文摘

目标。牙周炎是一种炎症性疾病,其特征是结缔组织损失和牙槽骨的破坏。Interleukin-8 (IL8)是重要的调节免疫反应。本研究的目的是分析四多态性IL8基因与慢性(CP)和激进的(AgP)牙周炎。方法。共有492名受试者被包含在这个病例对照关联研究无关。基因组DNA的278 CP患者,58 AgP,患者和156名对照基因分型,使用5′核酸酶TaqMan化验,IL8(rs2227307 rs4073 rs2227306和rs2227532)基因多态性。龈下的细菌殖民化了dna阵列检测设备在一个小组的主题。结果。等位基因和基因型频率的调查IL8多态性之间没有显著不同的主题与CP和/或AgP和控制()。然而,(251−)/ T(+ 396) /(781 +)和T (251−) C / G(+ 396) /(781 +)单明显少CP患者(分别为2.0%和5.1%,= 0.34,95%置信区间CI: 0.15 - -0.78,分别地。,分别为2.0%和4.5%,= 0.41,95% CI: 0.18—-0.97)比控制。结论。虽然没有一个snp的调查IL8基因分别与牙周炎有关,有些单可以预防CP在捷克人口。

1。介绍

牙周炎是一种炎症性疾病发起,由龈下的革兰氏阴性细菌的生物膜(1]。特定的病原体相关分子模式(pamp)和细菌毒力因素刺激宿主炎症反应,最后导致牙周组织的破坏和牙齿脱落(2]。慢性牙周炎(CP)和广义积极形式的牙周炎(AgP)似乎与某些病原体,包括Porphyromonas gingivalis,弯曲杆菌腹直肌,Tannerella连翘,消化链球菌属微,密螺旋体属物种(3,4]。梅毒denticola,p . gingivalis,t .连翘复杂,特征为“红”,是与慢性牙周炎的临床进展密切相关(1- - - - - -5]。相比之下,AgP是经常诊断阳性的病人Aggregatibacter actinomycetemcomitans,但有许多人AgP没有港口这微生物6]。

除了微生物挑战,其他因素,如遗传、环境、和宿主因素,在这些疾病的发病机理中发挥作用(7- - - - - -9]。各种化合物,如细胞因子,在牙周炎结缔组织破坏的一个重要途径,观察牙龈沟液内细胞激素已发现在(GCF)。引发,科学家趋化因子家族的一员,最初被Matsushima和奥本海姆10]。它是最重要的化学引诱物和人类中性粒细胞的激活和粒细胞积累的一个重要中介11]。引发参与发起和放大的急性炎性反应和慢性炎症过程。引发的功能是通过两个受体介导(CXCR1和CXCR2);表达式被发现在很多细胞谱系,包括嗜中性粒细胞和上皮细胞(12]。牙龈上皮细胞(GEC)移植的能力IL8在应对迅速表达答:actinomycetemcomitans挑战,促进中性粒细胞的招聘作为宿主防御机制(13,14]。IL8表达式通用电气引起的p . gingivalis(15),t .连翘(16];引发牙龈成纤维细胞生产的文化也受到脂多糖的影响p . gingivalis和p .媒介物(17]。观察牙龈沟液内细胞激素引发的水平(GCF)是有价值的在检测牙周组织的炎症18- - - - - -20.),和牙周治疗减少了GCF引发水平(21]。

引发的编码IL8基因位于染色体4 q13-21(基因库加入M28130.1数量),组成的四个外显子,三个内含子,近端启动子区域(22]。几个多态性已报告IL8基因(23- - - - - -26),其中一些可以调节引发生产。一些的snpIL8−等基因845 T / C (rs2227532)−738 T / C, 251−/ T(以前称为−rs4073 353 a / T), + 396 T / G (rs2227307), + 781 C / T (rs2227306)研究了在AgP或CP患者在巴西人口(27- - - - - -32]。此外,IL8−251 t等位基因,与高引发的生产,增加了患急性化脓性根尖牙周炎的形式的风险(美联社),而IL8251−“低绩效”等位基因与慢性nonsuppurative形式的美联社在哥伦比亚人口33]。在中国人口,IL8−251等位基因与降低易感性有关CP [34]。伊朗的横断面研究也关注多态性的研究IL8基因,但没有指定是否CP患者或AgP [35]。到目前为止,没有研究分析等位基因,基因型或单体型频率IL8在牙周炎患者基因多态性在白种人中执行。

本研究的目的是要把四个snpIL8基因(rs4073 rs2227307、rs2227306 rs2227532)和单体型CP和AgP和龈下的细菌殖民化在捷克人口。

2。材料和方法

研究伦理委员会的同意了医学院,马萨里克大学布尔诺和圣安妮的教员医院。书面知情同意了之前所有的参与者包括在这项研究中,符合《赫尔辛基宣言》。

2.1。研究人群

所有患者招募的病人池牙周病学部门,口腔诊所,圣安妮的教员医院,布尔诺,从2005年到2011年。他们至少20剩余牙齿和一般健康状况良好。排除标准包括心血管疾病史(如冠状动脉疾病和高血压的患者)、糖尿病、恶性疾病,免疫缺陷,目前怀孕或哺乳期。控制从主题选择指的是诊所口腔修复牙周疾病以外的原因(如龋齿、矫正磋商,预防性牙科检查,等等)同期病人和匹配年龄,性别,和吸烟状况。同样作为病人,所有控件都有至少20剩余牙齿和一般健康状况良好。排除标准是一样的申请牙周炎患者。

2.2。病例对照研究协会

共有492名无关的白人受试者只捷克民族的南摩拉维亚地区被包含在这个病例对照关联研究。nonperiodontitis /牙周炎的诊断是基于详细的临床检查,医疗和牙科历史,牙齿移动,和影像学评估。探测深度(PD)和附件(CAL)收集损失UNC-15牙周探针从六个网站在每个牙齿。牙槽骨丧失的决心放射学。我们使用Muhlemann评价指数减少牙槽骨水平。(1)广义CP组():所有慢性牙周炎患者(CP)实现定义的诊断标准根据国际研讨会的卡路里水平分类的牙周疾病和慢性牙周炎条件(36]。从广义慢性牙周炎患者的入选标准是如下:≥30%的牙齿受到影响,PD≥4毫米,卡尔的数量与牙菌斑的存在是相一致的。(2)广义AgP集团():积极的牙周炎患者发病年龄< 35年,附件4毫米或更多损失至少30%的牙齿(至少三个受影响的牙齿没有第一磨牙和门齿),和附件损失的严重程度与牙菌斑的数量不一致被纳入本研究。(3)对照组(健康/ nonperiodontitis) ():控制筛选使用探针和CPITN(社区治疗牙周指数需要)评估(37];CPITN指数的值控制在小于3。

为了调整吸烟史对牙周病的影响,(病人和控制)的受试者分为以下组:受试者不吸烟(称为非吸烟者)和受试者前吸烟者≥5包年或吸烟者(称为烟民)。包年的计算是通过多年的吸烟的数量乘以平均每天吸多少支香烟包装。

2.3。基因分析

2.3.1。基因组DNA的隔离

DNA的遗传分析从外周血白细胞中提取使用标准苯酚/氯仿过程与蛋白酶K根据Sambrook et al。38]。隔离和存储的DNA(工作样本浓度的50 ngμl⁻¹在4°C)以及样品在实验室进行了基因分型的病理生理学,医学院,马萨里克大学,捷克布尔诺。

2.3.2。单核苷酸多态性基因型TaqMan化验

四个单核苷酸多态性(−845 c / T rs2227532−251 a / T rs4073 + 396 g / T rs2227307和+ 781 c / T rs2227306)IL8基因是基因分型使用5′核酸酶TaqMan分析等位基因歧视。个人fluorogenic TaqMan探针,由一个寡核苷酸标签与荧光记者染料,家人,和淬火染料,维克,从生活中获得技术(美国纽约大岛)。每个反应混合物准备使用TaqMan大师pcr(12.5混合μ(1.25 L), TaqMan SNP基因分型鉴定μL)和50 17.5 ng的基因组DNAμL dH的₂O 25.0μL反应体积。基因分型与88样品同时进行96孔板(+ 8 -控制)。细节snp检测总结在表1。PCR热循环协议由10分钟在95°C,紧随其后的是40的周期在92°C和1分钟15秒60°C。每个基因型板包含8井没有任何DNA模板(负控制)和随机选择复制样品板样品(10%)。等位基因的基因从荧光测量是获得使用ABI棱镜7000序列检测系统。SDS版本1.2.3软件被用来分析和端点荧光实时数据。基因分型是由一个调查员(p . b . l .)没有意识到表型。

2.3.3。DNA微阵列分析口腔病原体

龈下的细菌殖民化(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Porphyromonas gingivalis,普氏菌媒介物,Tannerella连翘,梅毒denticola,消化链球菌属微指令,和梭菌属nucleatum在龈下的口袋被DNA微阵列研究基于牙周病原体检测设备(千变万化的有限公司,Ceske Budejovice, CR)在小组随机选择的科目(CP,AgP,前控制)龈下的扩展。微生物样本收集到的最深的口袋牙周炎患者(在健康受试者和最深的沟)每个象限的无菌纸尖插入口袋的基地,持续20秒。细菌菌斑样本每个人都汇集在一管。这个测试确定单个病原体半定量的如下:(−)未被发现,它对应于细菌的数量不足,(+)稍微积极相应的细菌的数量来(+ +)积极相应的细菌的数量来,(+ + +)强烈积极的数量高于细菌。

2.4。统计分析

等位基因和基因型频率之间的比较是慢性或积极形式的牙周炎患者和控制人口。等位基因频率计算从观察到的基因型。等位基因频率组间差异的重要性被确切概率法确定。分析被用来测试基因型分布的偏离哈迪温伯格平衡,比较组间差异基因型组合。

研究连锁不平衡(LD)之间所有的单核苷酸多态性,成对LD系数(D′)和单体型频率计算使用苏格兰民族党分析仪2项目(http://snp.istech.info/istech/board/login_form.jsp)。龈下的细菌的数量变化对应于特定的基因型/等位基因进行了测试和费舍尔的确切的测试。差异被认为是重要的。

动力分析的病例对照研究设计的发病率标记和估计的优势比(或)端点统计措施。口服补液盐与相应的95%可信区间(CI)估计使用逻辑回归模型,采用年龄,性别,和吸烟作为协变量调整。所有计算都使用Statistica版本执行。10.0 (StatSoft Inc .,塔尔萨,美国)和SPSS软件(SPSS 20.0.1, IBM公司,2011)。

3所示。结果

3.1。病例对照研究

AgP患者平均年龄(37.0±8.2;年±SD)和健康受试者(41.0±12.3)两组之间没有差别。然而,主题与CP明显较年长的(47.9±8.7)比AgP患者()。近27%的牙周炎患者(28.0%的CP和AgP的26.0%)和28.0%的健康受试者吸烟者。受试者与牙周炎之间没有明显差异和控制对吸烟者的平均百分比和男性/女性的比例(77/79在控制,136/142 CP患者,患者和25/33 AgP)。

样本量的研究计划在病例对照研究设计的标准功率计算与零和替代假说的基础上或表示。设计前瞻性优化假设检查属性的患病率在控制是0.5。招募样本(278例,156控制)允许的统计显著性检测或0.55 - -1.80的范围(α= 0.05,= 0.80)。以防AgP集团(58例,156控制),统计上显著检测口服补液盐估计的0.39 - -2.59的范围。

3.2。单核苷酸多态性分析

所有研究多态性在哈迪温伯格平衡在对照组。等位基因和基因型频率的调查IL8多态性之间没有显著不同的主题与CP和/或AgP和控制(;表2)。考虑到在捷克人口,SNPIL8−845 tt基因型发生在98.4%的CP患者甚至100%的控制和AgP患者,我们小组的主题这只多态性分析()。

3.3。单体型分析

基于之前的研究(29日]这些选定的单体型分析snp进行IL8基因(396−251 T / A rs4073 + T / G rs2227307和+ 781 c / T rs2227306)。所有的变量IL8基因在不同程度的相互紧密连锁不平衡(在控制,在CP患者AgP患者)。复杂的分析显示差异IL8单体型频率。具体来说,一个(251−)/ T(+ 396) /(781 +)和T (251−) C / G(+ 396) /(781 +)单明显少CP患者(分别为2.0%和5.1%,分别地。4.5%,)(表3)。TGC单体型等位基因的频率下降CP患者的观察证实了TGC / TTC单体型(基因型)安排在CP患者少(0.4%比2.6%,= 0.09,95% CI = 0.01 - -0.96)。此外,一个不常见的丙氨酸/丙氨酸单体型(研究人口的1.15%)被发现,但无意义的,在non-periodontitis控件(分别为2.6%和0.4%,)。还有一个无意义的趋势在ATC / TTC单体型与CP(分别为2.2%和0.0%,、表4)。

3.4。微生物分析

f . nucleatum发生次数少nonperiodontitis学科()阳性T等位基因IL8+ 396 g / T变体(分别为49.2%和77.8%,;或= 0.28,95% CI = 0.09 - -0.89)或TT基因型(分别为21.2%和55.6%,;或= 0.22,95% CI = 0.05 - -0.91)。相比之下,IL8−251 t等位基因携带者或增加了个体的存在答:actinomycetemcomitans在AgP ()患者(91.7%和40.0%,;或= 16.5,95% CI = 1.88 - -145.0)和TT基因型更经常被发现答:actinomycetemcomitans存在(83.0%和13.3%,;或= 32.5,95% CI = 2.38 - -443.2)。CP患者()携带CC基因型的IL8+ 781 t / C变异减少了频繁的出现t .连翘在龈下的微生物区系比科目没有这个基因型(分别为21.6%和35.1%,;或= 0.51,95% CI = 0.25 - -1.05)。然而,牙周细菌和之间的关系IL8基因多态性必须非常仔细地评估对于小数量的对象各自的子组。

4所示。讨论

细胞因子参与了炎症过程,如IL8和他们的基因,是个体易感性的重要潜在修饰符AgP或CP。虽然没有调查的snpIL8基因分别与积极的或慢性牙周炎,CP患者显示低(251−)/ T(+ 396) /(781 +)和T (251−) C / G(+ 396) /(781 +)单体型频率比控制。TGC单体型与CP协会之间的关系,证实了TGC / TTC单体型(基因型)安排和CP。这些结果证实了假设单更强大的检测比个体易感性的等位基因多态性。我们的结果不同于那些通过Scarel-Caminaga et al。29日)相关的ATC / TTC和AGT / TGC单体型与慢性牙周炎在巴西人口。这些矛盾的发现可能是由于研究人口的变化。例如,ATC单体型的频率在捷克人口不到3.4%,23.7%的巴西人(29日]。在巴西的人口,一些单IL8−845 (T / C) / 738 (T / A) /−−353 (A / T)变异显示重要的协会,或保护,CP [28]。的三个IL8单核苷酸多态性,只有一个多态性是一样的在我们的研究中(即。251,SNP−(rs4073)称为−353在巴西的研究)。−845 t / C多态性(rs2227532)也研究了在这项研究中,但关于C等位基因的频率很低,它分析了只有几个人,因此不包括任何进一步的单体型评估。

迄今为止,八个研究评估协会IL8snp(−251, + 396, + 781)和CP或AgP在不同人群(主要是白人人口)在巴西但没有被执行,矛盾的结果(27- - - - - -32,34,35]。大多数这些研究分析只关注单个SNP和CP的检查;只有Andia et al。32)之间的关系进行了研究IL8251−变体和AgP;然而,没有发现协会。同样,金等。27没有找到任何CP和等位基因或基因型的分布之间的联系IL8−251个SNP。相比之下,另一项研究发现了一个重要的关联IL8−251 SNP和CP在不吸烟者。的IL8−251 ta杂合子基因型与水平的提高有关IL8信使rna转录和等位基因风险增加患牙周炎(30.]。这是符合观察等位基因的SNPIL8−251往往是伴随着更高的引发生产在脂多糖(LPS)刺激人体全血(25]。最近,李et al。34)发现的等位基因IL8−251变异与中国人口减少对CP的易感性有关。Houshmand et al。35)发现了一个基因型频率的显著差异IL8−/ T 251 + 396 g / T snp牙周炎患者和对照组之间在哈马丹,伊朗,但没有指定是否CP患者或AgP。相反,Corbi et al。31日)表明,遗传易感性的CPIL8相关基因并不是严重牙周临床参数和引发的浓度增加。除了Scarel-Caminaga et al。29日)与CP + 396 tt基因型有关,之间没有联系SNP在位置+ 396或+ 781和CP在巴西人口被发现。

几项研究已经检查了多态性在白细胞介素与牙周炎患者龈下的细菌殖民化。在这项研究中,单核苷酸多态性基因编码引发与病原菌的存在在龈下的牙菌斑。结果表明,IL8−251 t等位基因携带者或增加了个体的存在答:actinomycetemcomitans在AgP患者()和增加或被发现的存在t .连翘T等位基因的IL8在CP患者(+ 781)。这些数据在赞同认为个体遗传易感性可能影响宿主对感染(39]。Nibali et al。40)发现之间的联系白细胞介素6单核苷酸多态性和答:actinomycetemcomitans,他们证实了单体型分析。具体地说,白细胞介素6−174 gg基因型与高(高于中位数)项答:actinomycetemcomitans(在所有科目和牙周健康者)在印度41]。但Nibali et al。42)还指出,只有一个检测已知的periodontopathogenic细菌不能区分不同形式的牙周炎。相比之下,舒尔茨et al。43发现没有证据表明snp摘要意思基因簇可以与龈下的殖民答:actinomycetemcomitans并可能因此AgP的一个独立的风险指标。此外,Finoti et al。44)观察到患者牙周破坏可能发生在被认为是基因容易CP微生物挑战,因为较低的存在IL8ATC / TTC单体型比病人没有这个单体型。

这项研究有一些局限性,需要考虑。首先,主要的复杂因素的研究位点(如孤立IL8)牙周炎是一种多因素疾病的本质是多个基因之间的相互作用在其中扮演的角色和每个遗传多态性通常只有很小的影响。此外,基因变异与环境因素之间的相互作用(如细菌病原体)、社会经济因素,BMI,和其他人没有在这项研究中,分析了可能影响观察表型。第二,使用病例对照方法通常是很容易受到人口分层,例如,由于不同的民族起源。然而,目前的样品是完全起源于捷克高加索,限制在有限的地理区域居住着非常均匀人口较低的外加剂。最后,我们没有测量核糖核酸或蛋白质表达水平的引发,因此,我们不知道这些多态性的功能结果在我们的主题。

总之,尽管没有一个snp的调查IL8基因分别与牙周炎有关,有些单可以预防CP在捷克人口。这些发现的临床意义是由于低频率很低的“保护性”单。个人IL8变异与龈下的有关殖民答:actinomycetemcomitans在AgP和t .连翘在CP在捷克人口。然而,这些关系必须非常仔细地评估对于小数量的对象各自的子组。还需要进一步的研究来阐明这些多态性与牙周疾病的协会在其他人群。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突与此相关的工作。

确认

本研究支持的内部授权机构(IGA NT11405-6)的捷克共和国卫生部和项目市政/ / 0888/2012。