文摘
我们报告,未经处理的小鼠进行了热应力时,他们显示体温调节的赤字(例如,动物显示低体温在室温敞口),大脑(或下丘脑)炎症、缺血、氧化损伤、肾上腺轴损伤(例如,降低血浆促肾上腺皮质的激素和肾上腺酮在热应力),多器官功能障碍或衰竭,杀伤力。褪黑激素治疗显著降低体温调节的赤字,大脑炎症、缺血、氧化损伤、肾上腺轴损伤,多器官功能障碍,杀伤力中暑引起的。我们的数据表明褪黑素可改善中暑的结果减少脑部炎症,氧化损伤和多器官功能障碍。
1。介绍
松果体褪黑素,主要产品,发现其他体液和组织中含量很高1,2和具有抗炎、抗氧化作用3- - - - - -6]。我们已经评估了预防(7)以及治疗(8褪黑素的影响在中暑老鼠在全身麻醉下,褪黑激素的疗效heatstroke-induced多器官功能障碍综合征。根据最近的一个评论9)、缺血性和氧化损伤过程中下丘脑中暑可能导致多器官功能障碍或衰竭通过-肾上腺轴(HPA)机制。研究是必要的知道heatstroke-induced大脑(或下丘脑)炎症和损伤,保持体温的赤字,和多器官功能障碍可以影响褪黑激素治疗的病患和无节制的小鼠模型10- - - - - -12]。
处理假设,我们评估了时间的细胞缺血的标志(如谷氨酸、乳酸/丙酮酸比率),损害(如甘油),炎症(如肿瘤坏死因子-α(TNF -α),(il - 1β)、il - 10和髓过氧化酶(MPO)活动),和氧化损伤(例如,prooxidant酶(如脂质过氧化及谷胱甘肽氧化),抗氧化防御系统(例如,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、氧化剂自由基,一氧化氮代谢产物(没有x),dihydroxybenzoic酸(DHBA))后发生的下丘脑热疗法在老鼠身上有或没有褪黑激素疗法治疗。此外,褪黑激素疗法的影响在heatstroke-induced体温调节的赤字以及增加等离子体水平的多器官功能障碍或衰竭(10- - - - - -12)是评估。
2。材料和方法
2.1。老鼠
目前的研究进行雄性ICR小鼠(29-37 g),股票源自癌症研究所的美国国立卫生研究院。他们从国家动物中心购买(台北,台湾)和保持在一个12小时的光暗周期控制温度(°C)与自由获取食物和自来水。
2.2。小鼠模型的中暑
癌症研究所的雄性老鼠8到10周大暴露在全身加热(可喜可贺;41.2°C;相对湿度50% - -55%;1 h)在一个控制的环境室(10- - - - - -12]。heat-stressed老鼠回到了正常室温(26°C)结束后热接触。老鼠幸存的第四天热处理被认为是幸存者,和数据用于分析的结果。核心温度测量每1分钟铜常数热电偶插入直肠,连接到一个温度计(HR1300;日本横河、日本东京)。开始前热实验,小鼠被安置在一个环境温度(26°C)低于这个物种的中立区。小时后加热期间,动物是美联储和水化。在不同的实验中,4 h post-WBH,动物牺牲,得到了他们的大脑和血液生化检验(10- - - - - -12]。
2.3。实验小组
三百小鼠随机分为三大组:(a) nonheated老鼠车辆处理的解决方案:这些动物是南卡罗来纳州组注射一剂0.2毫升的0.25% ethanol-saline [13]立即post-WBH;老鼠(b)加热处理汽车解决方案;和(c)加热小鼠褪黑激素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)(0.2毫克/公斤,1毫克/公斤,或5毫克/公斤)(14)立即post-WBH。
在实验,热接触对身体核心温度的影响和%不同组的小鼠的生存评估。
在实验,热暴露对细胞的影响在脑缺血损伤标记(或不同组的小鼠下丘脑)测量。
在实验热暴露对炎症介质的影响在不同组的小鼠的大脑(或下丘脑)测量。
在实验,热暴露对氧化应激标志物的影响在不同组的小鼠的大脑(或下丘脑)测量。
在实验,热暴露对血清的影响多器官功能障碍的指标,ACTH,肾上腺酮测定不同的组。
2.4。细胞外谷氨酸水平,Lactate-to-Pyruvate比率,甘油,一氧化氮,羟基自由基在下丘脑
下丘脑样本均质在pH7.0 0.05磷酸缓冲然后离心机在4000 g×20分钟在4°C。上层清液被用于测定细胞的谷氨酸水平,lactate-to-pyruvate比率,甘油,一氧化氮和羟基自由基。透析探针(4海里长度c CMA / 12;卡内基医学,斯德哥尔摩,瑞典)放入上层清液得到透析液。
一氧化氮(下丘脑)透析液的浓度测量与Eicom ENO-20分析系统(Eicom,《京都议定书》)15]。在Eicom ENO-20后,分析系统和样品的分离柱,反应在酸性溶液产生的主要芳香胺偶氮的化合物。这后,添加芳香胺的偶氮复合导致耦合产生重氮的化合物,和吸光度的红色然后测量这种化合物。测量的谷氨酸、lactate-to-pyruvate比率和甘油,透析液被注入到一个分析器CMA600微量透析可把时程延长(卡内基医学,斯德哥尔摩,瑞典)。羟基自由基的浓度是衡量修改过程基于钠水杨酸盐的羟基化羟基自由基,导致生产2、3-dihydroxybenzoic酸和2,5-dihydroxybenzoic酸(16]。
2.5。测定脂质过氧化
脂质过氧化作用是评估通过测量水平的丙二醛(MDA)和2-thiobarbituric酸(稍后通知)形成发色团吸收532海里(17]。约0.1克的组织均质与1.5毫升的0.1米在pH3.5磷酸盐缓冲剂。反应混合物(0.2毫升的样品,1.5毫升的20%乙酸,0.2毫升的8.1%十二烷基硫酸钠和1.5毫升的0.8%的水溶液稍后通知,4毫升蒸馏水)被加热到95°C的1 h,然后5毫升的正丁醇和吡啶(15:1卷/期)补充道。混合物是涡大力和离心10分钟,1500克和有机相的吸光度测量在532海里。的值被表示为nanomoles TBA-reactive每毫克的蛋白质物质(MDA等效)。
2.6。总额的量化和氧化谷胱甘肽
组织在5% 5-sulfosalicylic均相酸(1:10 wt /卷)在0°C,和上层清液用于分析总和氧化谷胱甘肽。总谷胱甘肽(简化型谷胱甘肽(GSH) +氧化型谷胱甘肽(GSSG))分析了根据研究院和蒂策方法[资助的18格里菲斯,GSSG决心所描述的(19]。总谷胱甘肽氧化的回收试验5 5-Dithiobis(2酸)(DTNB)给GSSG化学计量5-thio-2-nitrobenzoic酸的形成。GSSG减少谷胱甘肽的行动非常具体的谷胱甘肽还原酶(GR)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简化型;NADPH)。5-thio-2-nitrobenzoic酸形成的速度是在412 nm和正比于谷胱甘肽和GSSG的总和。
2.7。测定谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性
组织在0.05磷酸盐缓冲剂,均质pH7.0然后离心机在4000 g×20分钟在4°C。上层清液用于全科医生x和GR活性测定。全科医生x与商业GP和GR活动进行x美国分析工具包(σ)和医生化验设备(美国σ),分别。一个单位的全科医生x和GR活动被定义为氧化所需样品的数量每分钟1更易NADPH基于6.22×10的分子吸光度6NADPH。
2.8。髓过氧化物酶活性
MPO活性,多形核白细胞的指标积累,决心在下丘脑如前所述20.在热应激后4小时。MPO活性被定义为酶降解的数量1摩尔的过氧化氢/分钟37°C和表达milliunits /克湿组织。
2.9。在下丘脑细胞因子的确定
根据先前的报道(下丘脑样本准备21]。组织在五卷的冰冷的均质里帕缓冲区。匀浆是孵化冰上了30分钟,然后离心机(15000×g, 30分钟,4°C)两次。这些细胞因子在上层清液的浓度是由商用ELISA试剂盒(R & D系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指示。光学密度在一套板读者对这些细胞因子在450海里。这些样本中细胞因子的浓度标准曲线计算乘以稀释系数表示为pg / g。
2.10。多器官功能障碍和伤害的量化
肌酐、血尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)估计在4小时后采集血液样本的热应力或等效时间点nonheated动物。血清肌酐水平,发髻,分光光度法测定ALT, AST,高山(日立7600年,日本东京)。
2.11。等离子体的评估皮质甾酮和促肾上腺皮质的激素(ACTH)
血浆皮质甾酮和ACTH评估使用皮质甾酮双抗体RIA工具(MP生物医学,梭伦,哦,美国)和ACTH(鼠、小鼠)RIA工具(凤凰制药、伯林盖姆、钙、美国),分别。所有分析根据制造商的指示。
2.12。统计分析
所有的值在表和文本表达的意思S.E.M.的的观察,代表的动物数量研究。统计学评价是由使用方差分析(方差分析),后跟一个多重比较测试(菸害的测试)。一个值小于0.05的被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。褪黑素可防止燥热引起体温过低和杀伤力
总结如表1老鼠,身体核心温度的加热值明显低于nonheated老鼠保持在一个正常的环境温度(26°C) (°C和°C,分别地。)()。此外,激烈的老鼠的一部分生存显著低于nonheated老鼠(1/12和12/12,职责。)()(图1)。燥热引起体温过低和杀伤力大大减少褪黑激素疗法(表1和图1)。
3.2。褪黑激素降低燥热引起谷氨酸水平上升,Lactate-to-Pyruvate比率,甘油,亚硝酸盐(NO), Dihydroxybenzoic酸在下丘脑(DHBAs)
表2总结了影响热暴露在细胞层面上的谷氨酸,lactate-to-pyruvate比率,甘油,亚硝酸盐,DHBA在不同组的小鼠下丘脑。与nonheated老鼠相比,加热小鼠更高水平的谷氨酸,lactate-to-pyruvate比率,甘油,亚硝酸盐,DHBA在下丘脑()。燥热引起的谷氨酸水平,增加lactate-to-pyruvate比率,甘油,亚硝酸盐,DHBA下丘脑都显著和剂量依赖性降低褪黑激素(0.2 - -5.0毫克/公斤)。
3.3。褪黑激素变弱燥热引起肿瘤坏死因子水平上升,il - 1,MPO但增加il - 10在下丘脑的生产
如表所示3,TNF -下丘脑水平,il - 1,MPO都增加了激烈的老鼠。再次,燥热引起生产过剩的TNF -,il - 1明显,MPO和剂量依赖性降低褪黑激素治疗(0.2 - -5.0毫克/公斤)()。相比之下,下丘脑的il - 10水平明显和剂量依赖性增加褪黑激素治疗的老鼠。
3.4。褪黑素减少燥热引起下丘脑氧化应激
如表所示4下丘脑的MDA和GSSG /谷胱甘肽在激烈的老鼠明显高于nonheated老鼠。相比之下,下丘脑水平的医生,GR激烈的老鼠明显高于那些nonheated小鼠()。燥热引起的MDA和GSSG /谷胱甘肽水平的提高以及减少医生的水平,GR在下丘脑明显和剂量依赖性降低褪黑激素治疗(0.2 - -5.0毫克/公斤)()。
3.5。褪黑激素变弱燥热引起的血浆水平增加多个器官损伤标记
等离子体水平的发髻,肌酐,ALT, AST,美联社在激烈的老鼠都显著高于nonheated老鼠(表5)。燥热引起的等离子体水平的这些参数均显著地增加和剂量依赖性降低褪黑激素治疗(0.2 - -5.0毫克/公斤)()。
3.6。褪黑激素增强燥热引起血浆ACTH和皮质甾酮水平增加
如表所示6,ACTH和皮质甾酮的血浆水平加热老鼠明显高于nonheated控件()。燥热引起增加血浆ACTH和皮质甾酮水平均显著地增强了褪黑激素治疗(;表6)。
4所示。讨论
根据Chatterjee et al。10,11),热处理老鼠显示身体的核心温度> 40°C后立即终止可喜可贺而深刻的低体温+ 4,+ 6,+ 20 h后。这是目前的结果证实了。我们进一步证明可以显著和老鼠体内的燥热引起体温过低剂量依赖性预防褪黑激素疗法。然而,竞争不是与莱昂等的研究结果一致。22),报告对小鼠暴露于环境温度的~ 39.5°C到42.7°C的最大核心温度是获得。在复苏,小鼠体温过低(29.3°C), 24小时后恢复,热病海拔(37.8°C)。
下丘脑被认为是参与调节体内平衡,动力,和情感行为;这些功能是介导通过下丘脑控制自主神经和内分泌活动(23]。下丘脑垂体激素的允许输出响应的变化自主神经系统活动和温度调节的需要,水平衡和能源需求。热接触是一种刺激,引发生物应激反应(24]。hypothalamo-pituitary-adrenocortical (HPA)轴也动员,提高c-fos-positive所显示细胞(25)和c-fos mRNA的内容(26下丘脑室旁核),以及增加血液adrenocorticotrophic-hormone (ACTH)和皮质甾酮浓度(27,28]。耐热性下降与HPA轴损伤[有关29日]。半个多世纪前,热损伤下丘脑的体温调节的中心假设是死亡率的主要机制30.]。事实上,根据最近的一个评论(9下丘脑)、缺血性和氧化损伤可能负责中暑。严重的热应力增加皮肤的血液循环和新陈代谢,减少内脏的血液流动。严重的热应力也会降低平均动脉压,增加颅内压和脑灌注减少的压力,所有这些导致脑缺血和缺氧。与性常温控制相比,啮齿动物细胞缺血中暑有更高的值(例如,谷氨酸和lactate-to-pyruvate比)和损害(如甘油)标记,prooxidant酶(如谷胱甘肽氧化脂质过氧化和标记),促炎细胞因子(例如,interleukin-1和肿瘤坏死因子-),诱导硝酸oxide-synthase-dependent一氧化氮和积累多形核白细胞的指标(例如,髓过氧化物酶活动)以及神经损伤(如细胞凋亡和坏死)中暑后下丘脑。下丘脑的抗氧化剂防御值(例如,谷胱甘肽过氧化物酶及谷胱甘肽还原酶),然而,也更低。褪黑激素疗法,除了衰减燥热引起体温过低(体温调节的赤字),明显变弱燥热引起炎症、缺血和下丘脑的氧化损伤。
此外,我们目前的结果表明,褪黑激素疗法显著增强HPA轴机制(如反映在增加血浆ACTH和皮质甾酮水平以应对热应力),导致减少多器官功能障碍或衰竭(反映在降低等离子体水平的发髻,肌酐,ALT, AST,和高山),并导致衰减中暑老鼠的杀伤力。
我们目前的结果与先前的许多调查相一致。例如,褪黑激素改善脓毒性的临床结果新生儿根据测量sepsis-related血清参数通过降低血清脂质过氧化水平的产品(31日]。褪黑激素的主要脑代谢物作为强有力的一氧化氮清道夫,抑制剂和/或downregulator一氧化氮合酶和神经元和诱导线粒体代谢调制器(32]。褪黑激素保护线粒体活性氧species-mediated细胞凋亡在星形胶质细胞(33)和isoproterenol-induced心肌损伤大鼠通过其抗氧化机制(34]。此外,褪黑激素保护线粒体免受氧化损伤,防止双磷脂酰甘油(35]。褪黑激素也可能减弱peritonitis-induced杀伤力在有意识的老鼠通过发挥其抗氧化作用[36]。这些观察结果促使我们认为这些多个线粒体层提供的保护褪黑素可能是至关重要的为未来治疗中暑的预防和治疗。
全身炎症反应综合征的特点是增加血清TNF水平ICAM-1 E-selectin, il - 1,il - 6 (37- - - - - -40]。水平的提高这些全身炎症反应综合征分子也被患者所示(41)或大鼠(42]。此外,这些分子在血清水平的增加中暑的麻醉大鼠模型可以减少褪黑激素治疗(7]。目前的结果进一步表明,这些分子水平的增加在下丘脑的老鼠也可以减少褪黑激素。此外,褪黑激素疗法增加了下丘脑的il - 10水平中暑,这被认为是抗炎细胞因子(43]。这些结果表明,褪黑激素可以降低燥热引起激活炎症减少这些系统性炎症反应分子的水平在下丘脑。众所周知,褪黑素加剧保护热休克蛋白的表达(44),它能增强表达热休克蛋白27 (45)以及有消炎和抗氧化性能。
5。结论
总之,我们报告,未经处理的小鼠进行了热应力时,他们显示体温调节的赤字(例如,动物显示低体温在室温敞口),大脑(或下丘脑)炎症、缺血,氧化损伤,HPA轴损伤,多器官功能障碍或衰竭,杀伤力。褪黑激素治疗可改善中暑的结果通过减少脑部炎症和氧化损伤的老鼠,和多器官功能障碍。
利益冲突
作者报告没有利益冲突或与此相关的研究发现在本文中指定。
作者的贡献
Yu-Fong田和林Cheng-Hsien同样导致了工作。
确认
这项研究的部分支持由国家科学委员会(批准号。nsc90 - 2314 - b - 384 - 006 my2 nsc99 - 2314 - b - 384 - 004 my3和nsc101 - 2314 - b - 218 - 001 - my3)和卫生部和祝福,临床试验和研究的卓越中心的神经学中华民国(批准号doh99 - td - b - 111 - 003)。