文摘

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见和严重的呼吸道疾病,尤其是老年人,特点是固定的气道阻塞和持续的气道嗜中性。机制,导致这些功能并不完善。我们调查的贡献年龄、吸烟之前,痰中性粒细胞和固定气流阻塞,TLR2表达式,中性粒细胞炎症的标志。诱导痰从成人慢性阻塞性肺病()和健康对照组()检查。痰是分散的部分,总微分细胞计数和记录,可行性和上层清液CXCL8化验,基质金属蛋白酶- 9 (MMP),中性粒细胞弹性蛋白酶和可溶性TLR2。外周血细胞()是刺激和TLR2激活了。与老龄化TLR2含量增加,而痰中性粒细胞和总痰MMP-9水平随着年龄的增加,以前吸烟和慢性阻塞性肺病。在多元回归、TLR2基因表达和MMP-9独立水平显著贡献者的痰中性粒细胞比例调整后在年龄、吸烟之前,和气流阻塞的存在。TLR2刺激导致增强从外周血粒细胞释放MMP-9。TLR2刺激激活中性粒细胞MMP-9释放。努力理解TLR2信号的机制和随后的慢性阻塞性肺病MMP-9生产可以帮助理解中性粒细胞炎症慢性阻塞性肺病。

1。介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一个具有全球意义的疾病在老年人死亡率和发病率的主要因素(1]。吸烟是一个主要的风险因素,全世界有6400万人受到影响,第四死亡最常见的原因(2]。慢性阻塞性肺病的特征是气流阻碍进步和不完全逆转目前的治疗(3]。这凸显了需要更好的理解疾病机制,促进寻找新的治疗方法在慢性阻塞性肺病4]。气道炎症是慢性阻塞性肺病的一个关键要素,通常涉及到持续中性气道炎症(中性支气管炎)。中性支气管炎是持久的,而不是逆转后的刺激,如烟草烟雾和可能导致疾病进展。理解持久嗜中性的机制可能会通知新治疗靶点的识别在慢性阻塞性肺病。

我们之前报道的先天免疫系统的参与气道疾病的特点是中性支气管炎(中性亚型哮喘和支气管扩张)5]。COPD患者[TLR2基因表达水平升高6),在气道细胞表面表达降低COPD患者相比,控制(7,8)暗示疾病相关变更TLR2表达式。老龄化也与气道嗜中性暗示改变老年人的先天免疫反应的作用。目前还不清楚如果中性粒细胞聚集的变化与年龄增长伴随着增强CXCL8和嗜中性粒细胞释放蛋白酶(如东北)。吸烟也诱发和增强中性粒细胞的反应。然而,在多大程度上年龄和过去吸烟等因素影响持续中性支气管炎慢性阻塞性肺病是不确定的。

在这里我们报告调查这些问题。我们假设中性气道炎症和TLR2表达与年龄和过去吸烟会增加,但在慢性阻塞性肺病将进一步监管。我们评估中性粒细胞炎症和相关的嗜中性粒细胞的表达和先天免疫介质同时控制了年龄的影响,吸烟,和气道阻塞的存在和严重性。这些组件的特定失调疾病可能代表未来潜在的目标治疗慢性阻塞性肺病患者。

2。材料和方法

2.1。道德声明

参与者给书面知情同意。猎人新英格兰地区卫生服务和纽卡斯尔大学的研究人类伦理委员会批准了这项研究。

2.2。参与招聘

我们招募了成年人与慢性阻塞性肺病(大于55岁)的三级护理呼吸和睡眠医学门诊服务在约翰亨特医院,新南威尔士、澳大利亚。一群健康对照组(,年了,年,职责。)从社区招募广告。慢性阻塞性肺病的诊断评估通过医生和post-bronchodilator肺量测定法。参与者被排除在外(如果结果不符合postbronchodilator的黄金标准和(3]。

参与者没有报道加重或改变呼吸系统药物治疗前4周和被排除在分析如果他们正在维护口服糖皮质激素()或长期抗生素治疗(四环素、大环内酯物)或有诊断慢性阻塞性肺病的诊断支气管扩张()。进一步排除标准是目前的吸烟(慢性阻塞性肺病,控制)或停止吸烟在过去6个月(控制)。健康对照组没有正常的肺功能和呼吸道疾病的诊断。健康对照组被排除在外,如果他们报道呼吸道症状结合一个或多个的气流阻塞,气道炎症、气道高反应性高渗盐水()。最后一组进行分析包括69名慢性阻塞性肺病患者和51名健康对照组。

2.3。设计

参与者参加了三次。预处理和post-bronchodilator肺量测定法,症状、生活质量,药物使用、吸烟状态,和呼出一氧化碳在访问,评估和痰诱导。在访问两个,皮肤过敏测试和重复痰诱导进行了(如果需要的话)。最后访问一个气息扩散能力测试。痰液处理对炎症细胞计数、基因表达和蛋白质水平的炎症介质,和细菌的分析。一群7有COPD的参与者提供一个额外的外周血样本的隔离和刺激粒细胞和单核细胞调查TLR2的激活在体外。

2.4。生活质量和医疗利用率

生活质量是检验使用SF-36问卷(9]。我们评估医疗利用率要求参与者对他们的访问医院急诊室,全科医生,由于他们的胸部疾病。课程的数量口服糖皮质激素或抗生素的疾病在过去12个月中也记录下来。

2.5。粘液生产和慢性支气管炎

粘液生产指出积极如果参与者报告一个肯定的回答下面的问题:“你咳嗽和产生痰或痰吗?”、“你通常把痰从你的胸部?”,或者“你在你的胸部,通常有痰是很难打开当你不感冒了吗?“慢性支气管炎是评估使用的存在的问题从1978 at / DLD呼吸道症状问卷(10]。

2.6。吸烟的评估

是和吸烟吸烟历史久的确定。参与者接受呼出一氧化碳(eCO)测量,由电化学检测Smokerlyzer (Bedfont、肯特、英国;1磅)的检出限。所有包括参与者的eCO不到10 ppm证实他们不吸烟的状态(11]。

2.7。肺功能测试

参与者保留支气管扩张剂的行动之前测试的持续时间。三个重复的测量与用力肺活量(FVC)得到(可可PD仪表、美国)200年之前和之后的吸入μg舒喘灵通过计量剂量吸入器装有阀的控股室(Volumatic,艾伦和Hanburys,澳大利亚)。这些措施与预测值比较根据努森et al。12]。一氧化碳传递系数(KCO)决心根据at指南(MedGraphics精英DX,医学图形公司、美国)(13]。

2.8。痰归纳和分析

痰诱导与高渗盐水(4.5%)执行如前所述[14]。选择痰(100μL)要么是存储在缓冲区RLT(试剂盒、希尔登,德国)−80°C的RNA提取或分散使用二硫苏糖醇(德勤)。总细胞计数白细胞和可行性进行过滤悬浮液。离心后,上清液是储存在评估CXCL8−80°C,总MMP-9, NE。痰量< 100的时候μL、细胞涂片制备和细胞总数和可行性数据没有收集。Cytospins准备和染色(May-Grunwald染色),和一个微分细胞计数是400年获得nonsquamous细胞。

2.9。痰基因表达

RNA提取自诱导痰液样本使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)和量化使用Quant-iT RiboGreen RNA定量分析工具(分子探针Inc .)表达载体,尤金,或者,美国)。

TLR2基因表达,TLR4使用定量实时聚合酶链反应进行了分析。痰RNA (200 ng)是反向转录的互补和结合TaqMan引物和探针TLR2和TLR4和引用看家基因真核18 s核糖体RNA双实时PCR,如前所述(美国应用生物系统公司7500实时PCR系统)(15]。相对基因表达18 s RNA和内部校准器决心使用方法。

2.10。痰液浮在表面的中介评估

可溶性TLR2、CXCL8和总MMP-9评估使用商业ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)和NE测量InnoZyme人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶Immunocapture活动试验(Kilsyth Calbiochem,默克,维克,澳大利亚)。

2.11。外周血隔离和刺激

外周血收集在柠檬酸钠(18毫升)和粒细胞和单核细胞分数被孤立的使用密度梯度分离(Percoll通用电气医疗、Rydalmere、新南威尔士、澳大利亚)。孤立的细胞培养(细胞/毫升)RPMI1640完成(1% FCS、青霉素、链霉素的0.05%),0.5%的玫瑰(表达载体,Mulgrave,维克,澳大利亚)TLR2和刺激受体激动剂(Pam3CysK4 1000 ng / mL;TLR2受体激动剂;EMC Microcollections,德国图宾根)。浮在表面的游离是24小时后收集的,使用流式细胞术和细胞进行分析或存储在RLT缓冲区(试剂盒,唐卡斯特,维多利亚,澳大利亚)0.01%β巯基乙醇(Sigma-Aldrich,城堡山、新南威尔士、澳大利亚)基因表达的评估。CXCL8, il - 6、IL-1b TNF-a被流仪双珠阵列(美国BD生物科学仪珠数组),数据导出使用FCAP数组从FACSDiva 5软件和分析软件(美国BD Pharmingen)。MMP-9(美国研发系统)和NE(美国Calbiochem),用ELISA测定和分析FluoStar (BMG Labtech,带到,维多利亚,澳大利亚)。TLR2表面表达决心通过添加培养细胞抗体鸡尾酒(TLR2;美国圣地亚哥eBioscience CA, CD16和CD45: BD Pharmingen,北莱德、新南威尔士、澳大利亚)30分钟,和表达与匹配的同形像纠正。细胞被化验FACSCanto二流式细胞分析仪(BD Pharmingen)使用BD FACSDiva 5软件。数据导出使用FCAP数组从FACSDiva 5软件和分析软件(BD Pharmingen)。

2.12。数据分析

数据分析使用占据11(美国占据公司,大学城,TX)。结果报告的意思(SD)或中位数(q1,第三季),除非另有指示。分析使用两个示例Wilcoxon等级和测试,和克鲁斯卡尔-沃利斯检验被用于超过两组。确切概率法是用于分类数据。在体外数据评估使用成对的魏克森讯号等级测试数据。数据之间的关联决定用斯皮尔曼等级相关。预测变量是包含在多元线性回归简单线性回归,已知的年龄和性别的混杂因素包括在所有的模型中。预测变量进行了测试使用占据的同线性方差postestimation通货膨胀因素。流式细胞术相对平均荧光强度(RMFI)值除以生成测试的MFI抗体与同位素匹配控制。所有结果报告为重要,当。

3所示。结果

3.1。研究人群

一百二十名成年人参与了这项研究,包括69名成人慢性阻塞性肺病> 55岁和≥55岁51名健康对照组(29岁健康对照组和22岁< 55岁,年轻健康的控制)。人口和炎性细胞计数数据如表所示1和2,分别。

大多数的参与者与慢性阻塞性肺病中气流阻塞(严重,54%),26(38%)和6(9%),非常严重的类别。使用吸入糖皮质激素是常见(87%),中等(q1, q3)剂量的2000 (1000、2000)μg每日,定期长效beta-agonists 57例(83%),而46(67%)定期tiotropium溴离子。在此之前的12个月内的研究中,77%的人访问了医生为他们的呼吸道疾病,28%已经住院,48%收到了口服糖皮质激素。诱导痰标本质量好收集从58的参与者(92%)、和分析细胞微分和炎症介质进行了只使用那些参与者足够的唾液样本。参与者与慢性阻塞性肺病增加细胞数量和细胞生存能力,增加的比例和数量的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。也有痰淋巴细胞的比例显著降低COPD患者与健康对照组相比(表2)。

3.2。年龄对中性粒细胞炎症和先天免疫的影响中介表达式

检查年龄的影响我们比较年轻,从不吸烟控制与老从不吸烟控制。有一个显著的增加与年龄相关的中性粒细胞炎症被痰中性粒细胞增加(图1(一))和MMP-9(图1 (c))。这些增长是伴随着TLR2基因表达增强(图1 (e))和可溶性蛋白质含量TLR2(图1 (f))。没有CXCL8差异(图1 (d)年轻之间)或痰TLR4基因表达控制(0.11(0.0,0.12))及以上控件(0.13 (0.10,0.17),)。

3.3。吸烟对中性粒细胞炎症和先天免疫介质的影响

检查前吸烟的影响相比,我们从不吸烟控制没有慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺病)exsmoking控制没有()。

exsmoking控制有重要的吸烟暴露17(1.5,45)久,但正常(分别为102%和107%,)和预测KCO %(84%和82%,)。他们已经戒烟平均25年前(范围0.9 - -47.2)SD 18日老,更可能是男性(70%和39%,)。

之前吸烟数量的中性粒细胞升高(图2(一个))和蛋白酶的浓度(MMP-9和东北;数据2 (c)和2 (d))。虽然高,但CXCL8水平(图2 (b))痰上层清液从exsmokers并没有统计上的不同()与从不吸烟者。没有吸烟对痰TLR2基因表达的影响(图2 (e)(图),可溶性TLR2水平2 (f)),或者TLR4基因表达(从未吸烟者:0.11(0.0,0.12)与exsmokers: 0.13 (0.10, 0.17);)。

3.4。慢性阻塞性肺病和中性粒细胞炎症和先天免疫介质之间的联系

接下来我们研究了慢性阻塞性肺病的影响通过比较年长的健康对照组没有与慢性阻塞性肺病慢性阻塞性肺病的参与者。我们发现增加中性粒细胞(图3(一个))和CXCL8(图3 (b))、MMP-9和NE水平(数字3 (c)和3 (d))在固定的气流阻塞。虽然在COPD患者高,TLR2基因表达(图3 (e))和可溶性TLR2(图3 (f))并没有统计上的高水平与健康对照组相比。没有区别在参与者之间痰TLR4基因表达与慢性阻塞性肺病(0.15(0.12,0.20),而年长的控件(0.14 (0.10,0.17,)。

信使rna和可溶性的TLR2在COPD患者与痰CXCL8 mRNA水平显著相关(,,)和蛋白质(,,),MMP-9 mRNA (,,)和蛋白质(,,)、NE mRNA (,,)和蛋白质(,,)。

然后我们比较临床和炎性中度和重度COPD患者预后。虽然类似的年龄、性别、吸烟史(表3),严重慢性阻塞性肺病患者的比例明显高于痰中性粒细胞(图4(一)基因表达(图)以及增加4 (e))和可溶性TLR2的水平(图4 (f))。

3.5。TLR2基因表达水平和总MMP-9中性支气管炎是独立的决定因素

进行多元回归分析,进一步探索中性支气管炎的决定因素在所有参与者和调整其他因素如年龄,性别,和皮质类固醇剂量。痰中性粒细胞明显和独立TLR2基因表达和痰MMP-9水平(表4)。吸烟史、年龄、吸入皮质类固醇剂量和气流阻塞与痰中性粒细胞比例没有显著相关调整后CXCL8, NE,可溶性TLR2的水平。模型是非常重要的和高度解释,调整59.08,。

3.6。外周血细胞TLR2刺激响应性

我们评估TLR2在外周血粒细胞和单核细胞活化7参与者与慢性阻塞性肺病(q1, q3)年龄中值为65(63、67)年,3是男性,exsmokers 4。中位数(q1,第三季度)%预计是51.4 (40.8,60.5)/ FVC是61.9 (42.9,68.0)。TLR2 PBMCs从COPD患者的刺激后,表面和TLR2基因表达增加(数据5(一个)和5 (b))。TLR2基因表达有显著增加而不是表面表达外围粒细胞(数字5 (c)和5 (d))。

3.7。中性白细胞蛋白酶和天生的炎性细胞因子释放后TLR2 COPD外周血细胞的刺激

外周血细胞刺激Pam3CysK4和上层清液检查释放炎性细胞因子和蛋白酶。TLR2刺激导致CXCL8释放的增加、il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-从外周血单核细胞(数字6(一)- - - - - -6 (d))和CXCL8、il - 6和MMP-9粒细胞(数字6 (e)- - - - - -6 (g))。释放与Pam3CysK4刺激(图没有改变6 (h))。

MMP-9和粒细胞不只是评估文化的文化只浮在表面的,他们主要是中性白细胞蛋白酶。

4所示。讨论

本研究评估的决定因素持续中性支气管炎、慢性阻塞性肺病的特征,和老化的作用和吸烟,慢性阻塞性肺病严重程度。TLR2水平升高与衰老有关,更严重的慢性阻塞性肺病。痰中性粒细胞和总MMP-9水平随着年龄的增加,吸烟之前,和固定的气流阻塞。TLR2基因表达和上层清液MMP-9独立水平显著贡献者的痰中性粒细胞比例调整后在年龄、吸烟之前,和气流阻塞的存在。TLR2受体功能活跃在慢性阻塞性肺病外周血粒细胞和单核细胞的刺激导致中性粒细胞和先天免疫系统的关键的释放介质包括MMP-9。这些结果表明先天免疫系统的重要作用在中性支气管炎慢性阻塞性肺病和显示激活的TLR2和随后释放MMP-9可能临界点在中性的规定支气管炎慢性阻塞性肺病。

老龄化、吸烟和气流阻塞都与气道嗜中性。许多研究已经报道相似或循环中性粒细胞数量增加老年人(16),但很少有研究气道中性粒细胞和老年人的炎症有关。托马斯等人报道的一个重要的积极关系检查痰中性粒细胞后中性粒细胞和年龄> 60岁的健康不吸烟的控制,与旧的控制有较年轻健康对照组(中性粒细胞比例的68.5%17]。我们把这些发现通过展示与年龄相关的TLR2基因表达的增加,可溶性TLR2的水平,和MMP-9水平。年龄已被证明没有效果的表达TLR2和4在外周血中性粒细胞使用流式细胞仪(18]。在诱导痰检查中,我们发现,TLR2但不是TLR4基因表达增加老年健康对照组与年轻健康对照组相比,表明TLR2表达式随着年龄的增加。我们还观察到更高水平的可溶性TLR2在老不吸烟控制相比,年轻不吸烟的控制。这些变化可能是呼吸道为中心的先天免疫受体表达的变化和功能随着年龄的增长,这是由最近的动物研究表明增加气道巨噬细胞TLR2表达先进的年龄(19]。

之前吸烟增加气道中性粒细胞释放MMP-9和东北。这些数据扩展先前的报告关系吸烟和肺功能下降,嗜中性和水平的提高CXCL8痰上层清液从年轻的控制,(20.)和高浓度的MMP-9吸烟者与不吸烟者相比(21]。我们观察到类似的效果在exsmokers表明吸烟可能不可逆转地夸大先天免疫反应,导致低品位中性粒细胞炎症、气道疾病的临床表现之前。实际上,当主动吸烟者停止吸烟,MMP-9水平保持不变的(22]。改变MMP-9可以作为与吸烟有关的呼吸道损伤的早期指标由于海拔均无症状exsmokers(如图所示)和吸烟者23),需要进一步研究以确定其适用性与吸烟有关的呼吸道疾病的生物标志物。

中性支气管炎也其他慢性呼吸道疾病,如支气管扩张的一个特征(5),过敏性支气管肺的曲霉病(24),和哮喘的中性亚型25]。在这些疾病有中性粒细胞炎症介质水平增加(CXCL8),中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和基质金属蛋白酶- 9 (MMP)和强大的协会之间观察到的表达这些介质和高架痰中性粒细胞的数量。这表明可能存在共同机制导致呼吸道疾病和慢性阻塞性肺病(持续性嗜中性26- - - - - -28),在这项研究中我们观察到类似的增加中性粒细胞炎症介质和介质之间的联系和痰中性粒细胞比例。在细胞培养系统中,中性粒细胞释放MMP-9 CXCL8的存在,和不可以诱导CXCL8,这表明中性粒细胞可以延续自己的积累和激活(29日,30.]。

可能的解释这一特定增强中性粒细胞炎症可能在于参与者风险的累积效应。这些风险不仅包括烟草烟雾,但也可能其他污染物或过去感染可诱导表观遗传改变,和这些可能需要进一步调查31日]。假设提出的“多个炎症支安打”最初Pavord et al .,在严重的难治性哮喘32],或许可以解释疾病参数在这项研究中,观察到的变化与慢性阻塞性肺病比exsmoking炎症“点击率”或不吸烟的控制。

慢性阻塞性肺病人口在这个研究主要是处理维护吸入糖皮质激素是常见的慢性阻塞性肺病和推荐。一小部分的COPD患者显示支气管扩张剂反应评估,那天,约25%有痰嗜酸性粒细胞比例超过3%的建议进一步与吸入糖皮质激素治疗或评估管理可能会被考虑。虽然这些特征的哮喘患者,哮喘是慢性阻塞性肺病的发展也是一个重要的危险因素;因此这不是一个令人惊讶的结果。大约一半的人口研究是过敏性慢性阻塞性肺病。在最近的一项研究中存在特异反应性慢性阻塞性肺病与增加呼吸道症状和更有可能有一个决议与布地奈德治疗的症状(33),特异反应性的存在被认为是一个“小”的定义标准哮喘或慢性阻塞性肺病重叠(34]。

其为病原体迅速激活先天免疫反应的分子模式,这是高度保守的微生物因素。他们被模式识别受体等toll样受体(通常),CD14、collectins [35]。TLR激活触发信号级联,导致激活和NF -核易位κB导致促炎细胞因子反应包括TNF -、引发和il - 1β(36,37]。

TLR2的刺激诱导TLR2基因表达增加外周血粒细胞和嗜中性粒细胞增加释放化学引诱物CXCL8和中性白细胞蛋白酶MMP-9,而外周血单核细胞的细胞的刺激导致TLR2基因和表面表达的增加以及释放CXCL8和天生的细胞因子TNF -和il - 1β。这项研究是一个限制,我们不能显示TLR2气道细胞的激活。我们以前报道,痰液细胞是耐火材料与LPS刺激可能是由于细胞已经被最大限度地激活,是否这发生在呼吸道的痰诱导过程中需要进一步研究[38]。

我们延长·冯·舍勒的发现等。8]表明可溶性TLR2水平进一步升高严重而温和的慢性阻塞性肺病,与慢性阻塞性肺病参与者,可溶性TLR2水平与痰CXCL8水平密切相关,这是中性粒细胞化学引诱物的关键。可溶性TLR2的水平与水平的提高MMP-9 NE,它是可能的,这些蛋白酶可能断开TLR2从细胞水平增加可溶性形式和影响反应的受体激动剂受体的能力。刺激的TLR2兴奋剂Pam3CysK4已被证明诱导MMP-9生产其他类型的细胞,如THP-1细胞和角化细胞(39];我们的工作扩展了这些观察结果表明,刺激粒细胞Pam3CysK4也诱发的投影MMP-9并建议TLR2的潜在影响航空公司的组织重建和修复。糖皮质激素也能加强在气道上皮细胞TLR2响应(40- - - - - -42),因此重要的是,进行进一步的研究来阐明各种类固醇的影响在慢性阻塞性肺病TLR2表达式和响应性。

动物研究也支持关键角色TLR2的行列式气道嗜中性。TLR2(但不是TLR4)表达式是增加侵染诱导的肺巨噬细胞在小鼠模型上中性过敏性气道疾病(43]。在模型的有机dust-induced气道炎症,TLR2基因敲除小鼠气道中性粒细胞显著减低,il - 6、TNF -,CXCL-1(鼠标CXCL8同族体)与野生型相比控制表明气道炎症是依赖TLR244]。这是我们观察到的相同模式的细胞因子在外周血细胞TLR2刺激后COPD患者和慢性阻塞性肺病患者诱导痰液样本。

总之,我们已经表明,气道嗜中性和MMP-9增强与年龄、吸烟和慢性阻塞性肺病的存在。痰TLR2基因表达显著增加了年龄之前但不吸烟;然而这是增强在慢性阻塞性肺病和慢性阻塞性肺病严重程度增加。TLR2基因表达和MMP-9水平分别是痰中性粒细胞的重要的独立的预后因子和受体被显示功能,可以激活诱导释放MMP-9和CXCL8粒细胞以及天生的细胞因子il - 1β和肿瘤坏死因子-从单核细胞。这些结果扩展我们对角色的理解先天免疫应答的诱导嗜中性气道疾病和发展的有效治疗提供新的见解。

确认

作者要感谢的技术支持Calida加赛德凯利钢铁、丽贝卡·奥尔德姆,米歇尔·格里森和凯莉假货在样本的收集和处理。