文摘

骨关节炎(OA)是最常见的关节疾病和残疾的一个重要原因。最近的研究表明潜在的adipose-tissue-derived间充质干细胞(AD-MSC)软骨修复。我们一直在调查条件培养基是否从AD-MSC (CM)可能在OA软骨细胞调节的关键调解人参与软骨退化。CM增强II型胶原蛋白表达在OA软骨细胞减少细胞基质金属蛋白酶(MMP)活动上层清液以及MMP-3的水平和MMP-13蛋白质和mRNA在OA软骨细胞刺激白介素- 1 (IL)β。此外,厘米增加il - 10水平和抵消刺激il - 1的影响β肿瘤坏死因子的生产αil - 6,前列腺素E2,没有测量亚硝酸盐和这些细胞因子的mRNA表达CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5, CCL-8, CCL-19, CCL-20, CXCL-1, CXCL-2, CXCL-3, CXCL-5, CXCL-8, cyclooxygenase-2,微粒体前列腺素E synthase-1和诱导没有合酶。这些影响可能依赖于抑制核转录因子-κB激活厘米。我们的数据证明chondroprotective CM的行动,并为进一步的研究提供支持这种方法的关节疾病。

1。介绍

骨关节炎(OA)是老年人残疾的主要原因,并对卫生保健产生重大影响(了1])。虽然OA的发病机制尚不清楚,但慢性关节组织生产不同的介质被认为有助于组织退化。水平的促炎细胞因子白介素- 1 (IL)等 和肿瘤坏死因子- (肿瘤坏死因子 )在OA滑膜发炎升高,伴随着他们的受体表达的增加和减少抑制蛋白质的水平。这些细胞因子调节软骨破坏的upregulation炎症或分解代谢的基因和抗炎或合成代谢基因的差别,对这些关节软骨细胞(了2])。特别是,il - 1 降低II型胶原蛋白的表达(3],增加生产基质金属蛋白酶(MMPs) (4,5)、前列腺素E2(铂族元素2)、细胞因子、趋化因子、活性氧和一氧化氮(NO)6,7]。在OA关节软骨细胞的主要来源没有组织和这个中介已经造成的氧化应激有关变性关节炎的关节(8]。因此,没有在il - 1可以发挥的作用 全身抑制粘多糖和胶原蛋白合成、基质金属蛋白酶的表达,酶原的激活9]。

间充质干细胞(MSC)正在调查可能的细胞治疗晚期的OA (10]。取得了一些可喜的成果在膝关节OA的试点研究使用自体从骨髓间充质干细胞(11]。有趣的是,干细胞可以分泌多种营养介质,可以发挥旁分泌影响其他细胞类型。因此,stem-cell-conditioned媒体显示潜在的治疗应用在神经、心肌和成骨的再生或伤口愈合(了12])。Adipose-tissue-derived间充质干细胞(AD-MSC)是广泛调查组织再生或免疫调节(了13,14])。有趣的是,干细胞可以分泌多种营养介质,可以发挥旁分泌影响其他细胞类型。在这项研究中,我们审查的潜在条件培养基从基底AD-MSC (CM)调节II型胶原蛋白的表达和生产相关的介质参与OA关节变性使用OA软骨细胞在初级文化作为一种体外模型来研究炎症和降解反应15]。

2。材料和方法

2.1。细胞和培养基

脂肪组织了来自11个捐助者经历了腹壁整形术没有任何潜在的疾病。脂肪组织样本用磷酸盐(PBS),洗净切碎,消化在37°C 1 h和I型胶原酶的2% (Gibco,生活技术,马德里,西班牙),并透过100μm细胞过滤器(BD生物科学杜伦、数控、美国)。细胞被洗的火腿DMEM / F12含有青霉素和链霉素(1%)、播种到组织培养瓶在火腿DMEM / F12培养基中青霉素和链霉素(1%)补充15%人类血清和孵化公司为5%2在37°C。人类血清从遗传获得捐赠AB-blood-group-typed捐助者瓦伦西亚输血中心的标准。在24小时,当细胞达到semiconfluence,组织培养板清洗去除任何残留不依从细胞。AD-MSC的表型分析流式细胞术(流式细胞分析仪II, BD生物科学、圣何塞、钙、美国)与特定的抗体,anti-CD105-PE, 710年anti-CD90PerCP-eFluo anti-CD34APC (eBioscience, Inc .,圣地亚哥,美国),和anti-CD45-PE (BD Pharmigen)与碘化propidium和细胞生存能力。0和1厘米收集从细胞通道每48 h的文化,汇集,离心机,并存储在−在无菌条件下80°C。

膝盖标本来自患者的诊断高级办公自动化(22个女性和8男性,年龄 年,意味着±S.E.M.)接受全膝关节置换术。诊断是根据临床、实验室和放射学评估。软骨是股骨髁部的解剖和膝关节胫骨平台和丁成小块。人体关节软骨细胞被顺序酶消化分离:1 h和0.1毫克/毫升透明质酸酶(Sigma-Aldrich)其次是12 - 15 h 2毫克/毫升胶原酶(IA型)(Sigma-Aldrich)火腿DMEM / F12 (Sigma-Aldrich)含有青霉素和链霉素(1%)在37°C 5%股份有限公司2的气氛。消化组织是透过一个70年μ米尼龙网(BD生物科学),洗,离心机。根据细胞生存能力大于95%台盼蓝排斥试验。所有与软骨细胞实验小学文化semiconfluence ( 细胞/在6-well盘子或 细胞板3.5厘米)。软骨细胞是维持公司为5%2在火腿DMEM / F12 37°C (Sigma-Aldrich)含有青霉素和链霉素(1%)、补充10%胎牛血清(Sigma-Aldrich)。刺激细胞,软骨细胞在DMEM培养24小时或5天/火腿F12 (Sigma-Aldrich)含有青霉素和链霉素(1%)补充10%人类血清il - 1的存在与否 (10 ng / mL)和/或厘米(1毫升的媒介6-well板板3.5厘米或2毫升)。

的设计工作机构伦理委员会批准(瓦伦西亚大学和大学临床医院,瓦伦西亚,西班牙)。样本来自捐赠者提供知情同意后,根据1975年的赫尔辛基宣言,就像2008年的修订。

2.2。MTT试验

线粒体的依赖减少3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、5 diphenyltetrazolium溴化(MTT)甲瓒化验在OA软骨细胞与il - 1孵化 (10 ng / mL)或il - 1 (10 ng / mL) +厘米24小时或5天。用MTT(200细胞被孵化μ为2 h g / mL)。中删除,在二甲亚砜(100细胞可溶性μ在550纳米(L)量化甲瓒16]。

2.3。免疫细胞化学

软骨细胞被播种在 细胞/在Lab-tek钱伯斯(热科学、罗切斯特,纽约,美国)和il - 1刺激 (10 ng / mL)或il - 1 5天+厘米。细胞被固定为4%甲醛在PBS 30分钟在4°C和孵化兔子反II型胶原蛋白多克隆抗体(Chemicon /微孔,Schwalbach,德国)。最后,软骨细胞与山羊孵化anti-rabbit IgG-FITC(研发生物系统,阿宾顿,英国)。幻灯片是安装在延长黄金不变色试剂与DAPI(分子探针,表达载体,生活技术)和荧光显微镜下检查(徕卡DM IL,德国索姆)。细胞数在6微观领域的。从而胶原II-positive细胞占总细胞数的确定。

2.4。测定MMP的活动

软骨细胞与il - 1刺激 (10 ng / mL)或il - 1 24小时或5天+厘米和上层的收获,离心机,孵化p醋酸-aminophenylmercuric 12 h在37°C激活基质金属蛋白酶。整除的上层清液被转移到96孔板和后添加5-FAM肽底物(美国加利福尼亚州圣何塞AnaSpec Inc .),荧光测量不同次为490海里(激发)/ 520海里(排放)Victor3标(PerkinElmer西班牙,马德里,西班牙)。

2.5。酶联免疫吸附试验

软骨细胞与il - 1刺激 (10 ng / mL)或il - 1 24小时或5天+厘米。浮在表面的收获,离心机,冻结在−80°C到分析。肿瘤坏死因子 、il - 6和il - 10测定,酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒eBioscience(美国圣地亚哥,CA)敏感的肿瘤坏死因子4.0 pg / mL il - 10、il - 6和2.0 pg / mL。MMP-3和MMP-13蛋白质测定的ELISA试剂盒(eBioscience) 8.0和18.0 pg / mL的敏感性,分别。核因子- B (NF - B)绑定到DNA被ELISA量化在核提取物与il - 1细胞的刺激 (10 ng / mL)的存在与否厘米1 h,使用核提取设备活动主题为核提取TransAM NF -紧随其后 B工具包(比利时欧洲活动主题),根据制造商的建议。

2.6。实时聚合酶链反应

总RNA提取使用TriPure试剂(罗氏应用科学,巴塞罗那,西班牙)根据制造商的指示。逆转录完成在1μ使用随机引物总RNA的g (TaqMan逆转录试剂,应用生物系统公司,马德里,西班牙)。进行了PCR检测在复制一个iCycler实时PCR检测系统使用SYBR绿色PCR反应混合液(Bio-Rad实验室、里士满、钙、美国)。以前使用的引物序列已报告(17- - - - - -21),合成了欧陆坊MWG操纵子(Ebersberg,德国)。一些引物组来自SA生物科学公司(Tebu-Bio,巴塞罗那,西班牙)。对于每一个样品,不同的阈值周期(ΔCt)的Ct值的计算是通过纠正基因感兴趣的引用的Ct基因 肌动蛋白。表示为相对基因表达 关于nonstimulated细胞。

2.7。确定没有和铂族元素2

软骨细胞与il - 1刺激 (10 ng / mL)或il - 1 24小时或5天+厘米。上层清液是用来测量前列腺素E2(铂族元素2)放射免疫检定法(22由荧光方法[]和亚硝酸盐23)使用Victor3标(PerkinElmer西班牙,马德里,西班牙)。

2.8。统计分析

分析的数据是单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni期末测验使用GraphPad棱镜5软件(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。一个 值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。细胞增殖

确定厘米治疗OA软骨细胞增殖的影响,OA软骨细胞在没有孵化或厘米和il - 1的存在 。24小时或5天后,MTT反应进行。如图1(一)MTT观察%显著升高,所有组后5天24小时孵化。厘米的存在并没有引起任何显著细胞增殖的变化。

(一)
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(b)
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图1
厘米的影响(a)细胞增殖和(b)在OA软骨细胞MMP的活动。(一)MTT法测定细胞增殖。结果表示为%对nonstimulated MTT细胞24小时。(b) MMP活性测定细胞培养上清液的荧光测定术24小时或5天后孵化软骨细胞的il - 1的存在与否 和厘米。活动表示为荧光单位(FU)每毫克的蛋白质。数据代表的意思是±S.E.M.独立文化的4种不同捐赠者的软骨细胞。+ + 关于nonstimulated细胞;* * 对il - 1 ;# # 对相应的组24 h后孵化。
3.2。对基质金属蛋白酶的影响

基质金属蛋白酶是软骨退化的重要介质。描述CM在OA软骨细胞的影响,我们测量MMP的活动以及MMP-3的水平和MMP-13蛋白质在细胞上清液。此外,我们决定在OA软骨细胞信使rna表达。il - 1 增强MMP活性在细胞上清液经过24小时的孵化和在更大程度上(图5天之后1 (b))。有趣的是,MMP活性显著降低了CM在两个时间点。MMP-3蛋白质(图2(一个)),信使rna(图2 (c))水平下降了il - 1厘米 刺激软骨细胞,这种效应是重要的24 h后孵化。图2 (b)表明MMP-13蛋白质水平降低il - 1厘米 刺激(24小时和5天的孵化)。MMP-13 mRNA表达也显著降低il - 1厘米 刺激OA软骨细胞(图2 (c))。

(一)
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(b)
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(c)
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图2
厘米对MMP-3 (a)和MMP-13 (b)蛋白质和信使rna (c)在OA软骨细胞表达。蛋白质含量(a, b)的ELISA测定细胞上清液经过24小时或5天的孵化的软骨细胞il - 1的存在与否 和厘米。(c) mRNA表达由实时PCR分析OA软骨细胞的孵化24 h后il - 1的存在与否 和厘米。结果表明相对表达对nonstimulated OA软骨细胞。数据代表的意思是±S.E.M.独立文化的4种不同捐赠者的软骨细胞。+ ,+ + 关于nonstimulated细胞;* ,* * 对il - 1 ;# # 对相应的组24 h后孵化。
3.3。对胶原蛋白II表达的影响

胶原蛋白II是关节软骨细胞功能的一个标志。图3(一个)显示了一个代表在OA软骨细胞胶原蛋白II的形象表达il - 1的存在与否 经过5天的孵化和厘米。这种细胞因子减少胶原蛋白II的表达,但厘米显著增加胶原蛋白的比例II-positive细胞在基底条件或软骨细胞与il - 1刺激 (图3 (b))。

(一)
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图3
采用胶原蛋白II的分析表达式。软骨细胞治疗与CM和/或il - 1 5天。(一)代表图像显示胶原蛋白的表达II (FITC-immunofluorescence、绿色)和DAPI对细胞的细胞核(蓝色)。原始的放大 200年。(b)的胶原蛋白的百分比II-positive细胞对细胞总数。数据代表的意思是±S.E.M.独立文化的4种不同捐赠者的软骨细胞。+ ,+ + 关于nonstimulated细胞;* * 对il - 1 。
3.4。对细胞因子和趋化因子的影响

il - 6和TNF 炎症反应的重要介质,被ELISA以浮层。图4(一)表明,il - 1 强烈增加了细胞的il - 6水平上层清液经过24小时或5天的孵化而厘米显著降低il - 6在这两个时间点的生产。此外,肿瘤坏死因子的水平 诱导il - 1 24小时后被减少了CM孵化(图4 (b))。有趣的是,生产大大提高了抗炎细胞因子il - 10厘米的两个时间点(图4 (c))。结果在mRNA表达平行厘米对蛋白质含量的影响。因此,我们观察到降低il - 6和TNF的表达 而il - 10 mRNA表达显著增强il - 1厘米 刺激软骨细胞(图4 (d))。在OA,在软骨细胞有趋化因子表达增加的影响下炎性细胞因子il - 1等 (24,25]。图5表明,il - 1 增强的mRNA表达CCL-2、CCL-3 CCL-4, CCL-5, CCL-8, CCL-19, CCL-20, CXCL-1, CXCL-2, CXCL-3, CXCL-5, CXCL-8 24 h后孵化。厘米包括孵化媒体时,我们观察到显著减少这些趋化因子的表达。

(一)
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(b)
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(c)
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图4
厘米对蛋白质的il - 6水平的影响(一)、肿瘤坏死因子 (b)和il - 10 (c)在上层清液和mRNA表达OA软骨细胞(d)。(a - c)细胞因子的ELISA测定细胞培养上清液经过24小时或5天的孵化CM的软骨细胞il - 1的存在与否 。(d) mRNA表达由实时PCR分析OA软骨细胞经过24小时的孵化和结果表明相对表达对nonstimulated OA软骨细胞。数据代表的意思是±S.E.M.独立文化的6种不同捐赠者的软骨细胞。+ + 关于nonstimulated细胞;* ,* * 对il - 1 ;# # 对相应的组24 h后孵化。
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(我)
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(k)
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(左)
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图5
厘米对趋化因子mRNA表达的影响。mRNA表达由实时PCR分析OA软骨细胞24 h后孵化的il - 1的存在与否 和/或厘米。结果表明相对表达对nonstimulated OA软骨细胞。数据代表的意思是±S.E.M.独立文化的4种不同捐赠者的软骨细胞。+ + 关于nonstimulated细胞;* * 对il - 1 。
3.5。生产的和铂族元素2

我们也调查了生产其他相关介质的实验系统。亚硝酸盐的浓度,作为生产指数和铂族元素2上层清液的测定OA软骨细胞24小时或5天后孵化。CM在潜伏期的存在导致显著减少亚硝酸盐(图的水平6(一))和铂族元素2(图6 (b))在两个时间点的上层清液il - 1的存在 刺激。我们分析了相对mRNA的表达诱导没有合酶(间接宾语),cyclooxygenase-2 (cox - 2)和微粒体铂族元素synthase-1 (mPGES-1) OA软骨细胞与il - 1孵化 和/或厘米24 h。图6 (c)表明厘米显著降低伊诺的表达从而导致减少亚硝酸盐生产、cox - 2和mPGES-1差别除了对这些可以解释CM在铂族元素的抑制效应2。

(一)
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(b)
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(c)
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图6
厘米的影响没有(a)和铂族元素2(b)生产和进气阀打开,cox - 2和mPGES-1 mRNA (c)在OA软骨细胞表达。(一)没有被氟量计测定亚硝酸盐。(b)铂族元素2是衡量等。介质测定细胞培养上清液在24小时或5天的孵化与CM OA软骨细胞il - 1的存在与否 。(c) mRNA表达由实时PCR分析OA软骨细胞经过24小时的孵化和结果表明相对表达对nonstimulated OA软骨细胞。数据代表的意思是±S.E.从6 M独立的文化与软骨细胞(不,铂族元素2)或4 (mRNA)不同的捐赠者。+ + 关于nonstimulated细胞;* ,* * 对il - 1 ;# # 对相应的组24 h后孵化。
3.6。NF - B激活

理解的机制参与CM在炎症和分解介质的影响,我们研究了这个关键转录因子的调控。il - 1 迅速引发NF - B易位到细胞核DNA结合,激活基因转录。图7显示了增强p65-NF - B-DNA绑定由il - 1 在OA软骨细胞。在厘米,p65-NF - B结合DNA显著下降。


图7
CM NF -的影响 B在OA软骨细胞活化。与il - 1细胞被刺激 1 h和p65-NF - B结合DNA由ELISA在核分数。数据表示为均值±S.E.M.独立文化的三种不同捐赠者的软骨细胞。盟:任意单位。+ 关于nonstimulated细胞;* 对il - 1 。

4所示。讨论

了多方面的证据已经证明了在OA关节组织的生产范围广泛的分解和促炎介质导致软骨基质降解(了26])。除了其它细胞外基质成分,II型胶原原纤维的关节软骨的完整性和生存的必要条件。在OA软骨,是胶原酶的upregulation MMP-13等发起的主要酶II型collagen-degrading纤维II型胶原蛋白的变性从而导致关节损伤的发生和发展27]。在这项研究中,我们已经表明,厘米提高胶原蛋白II表达nonstimulated OA软骨细胞和抵消il - 1的负面影响 这种蛋白质。我们还发现,厘米会使分解酶在软骨退化起着关键的作用。因此,CM降低胶原酶的生产MMP-13和一定程度上的stromelysin MMP-3介导的直接降解细胞外基质成分和其他基质金属蛋白酶的激活28]。

促炎细胞因子激活软骨细胞合成和释放多种介质。我们的研究显示,厘米会使促炎细胞因子il - 6和TNF 但移植抗炎细胞因子il - 10。这些影响的相关性为办公自动化的发展促炎细胞因子诱导合成的分子导致软骨细胞表型的损失和软骨变性(2]。此外,il - 10厘米的影响可能有积极影响软骨代谢的细胞因子与其他因素配合抑制软骨破裂实验OA (29日]。

软骨细胞可能放大炎症和分解反应通过趋化因子的释放促进炎症,滑膜血管生成(30.,31日,分解的生产介质如OA软骨细胞基质金属蛋白酶(32,33]。有趣的是,CM减少一些趋化因子的表达与软骨细胞的新陈代谢有关。我们的数据也表明,CM抵消在OA软骨细胞il - 1刺激没有生产 。这种效应将可能导致差别伊诺的结果对这些厘米没有抑制矩阵合成的保护措施(8]。此外,我们展示了CM的抑制性影响铂族元素2生产。这类二十烷酸可能导致软骨退化,促进基质金属蛋白酶的产生和抑制这些酶的合成组织抑制剂(34,35]。cox - 2和mPGES-1功能耦合和诱导il - 1 在OA软骨细胞导致增加铂族元素2合成(36]。因此,CM在铂族元素的影响2相关生产OA软骨细胞可能是软骨的新陈代谢和减少将依赖于在我们的研究中观察到的cox - 2和mPGES-1表达。

NF -的激活 B伊诺转录中起着关键作用,cox - 2、基质金属蛋白酶,不同的促炎细胞因子和趋化因子(37,38]。理解厘米的可能机制会使这些介质,对NF -我们调查了它的影响 b。我们的研究结果表明,观察到的抑制性影响CM的分解和促炎的分子的表达可能与减少NF - 与il - 1 B激活OA软骨细胞的刺激 。

MSC在实验模型中显示cytoprotective属性通过旁分泌机制。的有利影响这些细胞可能与生产不同类型的介质,如细胞因子和铂族元素2或环境分泌因素发挥协同效应39- - - - - -41]。还需要进一步的研究来阐明负责chondroprotective CM的影响因素或提供额外的机械的见解。

5。结论

我们研究的结果显示CM的chondroprotective作用分解代谢和炎症介质通过定位和支持这种方法的兴趣去寻找新的治疗炎症和/或关节的退行性条件。

缩写

AD-MSC: 脂肪tissue-derived间充质干细胞
CM: AD-MSC条件培养基
cox - 2: Cyclooxygenase-2
ELISA: 酶联免疫吸附试验
IL: 白介素
伊诺: 诱导一氧化氮合酶
MMP的: 基质金属蛋白酶
mPGES-1: 微粒体前列腺素E synthase-1
硕士: 间充质干细胞
NF - B: 核转录因子 B
没有: 一氧化氮
办公自动化: 骨关节炎
PBS: 磷酸盐
铂族元素2: 前列腺素E2
肿瘤坏死因子 : 肿瘤坏死因子- 。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作已经由研究资助saf2010 - 22048, RETICEF RD07/0013/2001,和RD12/0043/0013 (Ministerio de隐藏y Competitividad ISCIII,菲德尔)和prometeo2010 - 047 (Generalitat Valenciana)。茱莉亚银支持由一个FPU奖学金(Ministerio de隐藏y Competitividad)。