Subanesthetic剂量的异氟烷在后处理改善Zymosan-Induced中性粒细胞炎症小鼠肺损伤和死亡

文摘

麻醉剂异氟烷(ISO)有免疫调节作用。在目前的研究中,我们调查是否subanesthetic剂量的ISO(0.7%)防止酵母聚糖(ZY)诱导小鼠肺部炎症反应和孤立的中性粒细胞。1和6小时后ZY政府腹腔内,ISO吸入了1小时,24小时后,肺部炎症和损伤评估。我们发现ISO改善小鼠的存活率,减轻肺损伤的组织病理学特征,wet-to-dry重量比,蛋白质泄漏和肺功能指标。ISO显著减毒ZY-induced肺中性粒细胞招募和炎症。(a)的差别这是建议的对这些内皮细胞粘附分子表达和肺组织髓过氧化酶(MPO)活动和多形核中性粒细胞趋化因子(b),和(c) BALF中促炎细胞因子。此外,ZY-induced核易位和NF - dna结合活性κB p65也减少了ISO。ISO治疗抑制伊诺表达式和活动,以及随后的一氧化氮生成。符合这些在活的有机体内观察,在体外研究证实,ISO阻塞NF -κB和伊诺初级小鼠中性粒细胞的激活ZY的挑战。这些结果提供的证据表明,0.7% ISO改善炎症反应ZY-treated鼠肺和主要的中性粒细胞。

1。介绍

多器官功能障碍综合征(插件)导致高发病率和死亡率在重症监护室和是最紧急的和具有挑战性的全球公共卫生问题1,2]。肺是经常第一个器官失败在这种综合症的发展。然而,炎症引起的肺损伤的机制还有待确定,以及治疗方案需要进一步调查。

Zymosan-induced广泛性炎症(吉吉)小鼠模型可以复制很多人类插件的特性,这是许多研究小组采用(3,4]。ZY-induced爆发一些报告表明,炎症反应在小鼠肺气体交换障碍有关,它将以最大的中性粒细胞聚集,渗出物形成,和促炎细胞因子的生产(5- - - - - -7]。ZY被toll样受体2 (TLR-2)免疫细胞(如中性粒细胞),这对核转录因子,随后触发信号级联κB (NF -κB)激活(8]。NF -κB最大需要激活许多促炎细胞因子和趋化因子的表达和伊诺参与急性肺损伤的发病机制9]。

ISO是一个广泛使用的吸入麻醉,施加保护特性主要是通过抗氧化和消炎作用[10,11]。几项研究已经表明,抗炎活性的ISO麻醉浓度(1.2% - -2.5%)与(A)改善肺功能障碍和死亡率(12),(B)减少促炎细胞因子和趋化因子释放,(C)减少多形核中性粒细胞浸润[13),(D)减少NF -κB和诱导一氧化氮synthase-NO (iNOS-NO)途径激活12,14]。然而,ISO在临床麻醉剂量对危重患者有不利影响,不能容忍其血流动力学的影响,包括血管舒张、心肌抑制,心动过缓(15]。在不到1% ISO镇静弱干扰血液动力学,哪个更有利于危重患者在重症监护室16,17]。我们最近的研究表明,在ISO subanesthetic剂量(0.7%)导致抑制炎症反应通过抗氧化活性ZY-induced肺损伤(18]。然而,目前尚不清楚ZY-induced肺损伤小鼠的抑制subanesthetic剂量的ISO推行其抗炎作用。本研究的目的是探讨如何抑制炎症反应的0.7% ISO有助于减弱ZY-induced炎症小鼠的肺损伤的能力。

2。材料和方法

2.1。试剂

所有试剂都是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有说明。NF -κB激活抑制剂(奈)和ISO获得Calbiochem(达姆施塔特,德国)和巴克斯特(百特医疗公司,迪尔菲尔德,IL),分别。在使用前悬浮液都新鲜了。

2.2。动物和治疗

雄性BALB / C小鼠(8周大,重22 - 25 g)被用于这项研究。动物手术的动物实验伦理委员会批准的第四军医大学。安乐死,安乐死戊巴比妥与美国兽医协会的指导方针是相一致的,2007年6月。

炎症反应肺损伤模型建立了无菌腹腔内注射(IP)的ZY(25毫克/毫升悬浮在生理盐水(NS))到老鼠,一剂1克/公斤体重,如前所述[18,19]。动物被放置在一个密封的有机玻璃室流入和流出渠道。同样体积的NS是通过相同的路线注入虚假的控制。老鼠被暴露于ISO通过吸入与前面的研究(18,19]。短暂,ISO是由空气进入燃烧室的速度通过一个管4 L / min。ISO的流量是准确和实时控制的监管麻醉喷雾器(美国哈佛装置)。ISO的浓度的流出管室是连续监测气体分析仪(Bruel & Kjae、Naerum、丹麦),治疗期间保持在0.7%。室中的氧气的浓度维持在21%通过补充氧气和连续监测气体分析仪(医疗气体分析仪LB-2,模型40米;贝克曼,富勒顿,CA)。二氧化碳被从室气体baralyme(盟军保健产品公司,圣路易斯,密苏里州)。动物没有ISO治疗被暴露于室内空气(RA)室的车辆控制。

2.3。中性粒细胞隔离和文化

中性粒细胞分离从健康小鼠外周静脉血使用anti-Ly-6G MicroBead工具包(Miltenyi研究,德国)根据制造商的协议。孤立的中性粒细胞(5×10⁶/毫升)培养如前所述[20.]。所有实验之前,> 99%的细胞被确定可行的生活/死紫(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。

2.4。实验设计

为在活的有机体内研究中,八十只老鼠被随机分配如下(每组;图1(一))。(1)ZY +汽车集团:老鼠注射一个IP的ZY(1克/公斤,溶解在NS的解决方案),其次是吸入RA(车辆)的1 h从1 h和6 h后ZY管理。(2)ZY + 0.7% ISO组织:没有区别ZY +汽车集团,除了1 h吸入ISO从1 h和ZY后6 h代替RA管理。(3)假+汽车集团:没有区别ZY +汽车集团,除了ZY NS(假的)而不是管理。(4)虚假的+ 0.7% ISO组:相同的假+汽车集团,除了1 h吸入ISO从1 h和NS后6 h(假的)管理。后24小时ZY,动物是ZY-induced肺损伤评估。在另一组实验中,动物(每组)被随机分配为生存和监控7天后ZY / ISO或NS / ISO管理。

为在体外主要研究小鼠中性粒细胞被镀在6-well盘子和处理以下试剂(图1 (b)):无菌NS, DMSO, ISO(0.15毫米,等于0.7%),NF -κB激活抑制剂(奈,10M;溶解在DMSO)、z(1.5毫克/毫升),ISO 15分钟ZY (ZY + ISO)后,奈15分钟ISO (ISO +奈)后,奈15分钟后ZY (ZY +奈),或奈ISO后15分钟后15分钟然后ZY (ZY + ISO +奈)。化验NF -κB或伊诺表达式和活动和iNOS-derived没有形成进行45分钟或治疗后18小时ZY / NS / DMSO溶液,分别。

2.5。组织学检查

肺为观察形态学改变收获ZY或NS管理后24小时。受试者与10%福尔马林固定8小时在室温下,嵌入在石蜡,分段在4米厚度。deparaffinization和补液后,部分的顺序与苏木精和伊红染色。组织学变化是由两个独立的病理学家评估的,没有知识的治疗方案收到每个各自的动物。肺损伤的程度在主观量表得分从0到3;0 =没有,1 =轻微,2 =温和,3 =严重。不等规模用于每个组织学特点:水肿、充血和拥堵,中性粒细胞着边和组织渗透,intra-alveolar出血和碎片,和细胞增生。最后的分数将添加单一评价(21]。

2.6。湿/干重比

量化肺水肿的大小,我们评估肺湿/干重量比(W / D)在NS或ZY管理后24小时。收获肺湿重,然后放在烤箱24小时在80°C和重干的时候。肺湿干肺的比例计算(22]。

2.7。蛋白质泄漏

BALF中总蛋白浓度测定用标准的商业工具(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。

2.8。pH /血液气体分析

在NS或ZY管理后24小时,血液采集标本和离心5分钟在室温(1500克)等离子体分离。酸碱平衡和血气分析评估(肺功能指标),动脉血液pH值的水平,PaO₂,PCO₂和pH /血液气体分析仪测定如前所述[23]。

2.9。BALF收集和细胞计数

后24小时ZY或NS, BALF集合是由前面描述的方法(24]。老鼠与戊巴比妥麻醉,气管插管放血后,肺轻轻洗2毫升的PBS。渗出物的数量被减去计算注入量(2毫升)的总量恢复。BALF样本离心机在4°C 500克12分钟,并储存在上层清液°C,以备后续分析的蛋白质和细胞因子水平。此外,细胞颗粒resuspended 1毫升的PBS,总细胞的数量是决定使用血细胞计数器(贝克曼库尔特公司)。微分细胞计数,cytospin幻灯片准备和沾Diff-Quick [25),每一种细胞是由经过认证的实验室技术员蒙蔽的方式。

2.10。测量肺MPO的活性

髓过氧化酶(MPO)活动测量作为一个指示器的中性粒细胞浸润肺组织(如前所述)(26]。在ZY或NS注射后24小时,所有的动物(为每个组)和戊巴比妥牺牲。肺部得到PBS删除所有血液灌注和冷,和肺匀浆上清液准备检测MPO的活性。MPO活性定义由分光光度计测量吸光度的变化(DU 640 b;贝克曼)在590海里,表示单位每克重量的湿纸巾。MPO的活性测定采用商业套件从开曼化学公司购买。

2.11。测量细胞因子和趋化因子的生产

在ZY或NS注射后24小时,BALF细胞因子和趋化因子水平的测量使用商用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(鼠标TNF -α,il - 1β、il - 6高机动组盒1 (HMGB-1) keratinocyte-derived趋化因子(KC)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性protein-2 (MIP-2)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) ELISA试剂盒研发系统,明尼阿波利斯,MN)。光密度(OD)测定在ELISA板扫描仪(CA94089、分子器件、桑尼维尔加拿大)。所有实验根据制造商的指示(27]。

2.12。伊诺测定酶活性

通过监测测量伊诺活动精氨酸转换成瓜氨酸是一个标准的试验如前所述[28]。在预定的时间点(见实验设计或图1),一个整除的肺组织匀浆或中性粒细胞溶解产物孵化与L - (³H]伴随基本基质和代数余子式的精氨酸(四氢生物蝶呤、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄素腺嘌呤二核苷酸,等等),和生产L -³H]瓜氨酸被液体闪烁计数计算。伊诺量化的活动,乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇四乙酸(EGTA)按顺序添加到孵化缓冲区。一个适当的空白需要反应包括1毫米L-NAME(竞争伊诺抑制剂)排除背景的非特异性的影响新陈代谢精氨酸和类似的描述看到我们之前的研究(19]。伊诺瓜氨酸测定的活动是由L-NAME EDTA-EGTA样本的制约程度,及其表达测量使用单位(一个单位= 1 pmol L-citrulline /毫克蛋白/分钟)。

2.13。亚硝酸盐浓度测量

生产的亚硝酸盐(),没有综合的指标,评估使用与格里斯试剂比色反应[29日]。在预定的时间点(见实验设计或图1)、BALF或中性粒细胞文化媒体收集和混合的体积等于(1:1)格里斯试剂(0.1%的N - (1-naphthyl)乙二胺盐酸盐,1%磺胺,和2.5%的H₃阿宝₄)。96孔酶标读者(光谱MAX 340 pc,分子设备)被用来测量吸光度在540海里;数据分析使用Softmax Pro软件。亚硝酸钠是溶解在重蒸馏的水作为标准。

2.14。免疫印迹分析

在24小时ZY或NS注射后,胞质及核的匀浆提取肺组织准备核提取设备(活跃的主题,卡尔斯巴德,CA)。根据制造商的指示,所有运行标准和样品一式三份(29日]。NF -κB p65水平量化在核分数。所有其他的蛋白质含量在胞质分数量化。最终两个提取物(胞质及核内蛋白)煮熟,由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)、electrotransferred硝化纤维膜,然后用兔免疫印迹anti-iNOS多克隆抗体(帕布)(美国微孔,泰梅库拉,CA),兔子anti-NF -κB帕布,兔子anti-IκB帕布(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)。证实了等效样本加载与鼠标反探测β肌动蛋白单克隆抗体(mAb)和兔anti-laminin B马伯(σ、钙、美国)。与增强化学发光检测进行分析工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。

2.15。NF -κB dna结合活性测定

在预定的时间点(见实验设计或图1),NF - dna结合活性κB在肺组织中性粒细胞是量化使用TransAM NF -κB p65转录因子分析工具包(活动主题,卡尔斯巴德,CA)。肺组织的核提取物与核提取工具准备(活动主题)。根据制造商的指示,所有运行标准和样品一式两份(30.]。

2.16。定量实时逆转录酶聚合酶链反应(RT)

在预定的时间点(见实验设计或图1)、肺组织的总RNA或中性粒细胞分离和提取试剂盒Regant(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)制造商的指示。为定量实时逆转录酶聚合酶链反应(RT)分析,与上标总RNA逆转录酶的互补脱氧核糖核酸合成装备(表达载体)。实时定量rt - PCR反应进行iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。引物的序列如下:伊诺,向前5′-AACGGAGAA CGTTGGATTTG-3′和反向5′-CAGCACAAGGGGTTTT CTTC-3′;E-selectin,向前5′-TCTGGACCTTTCCAAAATGG-3′和反向5′-TGCAAGCTAAAGCCCTCATT-3′;VCAM-1,向前5′-TGGAGGAAATGGGCATAAAG-3′和反向5′-CAGGATTTTGGGAGCTGGTA-3′;ICAM-1,向前5′-CGAAGGTTCTTCTGAGC-3′和反向5′-GTCTG CTGAGACCCCTCTTG-3′;为β肌动蛋白,向前5′-TGAGAGGGAAATCGTGCGTG-3′和反向5′-TTGCTGATCCACA TCTGCTGG-3′。PCR设置如下:最初在95°C变性是紧随其后的是25个循环扩增10在95°C和20年代在56°C,随后融化曲线分析,增加温度从72年到95°C。基因表达的定量计算相对β肌动蛋白。

2.17。免疫组织化学

如前所述(执行免疫组织化学31日]。在24小时ZY或NS注射后,肺组织在PBS-buffered 10%福尔马林固定,和5部分从石蜡包埋组织准备。deparaffinization之后,内源性过氧化物酶被0.3%(体积/体积(v / v))过氧化氢在60% (v / v)甲醇30分钟。部分是permeabilized 0.1% (v / v) PBS-buffered Triton x - 100 20分钟。孵化一节在3% (v / v)正常山羊血清在PBS 20分钟以减少非特异性吸附。内源性生物素或亲和素结合位点被顺序孵化15分钟亲和素与生物素(BD生物科学、钙、美国)。一夜之间被孵化的部分与兔子anti-iNOS马伯(BD生物科学、钙、美国、1:500年在PBS, v / v)或与控制解决方案。控制包括缓冲单独或非特异性纯化兔免疫球蛋白G . biotin-conjugated特定次生anti-immunoglobulin G和复杂avidin-biotin过氧化物酶被用来检测特定的标签。验证绑定特异性伊诺,有些部分还孵化与主要抗体只有(无二次抗体)或二次抗体只(没有初级抗体)。在这些情况下,没有发现阳性染色的部分表明了免疫反应是积极的,在所有的实验中进行。

2.18。统计分析

除了组织学评分,所有值都用平均数±标准差表示。生存Fisher精确概率计算的数据测试,用百分比表示。克鲁斯卡尔-沃利斯检验的组织学分析了分数Mann-Whitney紧随其后UBonferroni调整测试。由单向方差分析测试的组间差异,后跟一个最小显著差(LSD)t测试多个比较。GraphPad统计软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)被用来执行数据分析。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Subanesthetic ISO治疗改善ZY-Challenged小鼠的存活率

正如所料,所有的老鼠从假+车辆和假+ ISO组织幸存了下来。两组和无显著差异存在。然而,7天ZY-challenged小鼠的存活率为10%(图2)。吸入0.7% ISO 1小时开始ZY 1和6小时后注射7天存活率从10%提升到50%(图2)。这表明,0.7% ISO治疗可以显著降低ZY-challenged小鼠的死亡率。

3.2。Subanesthetic ISO治疗减轻肺损伤ZY-Challenged老鼠

组织学研究表明,ZY-challenged小鼠有明显的肺损伤表现为肺泡壁增厚,浸润的中性粒细胞在肺间质,整合和肺泡出血(;数据3(一个)和3 (b)),但ISO治疗导致减少炎症反应和明显改善肺架构(;数据3(一个)和3 (b))。没有观察到肺组织学改变从sham-treated老鼠(;数据3(一个)和3 (b))。ZY-challenged老鼠还显示显著增加渗出物体积,wet-to-dry重量比,和蛋白质泄漏与虚假的集团相比,这些增加的肺损伤指标显著降低了ISO治疗(;数据3 (c)- - - - - -3 (e))。此外,老鼠ZY政府导致的标志物水平显著降低肺功能,包括动脉PaO的水平₂,PCO₂,pH虚假的老鼠相比,这些值被ISO治疗(数据规范化3 (f)- - - - - -3(我))。这些结果表明,0.7% ISO治疗减轻了ZY引起的肺损伤。

3.3。Subanesthetic ISO治疗减少ZY-Induced激活NF -κB

NF -κB是一个关键的转录因子最大所需表达的炎症细胞因子在ZY-induced冲击下9]。探讨细胞机制,0.7% ISO减毒ZY-induced治疗肺损伤,我们评价我κB -α退化和核NF -积累κNF - B p65作为标记κB激活。我κB -α水平ZY-treated小鼠肺组织被大幅减少虚假组相比,在治疗ISO阻止ZY-induced我κB -α退化(;数据4(一)和4 (c))。此外,核易位NF -κB p65大幅升高后24小时ZY政府与虚假的集团相比,但这海拔由ISO逆转治疗(;数据4 (b)和4 (d))。化验NF -κB在肺组织中DNA结合活性进一步支持这些发现(;图4 (e))。这些数据表明,在肺NF - ZY结果κB激活ZY-challenged老鼠,这激活被ISO治疗。

3.4。Subanesthetic ISO治疗对细胞因子表达的影响

促炎细胞因子肿瘤坏死因子的水平α(肿瘤坏死因子-α)、白介素1β(il - 1β)、白介素6 (il - 6)和高机动组盒1 (HMGB-1) BALF中显著增加24小时后ZY政府相比,老鼠与虚假的组(;图5)。然而,ISO治疗显著减少促炎细胞因子的生产(;图5)。这些结果表明,ISO治疗降低BALF中促炎细胞因子水平从ZY-challenged老鼠。

3.5。Subanesthetic ISO治疗抑制ZY-Induced伊诺/不生产

没有介导炎症反应,产生高水平的这种伊诺的内源性自由基在诱导炎性刺激(32]。此外,伊诺活动是由NF -κB在老鼠ZY侮辱(33]。大幅提高伊诺表达式通过免疫组织化学方法检测(;图6(一))和免疫印迹(;数据6(b)和6(c))在肺组织后24小时ZY政府而虚假的集团。ISO治疗显著降低肺伊诺表达式(;数据6(一)-6(c))。此外,伊诺活动和BALF水平大幅增加ZY-treated老鼠与sham-operated老鼠相比,这种增加是由ISO治疗显著降低(;数据6(d)和6(e))。数据表明,ISO治疗变弱在ZY-challenged小鼠肺伊诺/不生产。

3.6。Subanesthetic ISO治疗抑制ZY-Induced中性粒细胞招募到肺

ZY-treated老鼠表现出显著增加总BALF中细胞和多形核中性粒细胞在24小时,这个增加是由ISO治疗显著降低(表1)。然而,ZY没有显著影响招聘的淋巴细胞,巨噬细胞和嗜酸性粒细胞进入肺部。

趋化因子发挥重要作用在中性粒细胞浸润到肺部炎症刺激(34]。我们的研究表明,水平的KC, MIP-1α、MIP-2 MCP-1 BALF中显著升高ZY注射后24小时与虚假的群体相比,但这海拔被ISO治疗显著降低(;数据7(一)- - - - - -7 (d))。因为嗜中性粒细胞大量依赖于内皮细胞的激活(35),我们检查了ISO对内皮细胞粘附分子的表达从ZY-treated小鼠肺组织。sham-treated动物相比,ZY E-selectin的肺mRNA水平增加,细胞间粘附分子(ICAM) 1和血管细胞粘附分子1 (VCAM),这增加也显著降低了ISO治疗(;数据7 (e)- - - - - -7 (g))。我们还研究了肺MPO活性作为中性粒细胞浸润的指标后24小时ZY / ISO管理与虚假的治疗。ZY-challenged老鼠的肺MPO活性显著增加,这明显衰减增加ISO治疗(;图7 (h))。总的来说,这些结果表明,ISO治疗抑制ZY-induced中性粒细胞招募到肺部通过调节几个extravasation-associated蛋白质的表达。

3.7。Subanesthetic ISO治疗抑制ZY-Induced NF -κB激活和伊诺活动,没有形成在体外

基于上述发现,中性粒细胞可能代表一个主要组成部分ZY-induced小鼠肺部炎症反应。确定是否调制在中性粒细胞炎症介质,我们测试是否0.7% ISO抑制ZY-induced NF -κ激活,伊诺活动,没有一代。与肺组织实验(数据一致4和6),NF -κB dna结合活性,伊诺活动,iNOS-derived ZY后不增加政府与对照组相比,但被ISO显著减毒治疗(;数据8(一个)- - - - - -8 (d))。ISO +奈治疗进一步抑制伊诺活动,没有代ZY-stimulated中性粒细胞与ISO单独处理(数据8 (b)- - - - - -8 (d))。数据表明,ISO治疗抑制ZY-induced NF -κB和伊诺激活中性粒细胞在体外和NF -κB介导伊诺基因的诱导表达和活动。

4所示。讨论

挥发性麻醉剂ISO已被证明具有抗炎作用。临床使用ISO前景受到阻碍由于不利的系统性影响。然而,我们最近的报告显示,subanesthetic剂量的ISO (0.7% ISO)防止ZY-induced冲击通过上调抗氧化酶(18]。我们扩展我们的发现在这个研究证明0.7% ISO减少小鼠肺损伤的发展挑战与ZY通过抗炎活性。

我们首先检查ISO ZY-mediated血管的病理学的影响在小鼠肺损伤。我们的研究结果表明,管理ISO ZY-induced炎症发作后显著延长生存和降低肺血管损伤。ZY也增加两个指标的肺损伤,肺水含量和蛋白质泄漏。ISO后处理大大减弱这些条件。此外,大量失血PaO ISO预防₂,PCO₂,ZY-challenged老鼠,pH值,进一步提出改善肺功能。我们的研究水平还研究了增强促炎细胞因子(TNF - ZY的关键α,il - 1β,BALF中il - 6和HMGB-1)。ISO治疗是非常有效的减少促炎细胞因子的增强。

在炎症性肺部水肿、血管内皮和上皮损伤伴有中性粒细胞的涌入到间质和支气管肺泡空间。中性粒细胞的激活和轮回中发挥关键作用的进展肺损伤的动物模型和临床数据(36,37]。嗜中性粒细胞浸润肺的趋化因子的控制是一个复杂的网络。仅在我们的研究中,受试者暴露于ZY明显表现出高水平的嗜中性粒细胞化学引诱物(keratinocyte-derived趋化因子、巨噬细胞炎性蛋白1α巨噬细胞炎性protein-2,单核细胞化学引诱物蛋白1)BALF中,这是同时与高MPO活性相关(中性粒细胞浸润的指标)在肺组织中。ISO减毒的积累这些趋化因子和肺的表达下调MPO活动。动物炎症模型还表明,细胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1 E-selection)与中性粒细胞浸润在肺38]。我们的研究表明,老鼠ZY政府上调mRNA的表达ICAM-1, VCAM-1, E-selection肺。我们也观察到,ISO显著降低内皮细胞粘附分子的表达E-selection, ICAM-1, VCAM-1,与先前的研究一致39,40]。

炎症导致的激活增加NF -κB在肺部(41]。在小鼠模型中,诱导中性粒细胞减少的数量明显减少NF -κ那积累在肺细胞的细胞核数量38]。这表明,中性粒细胞在调制NF -很重要κB激活在肺部。在老鼠身上的实验表明,内毒素政府后,核浓度的NF -κB是增加,中性粒细胞积聚在肺部,而外周血中性粒细胞(42]。这种模式的肺与外周血中性粒细胞的激活增加与细胞因子的表达一致,il - 1的表达β和肿瘤坏死因子-α明显增加中性粒细胞分离后肺部炎症刺激。此外,抑制NF -κB激活防止inflammation-induced增加水肿、嗜中性粒细胞浸润和促炎细胞因子表达,在肺部(43]。我们的研究表明,ZY诱导NF -κB在肺组织和纯化主要中性粒细胞活化,促进我κB -α退化和NF -核易位κB p65。然而,ISO治疗大大阻止了NF -κB激活。此外,ZY并未显著提高淋巴细胞,巨噬细胞和嗜酸性粒细胞但增加总BALF中细胞和中性粒细胞。ISO治疗减少总BALF细胞主要是通过抑制中性粒细胞招募。我们的研究结果表明,ISO治疗抑制ZY-activated NF -κB在肺,中性粒细胞可能NF -的主要来源κB。

增强的形成没有涉及伊诺感应后炎症的病理过程与ZY-induced冲击(44]。在这项研究中,我们证明了ISO减毒没有释放,亚硝酸盐水平评估小鼠BALF中ZY-challenged老鼠。影响没有形成与伊诺表达的抑制ISO通过免疫印迹和免疫组织化学。它已经证明了NF -κB介导的诱导伊诺在几个NO-producing细胞类型的基础上,研究伊诺基因启动子的结构(45或抑制剂的NF -κB (46]。此外,5′小鼠伊诺基因的上游序列包含NF -κB结合位点。脂多糖治疗增加绑定活动NF -κB站点,这可能表明NF -易位κB到核(47]。在我们的报告中,ZY也诱导NF -κB绑定活动,伊诺表达式和活动,以及中性粒细胞中没有生成,这都是由ISO显著减毒治疗。NF -κB激活抑制剂阻止这种感应的进气阀打开,没有合成,这表明NF -κB激活介导伊诺的感应ZY-stimulated主要小鼠中性粒细胞。因此,这些结果累计表明ISO减少肺损伤的发展引起的ZY下调核浓度的NF -κB在肺中性粒细胞。

最后的但在我们的研究中最重要的方面是它的临床意义。与临床剂量的ISO预处理,传统上使用,我们有subanesthetic剂量的ISO管理后炎症反应引起的ZY, IP模型可以复制很多脓毒症的特点,而这subanesthetic剂量有效改善小鼠的肺损伤。重要的是,吸入ISO的浓度低于1%被用于重症监护室患者促进机械通气(48]。因此,我们的研究的临床意义管理ISO ZY侮辱后进一步增强了这种治疗方式的吸引力。综上所述,我们的研究结果表明,subanesthetic剂量的ISO有利于ZY-induced肺损伤由于其抗炎行动。目前ISO subanesthetic剂量的研究提供了一条新途径为未来的平移和临床研究,承诺为发展新的治疗方法。

5。结论

目前的研究表明,ZY-induced小鼠肺损伤程度明显减弱subanesthetic剂量的ISO (0.7% ISO)后处理。显然,0.7% ISO减少依赖其抗炎作用:(1)BALF渗出物体积,重量比W / D,蛋白质泄漏,和组织学得分;(2)促炎信号分子的表达和活动NF -κB和间接宾语;(3)BALF水平的促炎细胞因子和趋化因子的表达几个extravasation-associated蛋白质,MPO活性,以及总细胞数在肺部主要通过抑制中性粒细胞招募;(4)最后,ZY-challenged小鼠的死亡率。按照在活的有机体内观察,我们发现0.7% ISO也抑制NF -κB激活和伊诺活动下降,没有形成ZY-stimulated初级小鼠中性粒细胞和NF -κB激活促进伊诺表达式和伊诺活动增加,没有生成。这些在活的有机体内和在体外结果表明小说subanesthetic剂量的ISO为抗炎药理作用的未来。

缩写

BALF:	支气管肺泡灌洗液
ELISA:	酶联免疫吸附试验
HMGB-1:	高机动组盒1
ICAM-1:	细胞间粘附molecules-1
il - 1β:	Interleukin-1β
il - 6:	白细胞介素- 6
il - 10:	白细胞介素- 10”
伊诺:	诱导一氧化氮合酶
知识产权:	腹腔内
ISO:	异氟烷
余:	Keratinocyte-derived趋化因子
马伯:	单克隆抗体
MCP-1:	单核细胞化学引诱物蛋白1
MIP-1α:	巨噬细胞炎性蛋白1α
MIP-2:	巨噬细胞炎性protein-2
插件:	多器官功能障碍综合征
MPO:	髓过氧物酶
奈:	NF -κB激活抑制剂
NF -κB:	核因子-κB
没有:	一氧化氮
NS:	生理盐水
帕布:	多克隆抗体
PBS:	磷酸盐
中性粒细胞:	多形核中性粒细胞
类风湿性关节炎:	室内空气
TLR-2:	toll样受体2
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
VCAM-1:	血管粘连molecules-1
W / D:	干/湿
吉吉:	Zymosan-induced广泛性炎症
ZY:	酵母聚糖。

利益冲突

作者特此声明无利益冲突。

作者的贡献

回族Wang Jing风扇,南临李同样贡献了这个工作。

确认

作者感谢灵王医学麻醉学、解放军150中心医院,帮助他的实验设计。

引用

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