错综复杂的转译后的Tumor-Targeted细胞因子基因治疗

文摘

最安全、最有效的细胞因子疗法需要良好的积累的细胞因子肿瘤环境。而直接治疗肿瘤是理想的,系统性tumor-targeted疗法将更加可行。Electroporation-mediated转染质粒DNA的细胞因子包括肿瘤peptide-encoding序列是一个方法获得tumor-targeted细胞因子产生的肿瘤病人的组织。在这里,对疗效的影响目标肽的位置,选择目标肽,细胞因子肿瘤histotype,利用研究在多个同源的小鼠肿瘤模型。在相同的肿瘤模型,目标肽的位置可以提高或降低白介素12 (IL)的抗肿瘤效应基因治疗,然而在其他肿瘤模型tumor-targeted IL12质粒dna同样有效无论肽位置。类似地,相同的目标肽增强IL12疗法在一个模型未能提高IL15或PF4效果相同的抑制肿瘤的生长模型。这些有趣的,有时对比结果突出的功效和个性化tumor-targeted细胞因子基因疗法而暴露的重要方面必须考虑这些相同的治疗进展到批准之前的治疗方案。

1。介绍

免疫疗法是一种最有前途的癌症和其他疾病的治疗策略;然而,一些障碍需要克服免疫疗法被广泛接受的诊所。一些细胞因子和趋化因子,如白介素(IL) 2 (1,2),干扰素(IFN)α(3],IL12 [4- - - - - -8],IL15 [9- - - - - -12],趋化因子血小板因子4 (PF4) [13- - - - - -15),是非常有效的抑制肿瘤生长在小鼠模型,通过免疫调节机制和数十个活动或完成临床试验利用细胞因子单独或作为辅助治疗癌症(16]。然而,只有2和干扰素α已经被FDA批准用于治疗癌症的一个小子集,这些疗法是只在重组蛋白的形式管理系统(17]。可能很快就会帮助改善这些疗法的一个策略是基因治疗,政府治疗蛋白质的DNA编码。虽然不适合生产所有类型的治疗性蛋白质,安全性和有效性,同时减少成本的增加使得免疫基因疗法可行(18- - - - - -20.]。

对于大多数免疫基因疗法基因产物必须位于肿瘤微环境最有效;因此,基因产物不直接产生的肿瘤需要针对肿瘤环境。例如,针对IL12肿瘤微环境诱导肿瘤特异性T细胞免疫反应的关键(5,7,21,使用特定的肿瘤抗原抗体由于能增加的抗肿瘤疗效IL15 [22]。实际上,数以百计的目标主题创建了从小肽大型多功能抗体的意图改善多个癌症疗法的疗效;然而,这些靶向治疗的成功可能不仅依赖于目标配体的表达(3,5,23- - - - - -26]。

从我们实验室以前的报告展示了强大的抗肿瘤效果的冷淡地管理tumor-targeted IL12 (ttIL12)在多个同源的基因治疗癌症模型(5]。这种策略利用目标肿瘤特异性的肿瘤多肽VNTANST异位表达波形蛋白(27]。而进一步调查的抗癌潜力ttIL12 VNTANST肽的各种潜力,几个重要的成功选择一个适当的目标主题的复杂性和免疫有效负载变得明显。这份报告将扩大的关键因素确定tumor-targeted免疫疗法的疗效使用转译后的交付机制。

2。材料和方法

2.1。在体外实验

4 t1、SCCVII EMT6 B16F10, 1,和CT26细胞线路从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),和LLC K7M3细胞捐赠的奥古斯托·c·奥乔亚(路易斯安那州立大学医学院的新奥尔良,洛杉矶,美国)和精灵Kleinerman (MD安德森癌症中心,休斯顿,德克萨斯州,美国),分别。所有细胞在DMEM保持10%的边后卫和1%佩恩/喉炎的症状(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)在37°C和5%的二氧化碳。

IL-15, il - 12和PF4质粒DNA (pDNA)构造(如前所述)(5)使用EndoFree质粒制备工具包(试剂盒、阿拉米达、钙、美国)。在体外转染pDNA,干扰素γ归纳分析,IL12 /干扰素γelisa进行如前所述[5]。

2.2。在活的有机体内肿瘤模型和治疗

所有的动物和程序上执行动物遵循国家健康研究所(NIH)的建议,批准的机构动物保健和使用委员会在德克萨斯大学MD安德森癌症中心。六到八周大的雌性Balb / C,影响和C57 / Bl6小鼠购自美国国立卫生研究院(贝塞斯达,医学博士,美国)。原位肿瘤模型创建通过乳腺脂肪垫(EMT6和4 t1),皮下(B16F10和SCCVII)或intraosseous (K7M3)接种。皮下注射被用来建立CT26异位肿瘤,1,LLC模型。这些接种进行如前所述[28]。为K7M3原位模型,原发肿瘤部位,右胫骨截肢前第一次治疗以防止tumor-burden-mandated安乐死。下肢的膝关节被拆除,伤口被关闭与一个或两个伤口剪辑如前所述[28]。

所有IL12和IL15 pDNA是通过肌肉注射的5μg在30μL半歇工盐水的左、右后方胫骨肌肉紧随其后经皮电穿孔(两个20毫秒,450 V /厘米100微秒脉冲间隔)通过卡尺电极。PF4疗法通过注入水动力进行尾静脉和10μg pDNA 1.2毫升生理盐水在5到7。所有治疗都是在所有实验重复一次,和黑色的箭头人物代表的治疗方法。

2.3。在活的有机体内治疗分析

卷,,原发性肿瘤模型除了K7M3测量通过卡尺测量最长的直径,,直径垂直的,,并应用下面的公式:。分析肺转移在4 t1, EMT6,和K7M3模型,肺膨胀了15%墨汁,然后放入Fekete 24小时的解决方案。第二天,白色结节被数(5]。肿瘤血管密度在4 t1描绘在网上补充图3http://dx.doi.org/10.1155/2013/378971通过免疫组织化学的测量吗α-CD31抗体(猫。不。01951 a, BD生物科学,圣何塞美国CA)使用标准的冰冻切片染色的协议,然后计算CD31-positive船只的数量每一节。

2.4。统计数据

单向方差分析与图基的事后测试是用于ELISA和肺转移(除了图3(d))和双向方差分析与图基的事后测试是用于分析肿瘤体积增长率。Mantel-Cox测试是用于分析生存。学生的测试被用来确定肺转移图意义3(d),血管密度补充图3中,和一起分析肿瘤的生长和转移性发展。分析和图表都创建GraphPad棱镜为Windows (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。Peptide-Coding IL12-Encoding基因质粒序列的位置影响ttIL12疗法的治疗效果

我们最初的ttIL12实验,肿瘤多肽序列插入前直接终止密码子的p40亚基编码区IL12 pDNA(图1(一))。将序列放置在这个位置并不影响的表达式或活动IL12产品(5),所以heterodimeric IL12蛋白质的四级结构提供了另一个潜在的位置,p35区域单元。因此,创建两个ttIL12质粒,与VNTANST-coding序列插入前终止密码子p35区域单元(ttIL12-p35;图1 (b)与VNTANST-coding序列),另两个亚基(ttIL12-p35 / p40;图1 (c))。新质粒表达IL12的等量(图的能力1 (d)),IL12同样有效的诱导IFNg脾细胞,IL12函数(图的一个特点1 (e))。

自从4 t1肿瘤模型之前ttIL12-p40反应良好,自发地转移,这乳房腺癌模型选择测试的功效ttIL12 pDNAs通过瘤内注射和电穿孔(EP)治疗远方的肿瘤(见部分2)。令人惊讶的是,只有治疗ttIL12-p40 pDNA显著地抑制主要肿瘤的生长,减少转移性肿瘤的发展,和延长生存时间wtIL12和其他ttIL12 pDNAs, ttIL12-p35, ttIL12-p35 / p40和wtIL12疗法都有效相比control-treated组(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。不同,ttIL12-p40和ttIL12-p35 / p40显著抑制CT26结肠癌癌原发肿瘤增长模型(补充图1 (a))。

相似的结果出现在鼠标B16F10黑素瘤模型。因为没有利益被认为从ttIL12-p35 / p40双重目标,这个群体是不包括在这个实验。同样,ttIL12-p35 wtIL12相比没有任何获益而ttIL12-p40明显减缓肿瘤恶化(数据2 (d)和2 (e))。令人惊讶的是,SCCVII模型产生不同的结果。ttIL12-p40治疗减少肿瘤体积(补充图1 (b)),并显著延长生存;然而,相比没有明显延长生存ttIL12-p35或ttIL12-p35 / p40(图2 (f))。

3.2。IL15基因治疗的功效还可以改进的肿瘤肽序列

许多其他的细胞因子,用于抗癌治疗也应受益于针对细胞因子肿瘤环境;因此,tumor-targeted IL15 (ttIL15) pDNA之前被直接插入VNTANST-coding序列构造IL15的终止密码子编码区(图3(a))。首先,这ttIL15测试在一个原位骨肉瘤模型,K7M3。由于快速增长的本质主要骨肿瘤在这个模型中,主要的肿瘤部位,正确的胫骨截肢,因此,只有自发转移性肿瘤出席的治疗。不同治疗方法在其他肿瘤模型中,左边和前面后胫骨肌肉治疗网站自右胫骨截肢。令人惊讶的是,wtIL15和ttIL15基因治疗同样抑制转移性肿瘤的生长(图3(b))。与之相反,肿瘤策略导致轻微抑制4 t1原发肿瘤增长模型。主4 t1肿瘤ttIL15治疗小鼠显著小于wtIL15和control-treated组在第一次治疗后15天(图3(c));然而,肿瘤的增长速度远远超过那些看到ttIL12或wtIL12基因治疗(图2(一个))。转移性肿瘤的抑制发展也增加了ttIL15基因治疗在4 t1(图模型3(d)),但是,抑制不像看到ttIL12治疗(图2 (b))。在一个单独的乳腺癌模型、EMT6 wtIL15和ttIL15主要抑制肿瘤生长或转移性肿瘤发展(补充图2)。

3.3。肿瘤靶向并不能提高PF4疗法的抗肿瘤功效

另一种细胞因子表明抗癌疗法PF4的承诺。PF4有抗血管新生作用,可以抑制肿瘤的生长13];因此,tumor-targeted PF4 (ttPF4) pDNA构造测试是否VNTANST序列可以提高抗血管新生疗法的疗效。一个在体外表达式通过PF4 ELISA试验表明,等效水平PF4生产从野生型PF4和tt-PF4 pDNAs(数据没有显示)。wtPF4治疗并基本4 t1显示轻微的抑制肿瘤的生长,但ttPF4没有抑制原发肿瘤生长相比,控制治疗(图4(一))。通常,PF4和其他抗血管新生治疗可以减少在肿瘤血管密度,但在主要的肿瘤血管密度几乎相同的wtIL12或ttIL12治疗后(补充图3)。有趣的是,ttPF4和wtPF4抑制转移性肿瘤的发展,但ttPF4治疗没有提供任何进一步有利于减少转移性肿瘤的生长(图的发展4 (b))。

3.4。并不是所有的肿瘤多肽与这交付方法

前面的数据与先前公布的数据5)表明,目标肽VNTANST可以用来增加IL12的功效和IL15基因治疗在一些肿瘤模型。然而,VNTANST的功效还没有与其他知名肿瘤多肽相比,如RGD4C [29日]和CNGRC [30.,31日]。为此,一些新的tumor-targeted IL12质粒是由证据确凿的肿瘤多肽的编码序列插入前终止密码子在p40-coding地区(图1(一)),他们的抗肿瘤功效测试在4 t1肿瘤模型。在这个积极的肿瘤模型,只有目标质粒和VNTANST CDGRC肽和wtIL12基因治疗能够抑制主要肿瘤的生长与所有其他peptide-targeting质粒相比,只有VNTANST-IL12-treated肿瘤明显小于wtIL12肿瘤18天并排相比(图5(一个))。也见过类似的结果在一个原位鳞状细胞癌模型(补充图4)。然而,再次转移性肿瘤的抑制作用不同于主要的抑制。这里,所有IL12治疗除了RGD4C-IL12能够显著抑制自发发展4 t1肺转移,只有VNTANST-IL12治疗肺肿瘤导致少于wtIL12(图5 (b))。令人惊讶的是,RGD4C肽,以其肿瘤功能,不抑制原发性或转移性肿瘤生长在这个策略,但是短肽CDGRC,利用相同的RGD序列,能够显著抑制小学和转移性肿瘤的生长。

3.5。最佳剂量的Tumor-Targeted pDNA需要取得成功的肿瘤抑制作用

为了增加ttIL12治疗方法的疗效,4 t1肿瘤小鼠高剂量,和ttIL12 pDNA接种小鼠是三倍增加到15μg pDNA每后胫治疗(共30μg /治疗)。出人意料地,高剂量ttIL12切除ttIL12疗法的抗肿瘤功效,未能增加wtIL12疗法的效果(图6)。

4所示。讨论

癌症仍然是死亡的主要原因之一,几乎没有减少发病率,免疫疗法即将成为一个公认和广泛的治疗选择,可以极大地改善生活质量和延长癌症患者的生存20.,21,32- - - - - -34]。然而,细胞因子的多效性的性质和潜在的副作用需要这些治疗方法不仅是定制特定的肿瘤类型,还在每个病人的异养的特质。这份报告中给出的数据进一步显示VNTANST肽的功效转译后的tumor-targeted基因治疗同时也暴露选择细胞因子的具体配置的重要性,针对主题,剂量为每一个特定的病人。

之前的出版物表明肿瘤特异性细胞表面波形蛋白的肽VNTANST房屋乳房腺癌(4 t1),结肠(CT26)、癌和鳞状细胞癌(SCCVII) [5]。此外,ttIL12 pDNA IL12 VNTANST-coding序列插入的质粒是更有效的抑制主要肿瘤的生长,抑制转移性肿瘤发展,延长生存在这些同源的模型。四个肿瘤模型进行了测试,以确定如果ttIL12将有效治疗肿瘤品种。ttIL12只增加IL12基因治疗的抗肿瘤功效B16F10黑素瘤模型(数据2 (d)和2 (e)),而没有增加功效1和EMT6模型(补充图5 (a)和5 (b))和任何功效LLC的损失模型(补充图5 (c))。缺乏有效性的这些模型是令人惊讶的LLC模型中细胞表面波形蛋白的水平相当于SCCVII CT26模型和表达式1和EMT6 3-5-fold高于表达式在4 t1(补充图6)模型。这些结果强调,并不是每一个对所有肿瘤histotypes免疫疗法将会是有效的,即使有针对性的主题表达的肿瘤。所以,这些免疫调节治疗的影响,尤其是那些依赖于肿瘤特异性配体,需要深入研究。

不同的策略目标免疫制剂肿瘤环境不断调整和修改来提高定位的功效。RGD肽序列,是目标和氨肽酶n [23,29日- - - - - -31日,35),分别;然而,这些和其他肽序列是很少使用裸露的形式(35- - - - - -42]。例如,RGD和是肽时更有效的限制与半胱氨酸残基两侧形成循环二级结构。VNTANST目标序列不包含天生的自我约束外半胱氨酸残基,和修改序列包括限制半胱氨酸残基的瞄准能力没有明显影响肽(数据没有显示)。其他研究表明,添加4个肽形成RGD4C肽(ACDCRGDCFCG)改善20-30-fold亲和力的配体(23,31日,35]。此外,四聚物的RGD4C“木筏”已成功用于使用正电子发射断层扫描成像肿瘤和其他成像技术。这和其他multimeric配方有更大的亲和力整合素,这使它成为理想的选择对这些特定的成像研究[43,44]。

另一方面,CDGRC-IL12 pDNA,和其他peptide-IL12 pDNA,大大超过了RGD4C-IL12基因治疗的疗效抑制肿瘤生长在这个特定的基因传递方法(图5(一个))。与这些结果,此前公布的数据表明,CDGRC能够提高另一个细胞因子基因治疗的治疗效果,干扰素α。CDGRC肽的结构分析发现它不仅结合了而且氨基肽酶n,目标是肽(3]。据我们所知,还没有证据显示RGD4C出版能够绑定到氨肽酶n,表明改进后的治疗效果CDGRC-IL12可能是由于绑定的双重目标。另一种可能性是,RGD4C的大(1149.34 Da)肽引起的免疫反应efficacy-depleting主机相比短CDGRC (552.64 Da)或VNTANST (705.72 Da)肽(45]。虽然RGD4C肽及其multimeric衍生品无疑是针对肿瘤环境载荷的能力,小肽似乎更适合这转译后的靶向基因治疗的策略。

正如先前所显示的,插入肿瘤多肽序列前终止密码子的亚基编码区域IL12 pDNA并不影响结果的表达式或活动IL12蛋白质。IL12以来2单元,可能有更优的配置将肽序列而不是p40子单元,用于所有先前的实验(5(创建),所以两个ttIL12 pDNAs数字1(一)- - - - - -1 (c))。有趣的是,似乎是肿瘤特异性肽位置的影响。4 t1模型中,只有ttIL12-p40 pDNA能够改善功效在wtIL12 pDNA(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。相似的结果出现在B16F10模型(数据2 (d)- - - - - -2 (e))。在不那么咄咄逼人CT26结肠癌癌模型ttIL12-p40和ttIL12-p40 / p35区域pDNAs同样改善原发性肿瘤的抑制,而ttIL12-p35未能改进wtIL12 pDNA治疗(补充图1 (a))。值得注意的是,治疗任何ttIL12 pDNA延长生存SCCVII模型(图2 (f));然而,只有ttIL12-p40显著增加主要肿瘤生长抑制(补充图1 (b))。这些对立的结果进一步提倡个性化的力量这些疗法的目标市场选择战略取决于肿瘤histotype一样针对主题有不同的结果基于位置在不同的肿瘤模型。

除了修改肽或其他目标主题,选择适当的免疫调节元素是成功治疗癌症的关键。使用VNTANST肽目标IL15 4 t1模型产生有趣的结果。首先,有轻微但显著抑制肿瘤的生长(图3(c))和肺转移wtIL15相比下降了三倍(图3(d))。然而,原发性和转移性增长远高于tt -和wtIL12 pDNA治疗(数字2(一个)和2 (b))。与之相反,wtIL15和ttIL15同样抑制转移性肿瘤的生长在K7M3骨肉瘤模型(图3(a))。再次,肿瘤histotype选择时需要考虑的一个重要因素是针对主题。

此外,IL15的降低效应可以解释最近说明IL15的癌症治疗。报告表明,IL15必将IL15r时最活跃的形式α的可溶性部分IL15受体(22]。ttIL15治疗或wtIL15后,累积IL15蛋白在肿瘤缺乏可用IL15r环境是有限的α。尽管IL15本身可以上调IL15r的表达α,pDNA编码ttIL15 IL15rα可能会增加疗效。

针对PF4,另一个细胞因子在抗癌疗法已初见成效,也试图在4 t1肿瘤模型;然而,只有wtPF4能够抑制原发肿瘤的增长,尽管略(图4(一))。同时,wtPF和ttPF4能够抑制转移性肿瘤的生长虽然没有wtPF4和ttPF4治疗(图之间还是有差异的4 (b))。多项研究表明,PF4通过其反血管增生和免疫刺激可以抑制肿瘤的生长特性(13- - - - - -15从wtPF4治疗,轻微的回归是在协议与其他抗血管新生治疗。然而,令人惊讶的是,没有进一步的好处4 t1转移性肿瘤自VNTANST目标应该PF4的瘤内水平增加,然而thettPF4没有降低主要肿瘤血管密度(补充图3)。

同样,管理增加ttIL12 pDNA不会增加ttIL12的功效。相反,ttIL12失去疗效剂量时提升到30μg /治疗(三倍高于所有其他研究中使用的剂量)4 t1模型,然而,wtIL12功效保持不变(图6)。因为没有总值IL12-induced毒性的迹象,最好的剂量是不一定最大耐受剂量。这些结果进一步证明的重要性,了解复杂的免疫调节治疗的性质,这样他们就可以安全有效地诱导抗肿瘤免疫反应。

5。结论

这里给出的数据进一步证实VNTANST肽是有效提供细胞因子原发性和转移性肿瘤站点在多个肿瘤模型来提高抗肿瘤功效;相反,这种肽或其有效载荷的目标没有改善治疗结果在1,LLC或EMT6模型。此外,这转译后的肿瘤策略可以与其他肿瘤多肽和其他细胞因子载荷;然而,一些复杂的细节这些治疗首先必须明确确定。这些细节包括合适的目标在肿瘤环境中,合适的目标主题,理想的负载上的图案的位置,适当的免疫有效载荷,和最佳剂量水平,和其他很多。虽然似乎这些细节可能会阻碍免疫基因治疗癌症治疗的影响,它真的是只有通过理解这些复杂的影响方面的治疗,我们可以发展更安全,更便宜,更有效的癌症治疗。

利益冲突

作者没有利益冲突的报告。

确认

这项研究是由美国国立卫生研究院的支持部分通过MD安德森癌症中心的支持格兰特CA016672 NIH资助RO1CA120895以及通过中国国家科学基金会国际青年科学家研究奖学金(奖学金。813111042)。资金来源没有任何角色设计、实现,或者准备这些研究。

补充材料

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