文摘
二十个病人受到慢性静脉疾病(CVD)三级静脉网络和/或分析了隐静脉外科消融之前echo-color-doppler血流动力学参数的回流时间(RT)、阻力指数(RI),消极的和积极的预后因子。RT和RI与相关在体外参数的静脉血管内皮细胞(VEC)获得手术标本,细胞迁移等血清反应梯度,增殖指数,细胞间粘附分子(ICAM) 1和血管细胞粘附分子1 (VCAM)表达式,以及细胞因子释放。的兴趣,ICAM-1表达patient-derived VEC文化与国际扶轮积极与RT和负相关。此外,RT显示正相关与基线osteoprotegerin(功能)表达式VEC VEC扩散指数和一个负相关。另一方面,国际扶轮将积极与TNF-related凋亡诱导配体(TRAIL)表达式。在矢量,胶质细胞释放的gm - csf VEC核扩散和跟踪显示正相关与表达和功能的负相关,ICAM-1和VCAM-1表达式。自在体外重组gm - csf VEC增殖和诱导中和ICAM-1的感应,VCAM-1,对暴露于TNF -功能α,我们的数据表明gm - csf在静脉内皮细胞的抗炎活性。
1。介绍
静脉血管内皮细胞(VEC)通常暴露于血流动力学,调节内皮细胞功能及血管生物学/病理学在健康和疾病1,2]。静脉系统,回流产生的扰流,流出障碍和/或瘀描述慢性静脉疾病(CVD)导致静脉炎症和血栓形成3,4]。在临床背景下,echo-color多普勒(ECD)分析允许临床相关的血流动力学参数的评价如特别是回流时间(RT)和阻力指数(RI)。而更高的回流时间意味着更严重的疾病,因此RT是负的心血管疾病的预后因素,国际扶轮是与血管阻力和因此被认为是一个积极的预后因子在下肢慢性静脉功能不全(5,6]。
理解紊流对VEC的影响可以提供机械的见解复杂流动模式的作用在血管疾病的发病机理和可以帮助阐明静止之间的表型和功能差异(nonthrombogenic)和激活VEC(形成血栓的)。
尽管一些报告解决紊流对内皮细胞的作用激活使用在体外剪切应力的模型(1,2),目前没有数据可用的生物变化引起的内皮细胞改变血液流动在活的有机体内化学汽相淀积特征。在这种背景下,一些作者提出,培养内皮细胞代表一个合适的模型来研究内皮炎症/形成血栓的属性的不同位置(7,8]。在这方面,我们最近开发出一种隔离和协议体外特征矢量的大血管的病人在心血管疾病的不同阶段(9,10]。这使得评价的几个实验设置在体外病理生物学特征矢量,例如,特别是细胞迁移、增殖,表达促炎的标记,如osteoprotegerin(功能),ICAM-1, VCAM-1粘附分子(9,释放促炎细胞因子在正常培养条件或反应刺激在暴露于TNF -α(10]。在这种背景下,有趣的是,除了在osteoclastogenesis其作用,功能也充当TNF-related中和受体细胞凋亡诱导配体(TRAIL),肿瘤坏死因子家族成员以前一直显示显示内皮细胞保护活动(11- - - - - -14]。此外,它已被证明,功能也表现出内皮细胞炎性活动(15中和小道),独立的能力。
在此基础上,本研究的目的是调查潜在的临床相关的血流动力学参数之间的相关性的病人VEC (RT和RI)和分离得到在体外VEC为了patient-derived的生物特征识别关键因素可能参与调节在活的有机体内VEC的生物特征。为此,我们也分析了在体外释放的细胞因子的矢量,这可能在促进血管生成和组织再生中发挥作用,包括gm - csf (16- - - - - -19]。
2。材料和方法
2.1。临床和患者的人口统计学特征
二十患者主要心血管疾病影响浅静脉回流(C2-3EpAsPr CEAP分类后)静脉曲张手术被echo-color评估多普勒(ECD)后血流动力学参数:收缩期峰值流速(PSV)、舒张速度结束(类别),这使得计算阻力指数(RI)和回流时间(RT)。echo-color多普勒已经根据国际准则。病人的主要临床和人口特征是总结表1。随后被手术切除静脉段,用于VEC隔离,采用前面描述的协议(9]。接下来的程序是符合赫尔辛基宣言,机构审查委员会批准(费拉拉大学医院)和所有参与者主体给书面知情同意。
2.2。细胞培养和治疗
从手术隔离后段,VEC文化从心血管疾病患者获得高纯度形态和表型特征属性,如前所述[9]。VEC被种植在EGM2介质(Lonza Walkersville, MD)和2%的边后卫和补充完整(EGM2子弹装备,Lonza) 5μ克/厘米2纤连蛋白涂层组织培养板(BD,正欲圣何塞,CA)和段落中使用3到6,正如前面报道(15]。
为在体外内皮细胞治疗,重组TNF -α(研发系统、明尼阿波利斯、MN)和gm - csf(美国新泽西州PeproTech)用于5 ng / mL的最佳浓度和20 ng / mL,分别在初步确定剂量反应实验。在选定的实验中重组gm - csf细胞被添加到前1小时暴露于TNF -α。不同的治疗后,细胞生存能力是由光监控细胞单层膜的显微分析,其次是定量检查通过台盼蓝染料排斥、碘化和细胞凋亡被膜联蛋白V / propidium评估(PI)染色流式细胞术分析,如前所报道(20.- - - - - -22]。
2.3。细胞增殖实验
如前所述(执行细胞增殖9使用DP)版本的xCELLigence实时细胞分析仪RTCA(罗氏诊断,曼海姆,德国),记录变化阻抗(报告为一个细胞index-CI)在长时间在一个非侵入性的系统。简单,背景的阻抗RTCA DP E-Plates 16使用标准的执行与100年协议提供的软件μL EGM-2。五千年内皮细胞被播种在纤连蛋白预涂井100一式四份μ完整的L(2%的边后卫和细胞因子或生长因子)EGM2和室温平衡30分钟。细胞被允许增加22小时gm - csf的文化表示浓度。增殖细胞的CI是记录和表达意思的词规范化CI记录当时的gm - csf细胞治疗相比,未经处理的细胞。
2.4。实时一结论分析
实时逆转录-聚合酶链反应(RT)分析采用定量比较ICAM-1的表达水平,VCAM-1 VEC文化痕迹,功能。细胞总RNA提取利用RNeasy +迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据供应商的指令。总RNA制备的质量被琼脂糖凝胶和验证,必要时,进一步净化了RNeasy清理系统(试剂盒)删除染色质DNA。总RNA转录成cDNA、使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒)。分析ICAM-1 VCAM-1、小径和功能基因表达进行了使用SYBR绿色实时PCR检测方法与SABiosciences RT2实时基因表达分析,包括特定的验证引物集和PCR大师混合(SABiosciences,弗雷德里克,MD),如前所述[23]。所有样本一式三份运行使用实时热分析仪rotor-gene 6000 (Corbett,剑桥,英国)。表达式值归一化到管家基因POLR2A放大在同一个样本。
2.5。多路复用免疫测定
VEC文化上层清液样本冷冻和解冻之前只有一次执行的分析细胞因子/趋化因子通过人类细胞因子27-Bio-Plex化验(BioRad实验室、意大利米兰),bead-based多元免疫测定。样本处理供应商的指令后一式两份和阅读Bio-Plex 200仪器配备软件Bioplex经理,使用5个参数不是线性回归公式计算样品浓度标准曲线。
2.6。细胞表面炎症标记物的评估
炎症标记物的表面表达ICAM-1和VCAM-1被流式细胞术分析。总之,细胞分离与trypsin-EDTA,清洗和细胞被resuspended在200年μL (PBS含有1% BSA (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)和孵化30分钟在4°C以下单克隆抗体(mAb): FITC-conjugated anti-ICAM-1(研发、克隆BBIG-I1)或FITC-conjugated anti-VCAM-1(研发、克隆BBIG-V3)。非特异性荧光被孵化与评估isotype-matched共轭马伯[20.,24]。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)功能测量
内皮功能文化分析了上层清液释放利用ELISA试剂盒(Alexis生化药剂,Lausen,瑞士)根据制造商的指示,如前所述11]。测量是在重复进行,结果读450纳米的光密度使用Anthos 2010 ELISA读者(Anthos Labtec仪器Ges.m.b.H)。功能测定的灵敏度2.8 pg / mL,内部和interassay变异系数(CV)和<分别为10%,9%。
2.8。统计分析
描述性统计计算。每组实验中,价值观被报告为意味着±SD和箱形图用来显示中值,最小值,最大值和25日第75百分位数。利用学生的结果进行评估以及和Mann-Whitney rank-sum测试,在适当的时候。斯皮尔曼相关系数的计算来确定数据的相关性。被定义为统计意义。所有与20 SPSS统计软件进行统计分析(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
3所示。结果
3.1。之间的相关性在活的有机体内相关血流动力学参数和在体外Patient-Derived生物特征矢量
在先前的研究中,我们有几个生物特征识别和参数矢量获得手术标本的心血管疾病患者接受静脉功能不全的手术保守和血流动力学治疗门诊(CHIVA) [9]。因为我们有血流动力学测量的可用性进行静脉段,手术切除和派生纯静脉内皮文化(表1),在这项研究中我们表现一组键之间的相关性分析在体外VEC(自发的生物学特性的细胞迁移、增殖指数和基线ICAM-1表达水平,VCAM-1,功能,和跟踪)和两个主要血流动力学参数阻力指数(RI)和回流时间(RT)(表2)。报道在表2补充图1所示,在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/561689,我们发现ICAM-1的表达与RI (VEC负相关),并积极与RT ()以相同的心血管疾病患者的VEC隔离。此外,我们发现之间的负相关在体外VEC扩散和RT (),而功能相关的表达积极与RT值()。此外,还有一个重要的()国际扶轮表达式之间的正相关和轨迹表达式。
3.2。释放的gm - csf Patient-Derived VEC与细胞增殖和炎症标记物的表达
接下来我们分析了27个小组的水平细胞因子或生长因子自发释放的CVD患者派生VEC为了培养确定可溶性因子,这可能有调制作用观察到的生理参数。检测细胞因子之间的利益,自发释放的矢量,只显示gm - csf的水平与自发的内皮细胞增殖显著正相关(;)(图1(一)),与以前的结果突出显示gm - csf在促进血管生成的作用和组织再生16,19]。此外发现显著正相关,TRAIL的表达水平(;)(图1(一))。在相同的方式,自发释放的gm - csf VEC负面的表达水平与病理ICAM-1的表达(;)和VCAM-1 (;),以及与促炎细胞因子的功能(;)(图1 (b))。因此,这些分析表明,gm - csf显示正相关与生物参数(内皮细胞增殖和TRAIL表达),这是一个更好的预后(RI值)和一个与这些参数的逆相关关系(ICAM-1 VCAM-1,和功能表达),这是更糟糕的预后相关(RT值)如表示2。
(一)
(b)
3.3。重组gm - csf增加了在体外细胞增殖和肿瘤坏死因子-变弱α诱导炎性标记物的表达
上面的相关性说明建议,但并不能证明,gm - csf在病理VEC可能有抗炎作用。因此,我们首先研究了重组gm - csf是否能够影响在体外CVD-derived病理VEC的增殖率。事实上,尽管它已经被报道,gm - csf可能proangiogenic活动(25,26),没有信息到目前为止关于这个分子的影响病理VEC隔绝心血管疾病患者。VEC的增殖反应增加浓度的重组gm - csf (20 ng / mL)研究了使用实时和label-free监控基于电阻抗实时细胞增殖的细胞分析(RTCA)。如数据所示2(一个)和2 (b)VEC增殖/存活,是剂量依赖性的方式增加了gm - csf的培养基中添加的最大效应的剂量20 ng / mL(图2 (b))。
(一)
(b)
根据病理VEC暴露的事实在活的有机体内一个促炎环境,在额外的实验中CVD patient-derived VEC文化接触在体外重组肿瘤坏死因子-α为了模仿在活的有机体内炎性微环境。在此设置中,基线水平的表面ICAM-1表达式分析流式细胞术被重组gm - csf待遇不受影响,而表面VCAM-1表达水平的检测极限。另一方面,在接触TNF -α表面的表达ICAM-1和VCAM-1明显诱导(图3(一个))。感兴趣的,在重组gm - csf的存在,TNF -α感应ICAM-1和VCAM-1明显downmodulated (),(图3(一个))。也观察到类似的结果转录水平,通过分析gm - csf的ICAM-1和VCAM-1 mRNA在治疗肿瘤坏死因子-α刺激VEC文化(图3 (b))。
(一)
(b)
最后,在最后一组实验中,我们分析了gm - csf是否能够抑制炎性介质的释放功能。如图4功能,分析蛋白质在文化上层清液(图发布4(一)),以及功能的mRNA水平(图4 (b)TNF - 24小时后)α刺激表现出显著()抑制的gm - csf (20 ng / mL)(数据4(一)和4 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
根据事实大静脉内皮细胞扮演着重要的角色在临床疾病,如心血管疾病、血栓形成(27- - - - - -31日),适当的可用性在体外模型能够恢复当地pathological-related变化表达和释放特定的细胞因子,趋化因子,可溶性介质参与这些疾病的病理生理学可能有一个战略的作用。我们以前证明VEC隔绝CVD患者表现出奇特的炎性病理表型,由特定的定义在体外生物学特性(9]。此外,我们随后发现在这个模型显示血流动力学的参与力量促炎的生成特性基础,特别是可溶性介质的贡献,比如PDGF-BB [10]。
在尝试更好的定义之间的联系有关在活的有机体内血流动力学参数和在体外病态的内皮细胞的特点,在目前的研究中我们已经证明,血流动力学参数RT和RI计算到的静脉段VEC被孤立,与具体在体外生物VEC功能。特别是,我们证明(我)RT值呈正相关的矢量表达式ICAM-1 VEC增殖和功能和负相关指数;(2)RI值呈正相关的矢量表达式小道与ICAM-1的表达呈负相关;(3)基线版本的gm - csf水平通过VEC呈正相关patient-derived VEC扩散和表达水平的小径和反向与ICAM-1的表达水平,VCAM-1和功能。gm - csf对内皮细胞的直接影响然后使用我们的调查在体外病理VEC模型。特别是,我们已经证明,重组gm - csf VEC增殖/存活,能够促进炎性环境介导的肿瘤坏死因子-α,它可以转录down-modulate炎症标记物的表达ICAM-1, VCAM-1已知参与招聘的白细胞,血小板,红细胞静脉壁(32,33]。此外,证明gm - csf可显著对抗的释放功能,表明,gm - csf能够干扰功能的作用在血管生理病理学,显著的临床后果自循环功能水平高与内皮功能障碍在一些病理条件和代表心血管疾病进展的危险因素(11,34]。之前在这方面,我们已经表明,病理VEC的自发释放功能的后果NF-kB较高的基线水平,从而反映了炎症在活的有机体内心血管疾病患者的内皮的状态(9]。
虽然最初确定为造血生长因子,gm - csf是由广泛的细胞类型,包括内皮细胞。在我们的研究中,值得注意的是,以前的报告标准执行在体外内皮的模型基于人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)报道,gm - csf的生产是受血流动力学部队(35]。而且它已经建立了gm - csf能够诱导内皮细胞增殖,并支持和组织再生现象,可能导致内皮毛细血管的形成(16- - - - - -19,36]。然而,内皮细胞的特定血管站点属于可能有至关重要的作用在细胞表型和细胞的生物学行为。因此,值得注意的是gm - csf,内生由内皮细胞时,可以显示病理VEC抗炎活动。
虽然我们意识到这种探索性分析的限制相对较小的样本尺寸检查,由于复杂性从心血管疾病患者获得纯VEC文化中不允许大规模研究[9),我们的研究结果提出了一个重要的联系在活的有机体内血液动力学的部队和在体外病态内皮细胞生物学在CVD的背景下,基础gm - csf的潜在作用调制的促炎症反应CVD patient-derived矢量。根据我们的观察,它还有待建立重组gm - csf的使用,广泛用于人类治疗主要在肿瘤(37和脓毒症38]字段,将是促进心血管疾病的临床缓解期的治疗工具替代外科消融。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
这项工作是由艾米利亚-罗马涅Regione (Programma di ricerca Regione-Universita 2010 - 2012年地区首要战略计划,主题康复领域,项目prua1ri - 2012 - 005)。
补充材料
以下主要在体外VEC的生物特征:细胞迁移、增殖指数和基线ICAM-1表达水平,VCAM-1,功能和轨迹,分析了相关血流动力学参数的关键阻力指数(RI)和回流时间(RT)。相关性分析表明,ICAM-1 VEC文化表达与RI负相关(p = 0.002)和RT呈正相关(p = 0.007)(补充图1)自发的在体外VEC扩散与RT负相关(p = 0.027),而功能的表达用RT值呈正相关(p = 0.013)。此外,TRAIL表达水平显示显著(p = 0.048)和RI(补充图1)正相关。