活κB导致诱导基因编码等促炎细胞因子il - 6和TNF -α(10]。

,本研究旨在探讨影响血浆浓度美托咪定对于肺组织炎症反应的脓毒性引起的大鼠盲肠的结扎和穿刺(CLP)及相关机制。我们假设dexmedetomidine会抑制炎症反应在大鼠肺组织内毒素诱导CLP。此外,我们探讨dexmedetomidine能否减弱CLP-induced肺部炎症和NF -通过抑制TLR4 / MyD88表达式κB活化,减少促炎细胞因子在脓毒性大鼠生产。

2。材料和方法

2.1。动物

男性Sprague-Dawley老鼠(250 - 300 g)来自上海动物中心(上海,中国)。老鼠们被安置在23°C 12 h的光和12 h黑暗的每一天,允许自由获取食物和水。所有的实验都是按照制度执行标准的实验动物保健和使用研究。

2.2。盲肠的结扎和穿刺(CLP)操作

老鼠与戊巴比妥钠腹腔注射麻醉50毫克/公斤。如前所述Polymicrobial脓毒症诱导了CLP (11]。在无菌条件下接受了手术治疗腹部皮肤用75%的酒精消毒。剖腹手术是通过2厘米lower-midline切口。盲肠是立即暴露和结扎远避免肠梗阻的回盲瓣,然后刺穿了两次18-gauge针,轻轻挤压,迫使少量的粪便,然后返回到腹腔。腹部是在两层3 - 0的针脚缝合关闭。

2.3。试验协议

老鼠被随机分为五组:虚假的操作,中电,小剂量,中剂量和大剂量的dexmedetomidine。CLP或虚假的操作完成后dexmedetomidine或生理盐水。老鼠在虚假的操作和中电集团是由腹腔内注射生理盐水,和小老鼠,介质,和大剂量dexmedetomidine组由腹腔内注射5、10和20μ克/公斤dexmedetomidine分别。Dexmedetomidine或生理盐水是由腹腔内注射(0,2,4,6 h后操作。

2.4。死亡率

四十大鼠随机分为5组每组(8)提到的。动物是由CLP或虚假的操作和管理如前所述。所有的动物都是术后监测和管理。当动物死亡被记录。动物观察术后24小时致命注射戊巴比妥钠和牺牲。死亡率在24小时内计算。

2.5。等离子体,支气管肺泡灌洗液和肺组织收集

静脉血液样本被吸引在0、2、4、6小时后操作测量等离子体的细胞因子。在8小时尽快操作或动物死后,左主支气管相关,左肺切除。左肺上叶的组织在液氮和存储snap-frozen−80°C的后续蛋白免疫印迹检测,和左肺下叶被用于他染色和免疫组织化学。从每一组正确的肺灌洗与无菌生理盐水通过气管造口管以前的报告(12),然后支气管肺泡灌洗液(BALF)收集测量细胞因子的酶联免疫吸附试验(ELISA)。

2.6。他为肺组织染色

Formaldehyde-fixed左肺下叶是嵌入在石蜡连续切片,苏木精和伊红染色。组织学变化包括肺泡壁水肿、充血、出血、炎性细胞浸润是评价光学显微镜下根据以前的报告(评估肺部炎症12]。每个组织学特征是规模得分为0(正常)到5(严重),一位病理学家忽视这研究。整个肺部炎症是分类根据得分的总和(0 - 5:正常最小的炎症;6 - 10:轻度炎症;11 - 15号:中度炎症;16 - 20:严重的炎症)。

2.7。对il - 6和TNF - ELISAα

il - 6和TNF -的水平α在等离子体和BALF被ELISA检测。il - 6和TNF -α测量使用商用ELISA包根据协议的包。简单,细胞单克隆的自由上层清液添加到每个好兔子anti-rat il - 6和TNF -α抗体涂层microtitre板块(ELISA板)12 h在4°C。释放物质冲洗掉,生物素化的单克隆兔子anti-rat il - 6和TNF -α抗体被用于45分钟。结合抗体检测通过添加avidin-peroxidase 30分钟后跟孵化的abt衬底的解决方案。吸光度测量的衬底后20分钟。一个标准曲线构造使用各种稀释il - 6和TNF -α标准准备。il - 6和TNF -的水平α外推法测定吸光度的标准曲线。

2.8。免疫印迹的TLR4、MyD88和NF -κB

冷冻大鼠肺组织均质和溶菌产物是准备在冰冷的裂解缓冲。核提取物被收集并存储在−80°C的免疫印迹分析核易位NF -κB p65蛋白。总蛋白的提取规范化了等量的bicinchoninic酸(BCA)方法。从每个样本七十毫克的蛋白质分离在钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶和转移到PVDF膜。膜被封锁的5%脱脂牛奶和孵化隔夜原发性anti-NF -κB p - 65抗体(细胞信号技术,美国),anti-TLR4抗体(Santa Cruz),或anti-MyD88抗体在4°C (Santa Cruz),其次是孵化的合适的HRP-conjugated二级抗体4小时。细胞GAPDH蛋白质immunodetected作为内部标准。

2.9。免疫组织化学NF -κB

NF -κB p - 65蛋白质活动也观察到免疫组织化学技术。简而言之,部分被微波H抗原检索和使用0.3%₂O₂。随后,被封锁的部分与山羊血清和孵化主要包含兔子anti-NF -抗体的解决方案κB p - 65抗体在一夜之间在4°C。洗后,样品在一个合适的二次孵化抗体解决方案在室温下2 h。最后,部分在HRP-streptavidin孵化(1:100年,中山生物技术)在室温下1 h,和颜色反应是发达与diaminobenzidine (DAB)。部分复染色,脱水,盖玻片,在光学显微镜下分析。每张幻灯片5大功率领域被观察到。NF -的程度κ核NF - B激活百分数表示κB p - 65阳性细胞,肺泡上皮细胞。

2.10。统计分析

数据被当作平均数±标准差。spss 13.0软件被用于数据分析。差异组由单向方差分析(方差分析),紧随其后的是一个事后测试(Bonferroni的方法)。团体之间的死亡率比较使用卡普兰Meier方法。被定义为统计意义。

3所示。结果

3.1。死亡率

如图1,24小时手术后的死亡率是0%,87.5%,75%,37.5%,和25%,分别为骗局,中电,小、中、大剂量组。虚假的组相比,死亡率在CLP组显著增加。然而,中、大剂量的dexmedetomidine显著抑制CLP引起的死亡率升高。之间没有显著性差异小剂量dexmedetomidine集团、中电集团为死亡率。

3.2。组织病理学观察肺组织

代表显微图在图2每组代表八个样本。苏木精和伊红染色,光学显微镜下观察大鼠肺组织部分虚假组肺泡结构(图显示正常2(一个))。老鼠在CLP组表现出明显的肺组织病理异常,表现为肺泡壁水肿、充血,微血管渗漏,炎症细胞浸润(图2 (b))。小剂量的dexmedetomidine未能改善病理异常。然而,在治疗中、大剂量的dexmedetomidine,肺组织出现相对较好,显著降低炎症反应(数字2 (d)和2 (e)中电集团相比)。发现肺部炎症评分平行的组织病理学观察的结果(图3)。

3.3。水平的il - 6和TNF -α在等离子体和BALF

如图4,il - 6和TNF -的基线值α在五组相似。然而,il - 6和TNF -α等离子体和BALF的老鼠明显增加2,4,6小时后CLP操作相比,那些虚假的组。中、大剂量的dexmedetomidine显著抑制il - 6和TNF -的生产α在等离子体和BALF CLP引起的。虽然小剂量dexmedetomidine没有明显影响这些促炎细胞因子水平的血浆及BALF CLP老鼠。

3.4。免疫印迹分析TLR4 / MyD88表达式在肺

为了澄清机制dexmedetomidine抑制肺部感染性炎症引起的大鼠CLP,我们进一步研究了TLR4的表达/ MyD88肺组织。在这项研究中,TLR4 / MyD88从CLP组大鼠的肺组织中表达显著调节相比,在虚假的组。中、大剂量的dexmedetomidine显著抑制TLR4表达/ MyD88脓毒性大鼠的肺。然而,小剂量dexmedetomidine没有显著减少CLP诱导超表达TLR4 / MyD88(图5)。

3.5。免疫印迹分析NF -κB活动

如图6,NF -的表达κB p65核提取物显著调节CLP后操作相比,在虚假的组。Dexmedetomidine中等和大剂量显著减活化的NF -κB p65脓毒性大鼠肺。然而,小剂量dexmedetomidine没有明显抑制NF -的激活κB p65 CLP引起的操作。

3.6。免疫组织化学NF -κB活动

核阳性染色代表了激活的nf -κb .中电集团约54%的肺泡上皮细胞表达核阳性染色,虚假的组比约18.5%。核阳性染色细胞的百分比显示治疗后显著降低与dexmedetomidine CLP相比,中、高剂量组(,;,;与,数据7和8)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查了,影响血浆浓度美托咪定对于死亡率和炎症反应CLP引起的脓毒性大鼠的肺组织。发现dexmedetomidine剂量的10到20倍μ克/公斤CLP-induced肺部炎症和降低死亡率,减少生产il - 6和TNF -α在脓毒性大鼠血浆及BALF和抑制TLR4 / MyD88表达和NF -κB在大鼠内毒素诱导的肺CLP激活。我们的研究结果表明,dexmedetomidine可能调节一些感染性炎症反应在肺的老鼠体内通过抑制TLR4 MyD88 / NF -κB通路,这可能有助于减少CLP引起的脓毒性大鼠的死亡率。

急性肺损伤的特点是overinflammatory反应是脓毒症的严重后果(5]。肺部炎症反应,包括upregulation各种促炎因子和许多炎症细胞的浸润,内毒素是至关重要的,也是导致高死亡率的一个重要原因。因此,衰减过度期间肺部炎症内毒素有利于减少败血症的患者的死亡率。先前的研究已经表明,dexmedetomidine降低死亡率和炎症反应有抑制作用的静脉注射内毒素诱导的大肠杆菌内毒素(7]。我们的结果,dexmedetomidine CLP-induced死亡率明显减少,减少生产il - 6和TNF -α在等离子体和减毒炎性组织病理学变化引起的脓毒性大鼠的肺组织中CLP与以前的报告[音乐会7]。此外,一些研究[13- - - - - -15)表明,dexmedetomidine可能产生潜在的保护作用在通风机通过抑制炎症反应,脂多糖,或α-naphthylthiourea-induced急性肺损伤。尽管当前和先前的研究显示,监管影响血浆浓度美托咪定对于炎症反应在急性肺损伤,负责这些行动的确切机制不清楚。

toll样受体4 (TLR4)是一种跨膜受体蛋白与细胞外富亮氨酸重复域和胞质信号域。TLR4是参与免疫反应,尤其是在对外国病原体激活先天免疫和微生物,但同时也引发适应免疫(16- - - - - -18]。TLR4是CD-14相关跨膜信号传感器,这是必要的LPS-induced细胞反应(19- - - - - -21]。协会最近的研究表明TLR4与骨髓分化因子88 (MyD88)可能诱发IL-1R相关激酶的活化和TNF receptor-associated因素(22],它触发炎症级联反应。

核转录因子(NF -κBκB)是一种重要的核转录因子。NF -κB异质二聚体由p50和p65 (Rel)子单元。它在免疫中起着举足轻重的作用,通过调节炎症反应的几种蛋白质的表达,包括促炎细胞因子、趋化因子、粘附分子。不受控制的激活NF -κB通路参与许多急性和慢性炎症性疾病的发病机理。在其非活动状态,NF-kappaB二聚体存在于细胞溶质,绑定到一个抑制蛋白,I-kappaB。激活NF-kappaB由几个刺激诱发的释放和抑制蛋白质的降解I-kappaB从二聚的复杂23),其次是磷酸化的NF-kappaB p65和易位核(24,25]。

TLR4-mediated信号通路主要刺激激活NF -κb在细胞核,NF-kappaB绑定到相应的网站许多促炎基因的转录调节如il - 6和TNF -α。脓毒症动物模型在目前的研究中,幼童腹壁薄弱的CLP成立。结果表明,两种TLR4 / MyD88表达式和NF -κB激活明显调节脓毒性大鼠的肺组织。在这里,我们还显示,dexmedetomidine(10和20μ克/公斤)治疗可以减少CLP-induced增强TLR4 / MyD88表达和NF -κB激活大鼠肺。自从TLR4是一个重要的上游传感器从病原体微生物和有限合伙人可能调解NF -κB通过MyD88依赖途径激活,NF -κB激活能增加il - 6和TNF -的生产αdexmedetomidine可能减少了生产这些细胞因子和变弱肺部炎症抑制TLR4 MyD88 / NF -κB信号通路在肺脓毒性引起的大鼠CLP的幼童腹壁薄弱。我们的研究结果表明,抑制TLR4 / MyD88 / NF -κB信号可能dexmedetomidine减毒炎症反应的可能机制,通过肺脓毒性大鼠诱导的CLP。此外,小剂量dexmedetomidine并不影响TLR4的表达/ MyD88和NF -的激活κB在脓毒性大鼠肺组织。这些结果与小剂量的效果一致dexmedetomidine未能抑制肺部炎症和降低CLP引起的脓毒性大鼠的死亡率。

总之,目前的研究结果表明,dexmedetomidine抑制肺部炎症和减少促炎细胞因子il - 6和TNF -的生产αTLR4 / MyD88 / NF -的衰减κB在脓毒性引起的大鼠CLP途径激活。这些属性的dexmedetomidine可能有助于减少脓毒性大鼠的死亡率。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突会歧视他们的公正。

作者的贡献

吴y, y刘贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81171013,81171013,81001431),学院和大学的关键主题,江苏省自然科学基金(10 kja320052),和一个项目优先资助的学术程序开发江苏高等教育机构。