抑制作用的天然抗炎化合物慢性静脉疾病Patient-Derived内皮细胞释放的细胞因子

文摘

大血管内皮细胞扮演着重要的角色在临床疾病,如慢性静脉疾病(CVD)和血栓形成;从而描述CVD静脉血管内皮细胞(VEC)在确定具体的治疗目标的战略作用。在此基础上我们评估天然抗炎化合物的影响α-酸和Ginkgoselect phytosome细胞因子/趋化因子释放的CVD patient-derived矢量。为此,我们为特征的水平的细胞因子/趋化因子(健康对照组相比)在心血管疾病患者的血浆VEC纯化及其释放相同的患者,如果和TNF -α刺激条件。VEC在释放的细胞因子/趋化因子,系统配置文件(引发,TNF -完成αgm - csf,正-α2 g - csf MIP-1β、VEGF、EGF Eotaxin、MCP-1 CXCL10, PDGF和咆哮),我们确定了的目标体外治疗α-酸和/或Ginkgoselect phytosome (gm - csf, g - csf, CXCL10、PDGF和咆哮)。最后,通过调查所涉及的细胞内途径促进VEC释放细胞因子/趋化因子,天然抗炎化合物的目标,我们记录α-酸明显抵消TNF -α全身的NF -B和p38 MAPK /激活的影响银杏叶似乎主要是由Akt介导的。我们的数据心血管疾病发病机理的分子机制提供新的视角,强调新的潜在的治疗靶点。

1。介绍

虽然α-酸已经首先探讨了天然抗氧化剂的光属性和其诱导细胞凋亡的能力在一些肿瘤细胞系(1,2),治疗的意义与其临床使用广泛地查阅相关基础总体有利影响一些病理条件如糖尿病和动脉粥样硬化3,4]。在假定的细胞治疗的目标α-酸、内皮间也被认为是和一些报告建议的保护作用α-酸对内皮细胞损伤(5]。在相同的方式,银杏叶提取衍生品已经在“标准”评价内皮细胞模型(如人类脐静脉内皮细胞,HUVEC)作为血管保护剂减弱氧化应激损伤(6]。

内皮细胞来源于不同的解剖区异构的抗原表达的模式,分泌的分子,因此免疫属性和常见在体外内皮细胞模型,如HUVEC,不能恰当地概括在活的有机体内病理内皮的特性。在这种情况下,大型静脉内皮细胞的反应被认为扮演重要角色在临床疾病,如慢性静脉疾病(CVD)和血栓形成(7,8]。内皮积极反应当地环境的变化而表达和释放特定的细胞因子,趋化因子,和可溶性化学介质,反过来,扮演一个角色在心血管疾病的病理生理学9- - - - - -12]。心血管疾病患者的治疗选项从保守治疗,微创方法,手术治疗;然而心血管疾病仍然是一个疾病复发率高的(13]。

在目前的研究中,我们已经解决了天然化合物α-酸和银杏叶可能有一个角色在治疗心血管疾病通过直接影响病理内皮,通过血管内皮细胞(VEC)隔绝患者心血管疾病的不同阶段。特别是,我们已经评估了天然化合物的抗炎作用α-酸和Ginkgoselect phytosome细胞因子/趋化因子释放的CVD patient-derived矢量。为了这个目的,我们首先为特征的系统性水平面板广泛的细胞因子/趋化因子()等离子体CVD患者影响的正常健康对照组和VEC净化这些细胞因子/趋化因子的释放同样的心血管疾病患者,如果和TNF -α刺激条件。最后,我们调查了细胞内信号转导途径参与VEC释放细胞因子/趋化因子,促进目标的自然抗炎化合物。总的来说,本研究报告的数据为心血管疾病发病机理的分子机制提供新的见解,强调新的潜在的治疗靶点。

2。材料和方法

2.1。招募的病人和样本收集

心血管疾病患者的主要人口/临床特点加入这项研究报告(见补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/423407)。前臂血液样本的患者主要心血管疾病影响浅静脉回流(C2-4EpAsPr CEAP分类后)收集的柠檬酸钠静脉曲张手术前。血样立即离心机的等离子体隔离存储在一次性整除−80°C。从健康受试者血浆样品收集被用作控制。在手术过程中手术标本收集的保守和血流动力学治疗门诊静脉功能不全。VEC文化从心血管疾病患者获得高纯度孤立和形态和表型特征属性,如前所述[14]。接下来的程序是符合赫尔辛基宣言,机构审查委员会批准(费拉拉大学医院)和所有参与者主体给书面知情同意。

2.2。内皮细胞培养和治疗

Patient-derived内皮细胞内使用通道3 - 7所示。细胞生长在EGM2介质(Lonza Walkersville, MD)和2%的边后卫和补充完整(EGM2子弹装备,Lonza) 5μ克/厘米²纤连蛋白涂层组织培养板(BD,正欲圣何塞CA),如前所述[15]。

内皮细胞治疗,以下试剂已使用:重组肿瘤坏死因子(TNF)α(研发系统、明尼阿波利斯、MN) Ginkgoselect phytosome,和α-酸(请提供的劳务公司。,Milano, Italy) were dissolved in distilled water and in dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma, St. Louis, MO), respectively, and at a final concentration such that the DMSO did not exceed 0.1% in the cell culture media. The optimal concentrations of TNF-α(5 ng / mL), Ginkgoselect phytosome,和α-酸(同时使用100μg / mL)在初步确定剂量反应实验。Ginkgoselect phytosome和α-酸添加到细胞与肿瘤坏死因子- 1小时前治疗α。在选定的实验中,细胞preincubated 1小时ERK1/2药理抑制剂(PD98059;50μM;Calbiochem拉霍亚,CA), p38 MAPK / (SB203580;10μM;Calbiochem), NF -B (Parthenolide;10μM;恩佐生命科学,埃克塞特,英国),和一种蛋白激酶(mk - 2206;5μM;BioVision合并,苗必达,CA)通路之前的TNF -α。从内皮细胞收集上层的文化和冻结在−80°C(描述16),直到细胞因子分析。

2.3。评估细胞的生存能力和细胞表面炎症标记物

细胞生存能力是由光显微镜分析监控hematoxylin-eosin染色后细胞的单层膜或分离后通过定量检查层通过台盼蓝染料排斥、描述(17,18]。炎症标记物的表达的概要ICAM-1和VCAM-1分析流式细胞术如前所述[19]。总之,细胞分离trypsin-EDTA和洗5×10⁵细胞被resuspended在200年μL (PBS含有1% BSA (Sigma-Aldrich)和孵化30分钟在4°C以下单克隆抗体(mAb): FITC-conjugated anti-ICAM-1(研发、克隆BBIG-I1)或FITC-conjugated anti-VCAM-1(研发、克隆BBIG-V3)。非特异性荧光被孵化与评估isotype-matched共轭马伯[20.]。

2.4。分析细胞因子和趋化因子的血浆和细胞培养上清液

文化上层清液样品和等离子体患者冷冻和解冻之前只有一次执行MILLIPLEX映射人类细胞因子/趋化因子面板(默克密理博、Billerica MA), bead-based多元免疫测定,它允许同时量化以下29人类细胞因子:表皮生长因子,il - 1βil - 1、il - 1受体拮抗剂(ra)α2、IL-3 il - 4、IL-5 il - 6, IL-7,引发,il - 10、il - 12 (p40)、白介素(p70) IL-13, IL-15, 1 l-17a EOTAXIN, g - csf, gm - csf,干扰素α2,干扰素,γ,MCP-1 CXCL10 MIP-1α,MIP-1β肿瘤坏死因子-α肿瘤坏死因子-β和VEGF。此外,定制的MILLIPLEX映射人类细胞因子/趋化因子磁珠面板(默克密理博)被用来量化细胞因子PDGF-AB / BB和咆哮。文化上层清液样本处理后,制造商的协议和推荐阅读MAGPIX仪器配备MILLIPLEX-Analyst软件使用5个参数非线性回归公式计算样品浓度标准曲线。

2.5。在内皮细胞磷蛋白质和蛋白质印迹

MILLIPLEX映射人类Multi-Pathway 9-plex磁珠信号设备磷蛋白质被用来检测磷酸化ERK /更改MAP激酶1/2 (Thr185 / Tyr187),一种蛋白激酶(Ser473), STAT3 (Ser727)、物(Thr183 / Tyr185), p70 S6激酶(Thr412), NF -B (Ser536) STAT5A / B (Tyr694/699), (Ser133),分子和p38 (Thr180 / Tyr182)内皮细胞溶解产物使用Luminex系统,根据制造商的指示。短暂,内皮细胞被镀在100 mm盘子,在subconfluence成长,受到部分FCS减少(0.5%)18小时的治疗。细胞收获MILLIPLEX映射中裂解缓冲的蛋白酶抑制剂鸡尾酒III (Calbiochem)。每个溶菌产物(20μg总蛋白)被稀释在MILLIPLEX地图分析缓冲2,一夜之间在4°C的环境中,根据制造商的说明和分析。的平均荧光强度(MFI)与Luminex系统测量。

验证人类multipathway MILLIPLEX地图数据,我们表现免疫印迹分析如前所述21,22]。短暂,收获细胞裂解缓冲中含1% Triton x - 100, 150毫米氯化钠,50毫米Tris-HCl pH值6.8,蛋白酶抑制剂(蛋白酶抑制剂鸡尾酒;罗氏诊断)。蛋白质测定是由布拉德福德化验(Bio-Rad,里士满,CA)。等量的蛋白质(50μg)为每个样本在丙烯酰胺凝胶迁移,在硝化纤维过滤器,玷污和探测第二抗体ERK1/2的磷酸化形式,p38 MAPK、总蛋白激酶和德国产业投资银行和各自的内容进行验证加载均匀度:anti-phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)和anti-p44/42 MAPK (ERK1/2)(从细胞信号技术,丹弗斯,MA);anti-phospho-p38 / MAPKinase和anti-p38 / MAPKinase(从细胞信号技术,贝弗利,MA);anti-phospho-Akt和anti-Akt(来自默克密理博);anti-IkB(从圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)和antitubulin (Sigma-Aldrich)。孵化后peroxidase-conjugated anti-mouse和anti-rabbit免疫球蛋白,具体反应了ECL闪电探测设备(珀金埃尔默,波士顿,MA)。微ImageQuant TL值估计的软件(通用电气医疗集团生物科技AB,乌普萨拉,瑞典)。多个电影曝光被用来验证样本的线性分析和避免饱和的电影。

2.6。统计分析

描述性统计计算。每组实验中,价值观被报告为意味着±标准差(SD)。利用学生的结果进行评估以及和Mann-Whitney rank-sum测试,在适当的时候。所有与20 SPSS统计软件进行统计分析(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。值< 0.05时被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。描述的原生质的水平的细胞因子和趋化因子在心血管疾病患者和静脉内皮的潜在贡献

在第一组实验中,我们试图调查的模式循环细胞因子/趋化因子在心血管疾病患者。为此,等离子体CVD患者手术前收集的样本的保守和血流动力学治疗静脉功能不全的门诊和分析小组的31个细胞因子/趋化因子参与炎症和/或血栓形成的过程。总的来说,心血管疾病患者(平均年龄)的特点是一个意味着疾病的持续时间年;另外73%的人表现出心血管疾病家族史与其他变量的发病率相关并发症,如糖尿病,高血压,高胆固醇血症,和心脏疾病(补充表1),其中31个细胞因子/趋化因子分析了多元分析,18检测在等离子体CVD患者和健康对照个体的样本:MIP-1α,引发IL-7干扰素-γ白介素(p70)、肿瘤坏死因子-αgm - csf,干扰素-α2 g - csf IL-1RA MIP-1β、VEGF、EGF Eotaxin、MCP-1 CXCL10, PDGF和咆哮(表1)。兴趣,小组内的细胞因子和趋化因子检测等离子体水平,12 (MIP-1α引发,TNF -αgm - csf,干扰素-α2,MIP-1β、VEGF、EGF Eotaxin MCP-1, PDGF和咆哮)显著()在心血管疾病患者与健康对照组2增加额外的细胞因子(g - csf和CXCL10)(表显示水平接近意义1)。这些数据表明这些细胞因子/趋化因子的潜在作用的发病机理和/或疾病的进展。


细胞因子/趋化因子	等离子体水平(pg / mL)^一个		检测极限(pg / mL)
细胞因子/趋化因子	控制	心血管疾病患者	检测极限(pg / mL)

il - 10	<可怜	<可怜
白介素(p40)	<可怜	<可怜	1.1
IL-13	<可怜	<可怜	7.4
IL-15	<可怜	<可怜	1.3
IL-17A	<可怜	<可怜	1.2
il - 1	<可怜	<可怜	0.7
il - 1	<可怜	<可怜	9.4
- 2	<可怜	<可怜	0.8
IL-3	<可怜	<可怜	1.0
il - 4	<可怜	<可怜	0.7
IL-5	<可怜	<可怜	4.5
il - 6	<可怜	<可怜	0.5
肿瘤坏死因子-	<可怜	<可怜	0.9
MIP-1	0 ()	13 ()* *	1.5
引发	2.2 ()	14.4 ()*	2。9
IL-7	2.7 ()	3.7 ()	0.4
干扰素-	3.18 ()	2.5 ()	1.4
白介素(p70)	3.2 ()	3.5 ()	0.8
肿瘤坏死因子-	3.3 ()	6.9 ()* *	0.6
gm - csf	4.6 ()	5.9 ()*	0.7
干扰素-2	9.5 ()	15 ()*	7.5
g - csf	16.9 ()	29.2 ()	2。9
IL-1RA	18.3 ()	16.7 ()	1.8
MIP-1	19.6 ()	50 ()* *	8.3
VEGF	29.2 ()	64.6 ()* *	3所示。0
表皮生长因子	36.6 ()	95.4 ()*	26.3
Eotaxin	48.6 ()	251 ()* *	2。8
MCP-1	161 ()	224 ()*	4.0
CXCL10	195 ()	244 ()	1.9
PDGF	2770 ()	9369 ()*	8.6
激昂的演说	10414 ()	45399 ()*	2。2

值表示为中位数(平均数±标准差);<可怜:探测范围的(下图)。;;。

评价病理内皮的作用建立循环细胞因子/趋化因子水平的增加描述心血管疾病,我们有孤立VEC从手术标本病理获得相同的心血管疾病患者循环细胞因子/趋化因子分析(补充表1和表1)。VEC文化特征,定义为CD31⁺/ CD105⁺/ CD146⁺/ CD144⁺/ CD45⁻/ CD14⁻细胞,如前所述9),评估基线版本相同的面板的31个细胞因子/趋化因子评估等离子体CVD患者的样本。在这方面,应该注意到,由于VEGF和EGF VEC培养基是必不可少的组成部分,它是不可能区分体内增加VEGF和EGF内生产生的细胞因子。感兴趣的,在细胞因子/趋化因子可检测在心血管疾病患者的血浆(表1),只有MIP-1α无法在VEC文化上层清液(表吗2),而引发,IL-7干扰素-γ白介素(p70)、肿瘤坏死因子-αgm - csf,干扰素-α2 g - csf IL-1RA MIP-1β,MCP-1 Eotaxin CXCL10、PDGF和咆哮被释放在不同级别(表2)。VEC表示这组数据表明,一个主要的细胞类型导致的生产心血管疾病患者的血浆的细胞因子/趋化因子。


细胞因子/趋化因子	释放水平(pg / mL / 24小时)^一个	检测极限(pg / mL)

MIP-1	<可怜	2。9
引发	2616 ()	0.4
IL-7	11.6 ()	1.4
干扰素-	2.1 ()	0.8
白介素(p70)	2.8 ()	0.6
肿瘤坏死因子-	1.8 ()	0.7
gm - csf	8.2 ()	7.5
干扰素-2	9.1 ()	2。9
g - csf	49 ()	1.8
IL-1RA	10.4 ()	8.3
MIP-1	4 ()	3所示。0
VEGF	ND	26.3
表皮生长因子	ND	2。8
Eotaxin	10.2 ()	4.0
MCP-1	8663 ()	1.9
CXCL10	20.5 ()	8.6
PDGF	1399 ()	2。2
激昂的演说	31日()	1.2

值表示为中位数(平均数±标准差);<可怜:(下图)的探测距离;内皮的ND:没有可测,因为组件的媒介。

根据病理VEC暴露的事实在活的有机体内一个促炎环境(7- - - - - -11,14),我们发现一个重要的肿瘤坏死因子-)海拔原生质的水平α在心血管疾病患者中,VEC文化受到进一步的实验在体外重组肿瘤坏死因子-α为了模仿在活的有机体内炎性微环境。只有那些细胞因子/趋化因子显示平均增加≥2倍被认为是(图1)。这八个细胞因子/趋化因子组合的基础上成倍增加:MIP-1β、PDGF和干扰素-α2(2和3之间的意思是成倍增加),g - csf和引发(10至20的意思是成倍增加)和gm - csf CXCL10,咆哮(100年和300年之间的意思是成倍增加)(图1)。

(一)

(b)

(c)

图1

在体外 α α 细胞因子/趋化因子释放VEC在病理肿瘤坏死因子-。内皮细胞暴露在TNF - 24小时(5 ng / mL)在分析细胞因子/趋化因子释放文化上层清液。结果表示为褶皱感应对未经处理的文化(设置为1)。只有细胞因子/趋化因子显示出褶皱的感应2已报告。数据意味着±SD VEC从所有心血管疾病患者的结果。

3.2。特定的细胞因子/趋化因子的释放VEC不同抑制了病态α-酸和Ginkgoselect Phytosome

在第二组实验中,我们调查是否自然化合物抗炎α-酸(23- - - - - -28),银杏叶衍生品(29日,30.)影响病理VEC的释放细胞因子/趋化因子。事实上,尽管它已经被报道,这两个化合物,特别是α-酸,具有抗炎活性在体外和在活的有机体内在内皮细胞生物学的背景下不同的病态23- - - - - -27),还有待确定这些化合物是活跃在病理VEC孤立的心血管疾病患者。因为两个化合物已被证明可能影响内皮细胞的生存31日- - - - - -35),我们开始通过分析VEC暴露于不同浓度的形态和生存能力(最高可达250μ为每个化合物)的g / mLα-酸和Ginkgoselect phytosome 24小时。如图2(一个),形态分析没有揭示100浓度的毒性作用μg / mL,当化合物与重组TNF -单独或一起使用α。缺乏毒性表示定量细胞形态学证据证实了可行性分析(图2 (b))。此外,预曝光为1小时α-酸和Ginkgoselect phytosome(同时使用100μ之前,g / mL)的重组TNF -α24小时,显著()抑制肿瘤坏死因子-α介导的诱导的炎性标志物VCAM-1和ICAM-1(图2 (c))。因此,100年的浓度μg / mL的化合物被选为进一步实验。的确,有确认α-酸和Ginkgoselect phytosome施加抗炎活动也在病理VEC诱导特定的毒性(图2),我们分析了这两个化合物的影响具体病理VEC释放细胞因子/趋化因子。如图3(一个),在体外治疗α独自-酸能显著减少PDGF的基线水平,咆哮,和CXCL10, Ginkgoselect phytosome单独只抑制基底PDGF。此外,预处理(1小时)α-酸和Ginkgoselect phytosome之前添加TNF -α大幅下调释放肿瘤坏死因子-α全身的PDGF,咆哮,CXCL10(图3 (b)),而α-酸,但不是Ginkgoselect phytosome,显著抑制肿瘤坏死因子-α全身释放g - csf和gm - csf(图3 (b))。因此,α-酸表现出更广谱的抑制活性比Ginkgoselect phytosome。另一方面,其他细胞因子/趋化因子调节的释放肿瘤坏死因子-α(IFN -α2,MIP-1β,引发)影响α-酸或Ginkgoselect phytosome(数据没有显示)。

(一)

(b)

(c)

图2

α α α μ α α α 缺乏细胞毒性和抗炎作用-酸和Ginkgoselect phytosome CVD-VEC模型。内皮细胞暴露在TNF -(5 ng / mL), Ginkgoselect phytosome,和-酸(在100g / mL)单独或组合使用(1小时的预处理与Ginkgoselect phytosome和添加TNF -前-酸)和分析后24小时的治疗。在(a)、代表性领域的文化视为表示后,光学显微镜观察苏木精和伊红染色。在(b),细胞生存能力的比例显示为未经处理的文化(Untr)设置为100%。数据报告为±SD三个独立的实验手段。在(c),数据表示为平均荧光强度(MFI)减法vehicle-treated背景荧光的细胞。结果报告为±SD四个独立的实验手段。相对于车辆和TNF -处理矢量;相比汽车VEC治疗。

(一)

(b)

图3

α α α α α α 抑制对细胞因子/趋化因子释放的影响在病理VEC -酸和Ginkgoselect phytosome文化。细胞因子/趋化因子水平以文化上层的内皮细胞治疗24小时-酸或Ginkgoselect phytosome单独使用或结合TNF -(1小时的预处理-酸或Ginkgoselect phytosome之前添加TNF -)(b)。结果表示为褶皱感应对未经处理的文化(设置为1)。数据表示为±SD方法。而未经处理的(a)或TNF -对待文化(b)。

3.3。不同的细胞内信号通路调节细胞因子/趋化因子通过病理VEC释放

在最后一组实验中,我们调查了细胞内信号通路调节释放各种细胞因子和趋化因子的文化病态VEC的上层清液和的目标α-酸和/或Ginkgoselect phytosome。符合之前的报道显示各种细胞内途径的激活TNF -α治疗(36),我们发现,暴露的VEC文化重组TNF -α导致时间激活/磷酸化的几个信号通路等物,p38 MAPK、ERK1/2, NF -B和Akt、STAT3和分子(图4(一))。值得注意的是,α-酸显著抑制NF -B和p38 MAPK通路在两个不同的时间点(图4 (b))。另一方面,Ginkgoselect phytosome显著抑制p38 MAPK和Akt通路在两个不同的时间点,虽然是低效率的α在抑制NF - -酸b没有调制其余两种化合物是有效的途径分析和图所示4(一)。根据上面的数据说明,证明α-酸更强大的比Ginkgoselect phytosome在抑制细胞因子和趋化因子的释放,TNF -自发或反应α表明,NF -B途径促进肿瘤坏死因子-中扮演主要的角色α诱导细胞因子和趋化因子介导的。为了证实这个问题,在最后一组实验中,细胞与药理抑制剂特定preincubated NF -B p38 MAPK / Akt, ERK1/2通路前1小时TNF -α加法。如图5PDGF的释放,g - csf,咆哮,gm - csf,和CXCL10被Parthenolide显著降低,抑制NF -的人B通路,它显示一个重叠的抑制与模式α-酸(图3),从而确认NF -的重要角色在调节肿瘤坏死因子的B -α全身释放的一些细胞因子/趋化因子NF -的作用B为最主要的细胞内途径的目标α-酸。有趣的是,人们的选择性抑制剂/ MAPK通路SB203580也显著抑制g - csf的释放,gm - csf, CXCL10,表明这个途径也可能导致释放细胞因子/趋化因子矢量。最后,Akt通路的抑制剂诱导选择性抑制PDGF的咆哮,CXCL10(图5),显示一个明确的重叠的抑制活性Ginkgoselect phytosome(图3)。一致,Akt通路代表的一个主要目标Ginkgoselect phytosome(图4 (b))。不同的特异性抑制剂的通路激活TNF -α验证了免疫印迹(见补充图1在网上补充材料)。

(一)

(b)

图4

α α α α α μ α α α α α 多元分析的分子途径激活CVD-VEC TNF -的反应刺激:调节的影响-酸Ginkgoselect phytosome。内皮细胞治疗不及时治疗(Untr)或TNF -(仅5 ng / mL) (a)或结合-酸和Ginkgoselect phytosome(预培养1小时-酸和Ginkgoselect phytosome在100年g / mL之前添加TNF -;(b))分析磷蛋白质水平由Luminex系统和表达为平均荧光强度(MFI)。在(a),内皮细胞治疗肿瘤坏死因子-指定的时间点和细胞溶解产物化验了磷蛋白质激活。未经处理的细胞。VEC文化(b),进行了1小时-酸和Ginkgoselect phytosome之前与TNF -刺激为指定的时间点。细胞溶解产物化验了磷蛋白质诱导和结果表示为意味着±SD样本化验在四个独立重复实验。相比,细胞治疗肿瘤坏死因子-一个人。

图5

α μ μ μ μ μ α α 微分药理抑制剂对细胞因子/趋化因子的影响在病理VEC在回应TNF -。与SB203580矢量进行了1小时(10PD98059(50米)Parthenolide(10米)SP600125(5米)米),mk - 2206 (5米)之前的TNF -(5 ng / mL)。分析了24小时后,细胞培养上清液对细胞因子/趋化因子释放细胞数量和规范化。结果表示为褶皱感应对未经处理的文化(设置为1)。数据意味着±SD从四个不同的实验结果。相比,肿瘤坏死因子-/车辆处理细胞。

4所示。讨论

通过分析大量的细胞因子/趋化因子(),我们首次证明病人受到心血管疾病的特点是增加MIP-1的原生质的水平α引发,TNF -αgm - csf,干扰素-α2 g - csf MIP-1β、VEGF、EGF Eotaxin、MCP-1 CXCL10, PDGF和咆哮对健康对照组。由于静脉内皮细胞在心血管疾病的炎症性质知之甚少,我们的研究很重要的一点是,所有这些细胞因子,除了MIP-1α是自发释放在体外VEC纯化,从相同的心血管疾病患者血浆的水平的细胞因子/趋化因子分析。另一个有趣的发现是,大多数细胞因子/趋化因子发现升高的等离子体CVD患者和自发释放VEC获得文化上层清液的心血管疾病患者(除了VEGF和EGF没有价值,因为他们包含在内皮细胞培养基)显著诱导重组TNF -α,一个重要的促炎细胞因子。综上所述,在活的有机体内和在体外数据显示一个特定的细胞因子/趋化因子(MIP-1模式β、PDGF干扰素-α2 g - csf引发,咆哮,gm - csf和CXCL10) (i)是由VEC来自心血管疾病患者,病理(ii)在应对TNF -显著增加α,(3)升高的等离子体CVD患者。VEC大大有助于这些发现表明,病态的大部分血浆的细胞因子/趋化因子在CVD虽然,显然,额外的细胞来源的潜在贡献的生产血浆的细胞因子/趋化因子并不排除在外。

为了评估潜在的抗炎化合物可以影响这组特定的细胞因子/趋化因子的释放,我们使用α-酸和银杏叶衍生品,考虑到之前的研究,证明了这两个化合物抗炎活动展示各种各样的内皮细胞类型(23- - - - - -35),尽管他们在病理VEC之前从来没有测试。的抗炎活性α-酸和银杏叶衍生品被确认的基础上能够显著抑制表面ICAM-1和VCAM-1水平,来促进招募白细胞,血小板,红细胞静脉壁(37,38),没有诱导VEC文化的毒性作用。我们可以证明,在发现的细胞因子/趋化因子升高的等离子体CVD患者的在体外释放增加以应对重组TNF -α,α-酸显著()减少PDGF的基础版本,咆哮,CXCL10和TNF -α全身释放PDGF咆哮,CXCL10, g - csf和gm - csf。另一方面,Ginkgoselect phytosome减少释放的基底PDGF和TNF -α全身的PDGF,咆哮,CXCL10。因此,α-酸显示更广泛和更有效抑制活动释放的细胞因子/趋化因子对Ginkgoselect phytosome。自重组肿瘤坏死因子-α诱导VEC的几个细胞内途径,如物,p38 MAPK、ERK1/2, NF -B, Akt、STAT3和分子途径,值得注意的是α-酸显著抑制肿瘤坏死因子-α全身的NF -B和抑制p38 MAPK /激活,而Ginkgoselect phytosome downmodulated TNF -α全身p38 MAPK和Akt激活。NF -的重要角色B和在较小程度上p38 / MAPK通路在促进释放一组特定的细胞因子/趋化因子TNF -的反应αParthenolide,药理抑制剂的NF -B通路,抑制PDGF的释放,咆哮,CXCL10, g - csf, gm - csf,所有关键的影响α-酸,mk - 2206,药理Akt通路的抑制剂,抑制PDGF的释放,咆哮,CXCL10,所有关键的影响Ginkgoselect phytosome。

总之,我们已经表明,VEC大大有助于病理循环细胞因子/趋化因子发现升高的等离子体CVD患者和利用α-酸和Ginkgoselect phytosome,我们有特点、有针对性的突出的途径促进这些细胞因子和趋化因子的释放。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Veronica Tisato和乔治•Zauli同样导致了本文。

确认

作者感谢劳动S.p.A.请提供α-酸和Ginkgoselect phytosome。这项工作是支持的意大利卫生部(项目gr - 2010 - 2310832)和Regione伊米莉亚Romagna-Programma di ricerca Regione-Universita 2010 - 2012年战略计划(项目prua1ri - 2012 - 005)。

补充材料

补充表1:主要人口和临床特征的心血管疾病患者参与这项研究。

补充图1:免疫印迹的验证不同的特异性抑制剂TNF-α细胞内途径激活的。

补充材料

引用

l . Rochette s Ghibu c·理查德·m·西y Cottin,和c .边缘”,直接和间接的抗氧化性能α-酸和治疗的潜力。”分子营养与食品研究卷,57号1,第125 - 114页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
a . Goraca h . Huk-Kolega a . Piechota p . Kleniewska e . Ciejka和b . Skibska”- acid-biological活动和治疗的潜力。”药理报告,卷63,不。4、849 - 858年,2011页。视图:谷歌学术搜索
美国诉哈丁、t·c·赖德奥特和p . j .琼斯,“证据使用α硫辛酸在降低脂蛋白和炎症相关的动脉粥样硬化的风险,”《膳食补充剂,9卷,不。2、116 - 127年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
s . Golbidi s . a .伊巴迪,a音的唱名,“抗氧化剂治疗糖尿病,”目前糖尿病的评论,7卷,不。2、106 - 125年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
y。刘,G.-Z。汉族,吴t . et al .,”的保护作用α-酸氧化低密度lipoprotein-induced人类脐静脉内皮细胞损伤,”药理报告,卷63,不。5,1180 - 1188年,2011页。视图:谷歌学术搜索
美国诉皮埃尔,p . Lesnik m·莫罗et al .,“标准化银杏叶提取银杏叶提取物- 761保护血管内皮细胞暴露于氧化低密度脂蛋白,”细胞与分子生物学卷,54 OL1032-OL1042, 2008页。视图:谷歌学术搜索
t·w·韦克菲尔德,r . m . Strieter m . r .王子,l . j .唐宁和l . j .格林菲尔德“静脉血栓形成的发病机制:新的见解。”心血管外科,5卷,不。1,6 - 15,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
r·t·爱伯哈德和j·d·Raffetto“慢性静脉功能不全,循环,卷111,不。18日,第2409 - 2398页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
a . m .穆勒赫尔曼斯,c . Cronen和c·j·柯克帕特里克,“人工培养的宏观比较研究粘附分子的表达和微血管内皮细胞,”实验和分子病理学,卷73,不。3、171 - 180年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
朗,m·a·帕布斯特美国希登et al .,“异质性的微血管内皮细胞分离人类胎盘和macrovascular脐静脉内皮细胞,”欧洲细胞生物学杂志》上,卷82,不。4、163 - 173年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
e·e·埃里克森区别大肠卡洛夫,k .地标,p . Rotzius赫定,x谢,“强大的大血管内皮炎症性质体内,”动脉硬化、血栓和血管生物学,25卷,不。4、723 - 728年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
m·a·冈萨雷斯和a·p·塞尔温”内皮功能、炎症、心血管疾病及预后,”美国医学杂志》上,卷115,不。8,补充1,页99 - 106年代,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
m·h·穆拉德f . Coto-Yglesias m . Zumaeta-Garcia et al .,”的系统回顾和荟萃分析静脉曲张的治疗方法,”血管外科杂志》,53卷,不。5、补充页49 - 65年代,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
诉Tisato g . Zauli r . Voltan et al .,“内皮细胞来自患者受到慢性静脉疾病表现出一种炎性表型的影响,“《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。6篇文章ID e39543 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
g . Zauli f . Corallini f·西et al .,“Osteoprotegerin增加白细胞粘附内皮细胞在体外和体内,”血,卷110,不。2、536 - 543年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
s . Indraccolo l . Moserle诉Tisato et al .,“卵巢癌基因治疗与干扰素-α第成纤维细胞:比较本构和诱导向量”,基因治疗,13卷,不。12日,第965 - 953页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
m . Vitale l . Zamai e . Falcieri g . Zauli p .米兰球迷和s·桑蒂,“tiazofurin IMP脱氢酶抑制剂,在人类红白血病K562细胞凋亡”血细胞计数,30卷,不。1,第66 - 61页,1997。视图:谷歌学术搜索
g . Zauli g . Visani a Bassini et al .,“核易位的蛋白激酶C -α和- - - - - -ζ亚型在HL-60细胞诱导分化——粒细胞谱系反式视黄酸。”英国血液学杂志》,卷93,不。3、542 - 550年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
g . Zauli b . Toffoli m·g·迪Iasio c . Celeghini b·法夫里和p . Secchiero”治疗肿瘤坏死factor-related重组凋亡诱导配体减轻体外糖尿病的严重程度,”糖尿病卷,59号5,1261 - 1265年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
g . Zauli a . Bassini m . Vitale et al .,“促血小板生成素IIb提高αβ3-dependent巨核细胞的细胞粘附或纤维蛋白原纤连蛋白通过π3激酶,”血,卷89,不。3、883 - 895年,1997页。视图:谷歌学术搜索
p . Borgatti m·玛·C·卡里尼et al .,“核内蛋白激酶C活性的变化和同形像成分在PC12细胞增殖和分化,“实验细胞研究,卷224,不。1,第78 - 72页,1996。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
d·米拉尼·m·玛·Borgatti g . Zauli l .负责人,美国两位“细胞外蛋白质人类免疫缺陷病毒1型激活磷脂酰肌醇3-kinase在PC12神经元细胞,”生物化学杂志,卷271,不。38岁,22961 - 22964年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
W.-J。张,b .弗雷。”α-酸抑制TNF -α全身的NF -κB激活和人类主动脉内皮细胞粘附分子的表达,“美国实验生物学学会联合会杂志,15卷,不。13日,2423 - 2432年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
苍井空,m .问:米尔f.a.h ayek Cheema et al .,“Irbesartan和硫辛酸改善内皮功能,减少炎症的标志物代谢综合征:Irbesartan结果和硫辛酸在内皮功能障碍(岛)的研究中,“循环,卷111,不。3、343 - 348年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
比比Heinisch m·弗兰切斯科尼f . Mittermayer et al .,“α硫辛酸可以改善2型糖尿病患者的血管内皮功能:安慰剂对照随机试验,”欧洲临床研究杂志》上,40卷,不。2、148 - 154年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
g ., j . Pu l .悦j .侯,h .太阳。”α-酸能改善内皮功能障碍与空腹血糖受损对象,“新陈代谢,60卷,不。4、480 - 485年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
d·w·雷,西山英彦(s . k . r·a·哈里斯et al。“急性逆转内皮功能障碍的老年人抗氧化消耗后,“高血压卷,59号4、818 - 824年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
s t·拉赫曼:商人,t . Haque j . Wahi s Bhaheetharan和k·c·费迪南,“硫辛酸对内皮功能的影响和quinapril-treated糖尿病I期高血压患者的蛋白尿:从质量研究的结果,“心血管药理学和治疗学杂志》上,17卷,不。2、139 - 145年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
J.-W。陈,中州。陈,F.-Y。林,杨绍明。关铭陈,S.-J。林,“银杏叶提取物抑制肿瘤坏死因子-α全身的活性氧生成、转录因子激活人类主动脉内皮细胞和细胞粘附分子的表达,“动脉硬化、血栓和血管生物学,23卷,不。9日,第1566 - 1559页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
张,陈,w . Wu l .包和r .气”Ginkgolide B降低炎性蛋白表达在人类血管内皮细胞氧化低密度lipoprotein-stimulated,”心血管药理学杂志》上卷,57号6,721 - 727年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
r·谢x, y, c .沈,吴x,和w·徐“α硫辛酸预处理和后工序提供防止体外在脑缺血再灌注损伤内皮细胞通过一种蛋白激酶/ mTOR信号”大脑研究卷,1482年,第90 - 81页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
p . Larghero r . Vene s Minghelli et al .,“生物化验和基因组分析揭示了硫辛酸调制的内皮细胞行为和基因表达,“致癌作用,28卷,不。5,1008 - 1020年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
m . Artwohl k . Muth k Kosulin et al .,”R - (+) -α-酸抑制内皮细胞凋亡和增殖:Akt的参与和视网膜母细胞瘤蛋白/ E2F-1”美国生理内分泌和代谢》期刊上,卷293,不。3,E681-E689, 2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
H.-C。或者,W.-J。李,I.-T。李等人。”银杏叶提取变弱oxLDL-induced氧化在内皮细胞功能损害,”应用生理学杂志,卷106,不。5,1674 - 1685年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
C.-L。许,杨绍明。关铭吴,G.-J。唐,t·s·艾。李、y . r .口。”银杏叶从香烟中提取授予保护extract-induced人类肺内皮细胞凋亡:血红素oxygenase-1的角色。”肺药理学和治疗,22卷,不。4、286 - 296年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
Z.-G。刘:“肿瘤坏死因子信号传导的分子机制及超越。”细胞研究,15卷,不。1、24 - 27日,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
c·罗森和狼,“ICAM-1信号在内皮细胞,”药理报告,卷61,不。1,22-32,2009页。视图:谷歌学术搜索
p .狱吏,e . Maganto-Garcia g .牛顿et al .,“Th17淋巴细胞粘附和Th1细胞不同,“《免疫学,卷188,不。3、1421 - 1430年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

抑制作用的天然抗炎化合物慢性静脉疾病Patient-Derived内皮细胞释放的细胞因子

文摘

1。介绍

2。材料和方法

2.1。招募的病人和样本收集

2.2。内皮细胞培养和治疗

2.3。评估细胞的生存能力和细胞表面炎症标记物

2.4。分析细胞因子和趋化因子的血浆和细胞培养上清液

2.5。在内皮细胞磷蛋白质和蛋白质印迹

2.6。统计分析

3所示。结果

3.1。描述的原生质的水平的细胞因子和趋化因子在心血管疾病患者和静脉内皮的潜在贡献

3.2。特定的细胞因子/趋化因子的释放VEC不同抑制了病态α-酸和Ginkgoselect Phytosome

3.3。不同的细胞内信号通路调节细胞因子/趋化因子通过病理VEC释放

4所示。讨论

利益冲突

作者的贡献

确认

补充材料

引用

版权

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