文摘gydF4y2Ba

凝血酶是一个关键的中介的纤维蛋白沉积,血管生成和促炎的过程。在这些过程异常类风湿性关节炎和骨关节炎的主要特性。矩阵metalloproteinase-13 (MMP-13)可能在关节炎导致关节软骨的破坏。然而,凝血酶的作用在MMP-13生产软骨细胞是未知的。在这项研究中,我们调查了细胞内信号通路参与thrombin-induced MMP-13人类软骨细胞表达。我们发现与凝血酶刺激导致增加MMP-13在人工培养的软骨细胞的分泌。进一步,这thrombin-induced MMP-13生产减少与siRNAs转染后对蛋白酶激活受体1和3 (PAR1和PAR3),但不是标准杆4杆核。使用特定的PKC抑制剂进行治疗gydF4y2BaδgydF4y2Bac - src,表皮生长因子受体PI3K, Akt, AP-1或者对这些信号与相应siRNAs蛋白质也废除了在软骨细胞MMP-13 thrombin-mediated增产。我们的研究结果提供的证据表明,凝血酶作用通过PAR1 / PAR3受体和激活PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba和c - src,导致表皮生长因子受体PI3K transactivation和激活,Akt,最后AP-1 MMP-13启动子,从而导致在关节炎软骨的破坏。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

在软骨和软骨细胞是唯一的细胞组件之间保持一个平衡合成代谢和分解代谢的活动,这是必要的保护组织的结构和功能的完整性在正常生理条件下(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。在正常情况下,软骨细胞表达多种蛋白水解酶如aggrecanases和基质金属蛋白酶(MMPs),调解非常低的矩阵营业额,负责软骨重塑(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。相反,在病理条件下,如骨关节炎(OA)或类风湿性关节炎(RA)、软骨细胞显著增加这些酶的生产,导致异常软骨破坏(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。因此,了解的分子机制调节这些酶的表达和识别和特定目标的关键信号效应器将有助于开发更好的治疗策略OA和风湿性关节炎。gydF4y2Ba

基质金属蛋白酶是一个大家庭结构相关的钙,zinc-dependent蛋白水解酶参与细胞外基质的降解不同的组件(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。基质金属蛋白酶表达在许多不同的细胞类型和不同的细胞过程中起着关键的作用gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。基质金属蛋白酶,MMP-13 (collagenase-3)积极降低II型胶原蛋白,胶原蛋白的主要类型的软骨,因此特别感兴趣的,因为它在软骨降解中的作用[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。之前它已经表明,MMP-13在OA和风湿性关节炎gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)和最近的报告提供证据表明anti-MMP-13疗法是一种很有前途的治疗关节炎的新战略gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。鉴于其重要作用的细胞功能,基质金属蛋白酶在不同层次有严格的规定,也就是说,通过调节基因转录,蛋白质合成和细胞外基质金属蛋白酶活动。完全理解所涉及的各种因素和途径调节MMP的表达是很重要的在发展中潜在的治疗方法。gydF4y2Ba

凝血酶是一种多功能的蛋白酶,可以激活止血和纤维蛋白原的凝固通过解理形成纤维蛋白凝块(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。增加纤维蛋白沉积,导致慢性炎症和进步组织异常,是办公自动化的一个主要特性和类风湿性关节炎gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。凝血酶还可以作为有丝分裂原刺激滑膜细胞的异常增殖在OA和RA发病机理(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。凝血酶激活胞内信号通路与跨膜域交互的G-protein-coupled受体(GPCR),被称为蛋白酶激活受体(PARs)。四个成员已经克隆和指定PAR1, PAR2 PAR3,标准杆4杆,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。三个成员,PAR1 PAR3,标准杆4杆,由凝血酶裂解,而PAR2被胰蛋白酶裂解。凝血酶的各种生理或致病效应是由于凝血酶受体在许多细胞的普遍表达式(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。凝血酶受体信使rna增加关节炎据报道(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

滑膜可能参与分解活动的感应在OA关节软骨和RA发病机理。刺激后,软骨细胞在关节软骨释放matrix-degradation MMP-13等酶,导致软骨的破坏(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。凝血酶是扮演着一个重要的角色在RA和OA (gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。然而,凝血酶对MMP-13表达人类软骨细胞的影响是未知的。在这项研究中,我们发现凝血酶的表达增加MMP-13培养的软骨细胞。此外,PAR1 / PAR3受体,PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba,EGFR transactivation c - src和PI3K / Akt AP-1信号通路可能参与thrombin-induced MMP-13表达增加。这些结果为凝血酶作用的机制提供新的见解,可治疗关节炎的治疗价值。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。材料gydF4y2Ba

Anti-mouse免疫球蛋白和anti-rabbit IgG-conjugated辣根过氧化物酶,兔多克隆抗体特定gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白、MMP-13磷(p) -c-Src, c - src, PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba表皮生长因子受体、p-p110 p110 p-Akt, Akt, p-c-Jun, c-Jun购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。兔多克隆抗体为p-PKC具体gydF4y2BaδgydF4y2Ba和p-EGFR购买从细胞信号和神经科学(丹弗斯,MA)。MMP-13酶免疫测定设备购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。SFLLRN-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(PAR1兴奋剂肽),TFRGAP-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(PAR3受体激动剂肽),GYPGQV-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(一个标准杆4杆兴奋剂肽)从Bachem购买。AP-1荧光素酶质粒从Stratagene购买(拉霍亚,CA)。埃因霍温-gydF4y2BaβgydF4y2Ba牛乳糖向量和荧光素酶检测设备买来Promega(麦迪逊,WI)。所有其他化学物质都是来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。gydF4y2Ba

2.2。细胞培养gydF4y2Ba

人类软骨细胞的主要文化孤立从关节软骨如前所述gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。机构伦理委员会批准后,人体关节软骨细胞分离在OA患者的膝关节置换手术。软骨碎片被切碎的细,软骨细胞被顺序酶消化分离在37°C和0.1%的透明质酸酶30分钟,然后以0.2%胶原酶1 h。孤立的软骨细胞是透过70 -gydF4y2BaμgydF4y2Ba米尼龙过滤器。细胞培养基塑料细胞生长在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;Gibco,宏伟的岛,纽约)补充20毫米heat-inactivated玫瑰和10%的边后卫,2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素,100gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL链霉素(pH值调整到7.6)5%的股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

2.3。测量MMP-13生产gydF4y2Ba

人类软骨细胞(2×10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba)培养24-well文化板块。与凝血酶细胞孵化24小时在37°C。孵化后,介质被储存在-80°C,直到试验。MMP-13在中是化验使用MMP-13酶免疫测定工具,按照制造商的指示。gydF4y2Ba

2.4。定量实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

从软骨细胞总RNA提取TRRzol工具包(MDBio Inc .、台北、台湾)。执行的逆转录反应是使用2gydF4y2BaμgydF4y2Ba的总RNA (g 2gydF4y2BaμgydF4y2BaL RNase-free水)与一个反向转录成cDNA MMLV RT工具包(Promega,麦迪逊,WI)按照制造商的说明(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。逆转录反应混合物在37°C孵化60分钟然后在70°C灭活MMLV 5分钟。实时定量PCR (qPCR)进行了初步分析与TaqMan一步PCR反应混合液(应用生物系统公司,培育城市,CA)。互补脱氧核糖核酸模板(2gydF4y2BaμgydF4y2BaL)被添加到每个25gydF4y2BaμgydF4y2BaL反应sequence-specific底漆和TaqMan探针。目标基因的引物和探针都是购买商业(gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白是作为内部控制)(应用生物系统公司)。qPCR化验进行了一式三份StepOnePlus序列检测系统。循环条件如下:10分钟聚合酶激活在95°C紧随其后40周期在95°C 15年代和60年代的60°C。上方的阈值设定nontemplate控制背景和目标基因扩增的线性相位计算的周期数记录检测(表示gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

2.5。免疫印迹分析gydF4y2Ba

细胞溶解产物是准备如前所述gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。蛋白质是解决利用sds - page和转移到止动剂polyvinyldifluoride膜。膜被封锁的4% BSA室温1 h,然后用兔抗体探测人类p - 110、p110, p-Akt, Akt, p-c-Jun或c-Jun(1: 1000)在室温下1 h。3洗后,墨迹孵化了一种驴anti-rabbit peroxidase-conjugated二级抗体(1:1000)在室温下1 h。这些墨迹可视化与增强化学发光在柯达X-OMAT LS电影(伊士曼柯达,罗彻斯特,纽约)。gydF4y2Ba

2.6。激酶活性测定gydF4y2Ba

PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba与PKC和c - src活动进行评估gydF4y2BaδgydF4y2Ba激酶活性检测设备(试验设计,MI)和c - src激酶活性试验设备(Abnova、台北、台湾),分别。激酶活性试剂盒是基于一个使用特定的合成肽的固相ELISA PKC的衬底gydF4y2BaδgydF4y2Ba或c - src和多克隆抗体识别磷酸化的底物。gydF4y2Ba

2.7。转染的siRNAsgydF4y2Ba

小干扰rna针对PAR1 ON-TARGETplus, PAR3,标准杆4杆,PKCgydF4y2BaδgydF4y2Bac - src,表皮生长因子受体、p110 Akt, c-Jun和控制从Dharmacon购买研究拉斐特有限公司(美国)。瞬时转染siRNAs使用DharmaFECT1转染试剂。核(100海里)制定了DharmaFECT1转染试剂根据制造商的指示。gydF4y2Ba

2.8。转染和报告基因分析gydF4y2Ba

细胞被cotransfected 0.8gydF4y2BaμgydF4y2Bag AP-1荧光素酶质粒和0.4gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2BaβgydF4y2Ba牛乳糖表达载体。细胞增长到80% confluency 12-well盘子然后转染第二天Lipofectamine 2000 (LF2000;英杰公司)。DNA和LF2000预拌了20分钟,然后添加到细胞中。24小时后,细胞被孵化与指定的试剂。进一步孵化24 h后,介质被移除,并与冷PBS细胞被洗一次。准备溶解产物,100年gydF4y2BaμgydF4y2BaL记者裂解缓冲(Promega,麦迪逊,WI)被添加到每个好,和细胞刮盘子。离心后的上层清液收集在13000转2分钟。整除的细胞溶解产物(20gydF4y2BaμgydF4y2BaL)含有等量的蛋白质(20 - 30gydF4y2BaμgydF4y2Bag)放入井的一个不透明的黑色96 -微型板块。同等体积的荧光素酶底物被添加到所有样品,和发光测量微型板块光度计。荧光素酶活动的价值是规范化的转染效率,cotransfected的监视活动gydF4y2BaβgydF4y2Ba牛乳糖表达载体。gydF4y2Ba

2.9。染色质免疫沉淀反应化验gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀反应分析如前所述[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。DNA免疫沉淀反应,与phenol-chloroform anti-c-Jun抗体纯化和提取。纯化的DNA被定量实时PCR和量化规范化与输入DNA,这是执行一式三份SYBR绿色混合使用StepOnePlus序列检测系统。引物5′-AACAAGAGATGCTCTCA-3′, 5′-TGAATGGTGATGCCTGG-3′被用来扩大人类MMP-13启动子区域(从-182年到+ 27)(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.10。统计数据gydF4y2Ba

数据表示为±SEM手段。统计评估,我们使用了Mann-WhitneygydF4y2Ba测试非高斯参数。被认为是显著的如果的区别gydF4y2Ba值< 0.05。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。凝血酶诱导MMP-13人类软骨细胞表达gydF4y2Ba

凝血因子和纤溶的水平产品,如凝血酶增加关节炎患者(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。此外,MMP-13报道积极参与软骨的破坏(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。因此,我们调查的影响凝血酶在人类软骨细胞MMP-13表达式。与凝血酶刺激的细胞(0.1 - 3 U /毫升)的mRNA表达增加MMP-13剂量依赖性(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)。凝血酶的蛋白表达也增加了MMP-13在软骨细胞浓度的方式评估使用ELISA检测和免疫印迹分析(数据gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。确认是凝血酶诱导的影响,我们使用PPACK,凝血酶抑制剂。预处理的细胞与PPACK导致凝血酶的增效效果显著antagonization MMP-13表达式(数据gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba)。这些数据表明,凝血酶增加MMP-13人类软骨细胞表达。gydF4y2Ba

3.2。PAR1 / PAR3受体参与Thrombin-Induced MMP-13人类软骨细胞表达gydF4y2Ba

凝血酶已被报道与PAR1施加其影响通过特定的交互,PAR3,标准杆4杆受体(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。确定的角色PAR-dependent MMP-13生产的信号调节软骨细胞,细胞治疗PAR1, PAR3或PAR4-specific兴奋剂肽的表达水平MMP-13检查。与SFLLRN-NH刺激的细胞gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(PAR1受体激动剂肽;100年gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)或TFRGAP-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(PAR3受体激动剂肽;100年gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),但不是GYPGQV-NHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(标准杆4杆兴奋剂肽;100年gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),增加MMP-13 mRNA和蛋白表达(数字gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba)。验证PAR1和PAR3亚型受体参与了thrombin-mediated MMP-13表达增加,PAR专门抑制与核受体表达。与PAR1或PAR3 siRNA转染的细胞,但不是标准杆4杆siRNA,废除了MMP-13 thrombin-stimulated增产(数字gydF4y2Ba1 (f)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (g)gydF4y2Ba)。这些数据表明,对于MMP-13 thrombin-PAR1 / PAR3交互的重要生产人类软骨细胞。gydF4y2Ba

3.3。PKC的gydF4y2BaδgydF4y2Bac - src和信号通路调节Thrombin-Induced MMP-13表达式gydF4y2Ba

PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba端依赖c - src激活已被证明thrombin-induced基因表达中起着重要的作用在人类成骨细胞和滑膜成纤维细胞gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。确定PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba参与thrombin-mediated MMP-13表达式,是选择性PKC吗gydF4y2BaδgydF4y2Ba抑制剂rottlerin [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba使用了)。预处理的细胞与rottlerin减少thrombin-induced MMP-13表达式(数字gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba),这表明PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba发挥着潜在的作用在thrombin-induced MMP-13生产。转染的细胞PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba特殊核也导致减少thrombin-induced MMP-13表达式(数字gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。接下来,PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba细胞内磷酸化和活动与测定凝血酶刺激。与凝血酶刺激细胞PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba磷酸化和激酶活性(数字gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (d)gydF4y2Ba)。此外,thrombin-mediated PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba激酶活性在细胞转染PAR1或撤销PAR3核(图gydF4y2Ba2 (e)gydF4y2Ba)。因此,凝血酶诱导通过PAR1 / PAR3-PKC MMP-13表达式gydF4y2BaδgydF4y2Ba人类软骨细胞信号通路。gydF4y2Ba

我们下一个检查是否thrombin-induced PKC的增加gydF4y2BaδgydF4y2Ba随后激活增强c - src激活。孵化的细胞与c - src抑制剂PP2或转染的细胞与c - src siRNA明显阻塞thrombin-induced MMP-13表达式(数字gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。磷酸化的酪氨酸gydF4y2Ba^{416年gydF4y2Ba}c - src残渣介导的激活(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。与凝血酶刺激细胞增强c - src磷酸化酪氨酸gydF4y2Ba^{416年gydF4y2Ba}(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba(图)和c - src提升激酶活动gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba)。预培养的细胞与rottlerin减少thrombin-stimulated增加c - src激酶活性(图gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba)。这些结果表明,凝血酶增加MMP-13表达式通过PAR1 / PAR3和激活PKCgydF4y2BaδgydF4y2Bac - src端依赖人类软骨细胞活化。gydF4y2Ba

3.4。表皮生长因子受体Transactivation和PI3K / Akt通路参与凝血酶诱导MMP-13人类软骨细胞表达gydF4y2Ba

表皮生长因子受体transactivation被报道参与thrombin-mediated细胞功能(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。因此,我们使用一个选择性表皮生长因子受体抑制剂AG1478检测EGFR transactivation是否参与thrombin-mediated增加MMP-13表达式。预处理与AG1478或转染软骨细胞EGFR siRNA减少thrombin-mediated增加MMP-13表达式(数字gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。酪氨酸的磷酸化gydF4y2Ba^{1173年gydF4y2Ba}对表皮生长因子受体激活(至关重要gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。与凝血酶刺激细胞促进了酪氨酸gydF4y2Ba^{1173年gydF4y2Ba}表皮生长因子受体在时间的方式(图的磷酸化gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba)。然而,预处理细胞与rottlerin或PP2抑制thrombin-mediated增加表皮生长因子受体酪氨酸磷酸化gydF4y2Ba^{1173年gydF4y2Ba}。这些结果表明EGFR transactivation介导的thrombin-stimulated增强MMP-13人类软骨细胞表达。gydF4y2Ba

之前的研究已经表明,thrombin-promoted transactivation表皮生长因子受体是依赖于PI3K / Akt信号通路(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。在软骨细胞来验证这个机制,我们分析了凝血酶刺激是否促进了EGFR-dependent PI3K / Akt激活。预处理细胞的PI3K抑制剂Ly294002或Akt抑制剂废除了thrombin-mediated MMP-13表达式(数字的增加gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba)。另一方面,转染的细胞与siRNAs对p110或Akt导致减少thrombin-stimulated MMP-13表达式(数字的增加gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba)。此外,凝血酶刺激导致p110磷酸化和Akt(图gydF4y2Ba5 (c)gydF4y2Ba)。此外,预处理细胞rottlerin, PP2或AG1478抑制thrombin-stimulated p110和一种蛋白激酶磷酸化(图gydF4y2Ba5 (d)gydF4y2Ba)。这些结果表明,凝血酶诱导MMP-13生产通过激活PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba通过表皮生长因子受体和c - src transactivation,进而导致PI3K / Akt信号通路的激活人体软骨细胞。gydF4y2Ba

3.5。AP-1激活参与Thrombin-Induced MMP-13表达式gydF4y2Ba

AP-1绑定网站报道MMP-13基因表达中发挥重要作用[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。数据gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba表明,AP-1抑制剂姜黄素和转染c-Jun siRNA废除thrombin-induced增强MMP-13生产和表达式,分别。另一方面,刺激人的软骨细胞与凝血酶增加c-Jun磷酸化在时间的方式(图gydF4y2Ba6 (c)gydF4y2Ba)。AP-1激活进一步评估通过分析染色质免疫沉淀反应化验的结果和AP-1荧光素酶的活动。的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba招聘c-Jun MMP-13启动子是评估使用染色质免疫沉淀反应试验。gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba绑定中的c-Jun AP-1元素MMP-13启动子后发生凝血酶刺激(图gydF4y2Ba6 (d)gydF4y2Ba)。绑定的c-Jun AP-1元素由凝血酶是减毒与rottlerin治疗软骨细胞,PP2, AG1478, Ly294002或Akt抑制剂(图gydF4y2Ba6 (d)gydF4y2Ba)。直接评估AP-1激活凝血酶治疗后,细胞是暂时性的转染与AP-1-luciferase AP-1激活的一项指标。如图gydF4y2Ba6 (e)gydF4y2Ba凝血酶治疗软骨细胞24 h AP-1-luciferase活动增加。此外,thrombin-induced AP-1-luciferase活动增加与rottlerin逆转细胞治疗,PP2, AG1478, Ly294002或Akt抑制剂(图gydF4y2Ba6 (e)gydF4y2Ba)。Cotransfection siRNAs与PKC的细胞gydF4y2BaδgydF4y2Bac - src,表皮生长因子受体、p110或Akt减少thrombin-enhanced AP-1荧光素酶活性(图gydF4y2Ba6 (f)gydF4y2Ba)。综上所述,这些数据表明,激活PAR1 / PAR3导致激活PKCgydF4y2BaδgydF4y2BaAkt, c - src,表皮生长因子受体PI3K c-Jun, AP-1通路,所有这一切所需的thrombin-induced MMP-13增加人类软骨细胞。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

OA和风湿性关节炎患者滑膜的包含许多类型的细胞因子和趋化因子,如il - 1、TNF -gydF4y2BaαgydF4y2BaMIP-1,许多类型的基质金属蛋白酶(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。这些可以诱导软骨的破坏。MMP-13表达式已经检测到在一些病理条件下的破坏特征的正常胶原组织架构。因此,MMP-13可能是小说发展新的战略目标治疗关节炎的gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。凝血酶已被证明作为有丝分裂原刺激异常增殖发挥重要作用在RA和OA发病机理(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。在这项研究中,我们确定了MMP-13的靶蛋白凝血酶信号通路,负责监管的软骨。我们还表明,增强MMP-13生产的凝血酶需要PAR1/3受体的激活,PKCgydF4y2BaδgydF4y2Bac - src, EGFR transactivation PI3K / Akt, c-Jun, AP-1信号通路。gydF4y2Ba

凝血酶激活PAR1标准杆为3杆,PAR3和标准杆4杆gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。然而,我们的数据表明,PAR1 PAR3,但不是标准杆4杆受体所需thrombin-induced MMP-13表达式。与GYPGOV-NH孵化的细胞gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(标准杆4杆兴奋剂肽)没有在软骨细胞增强MMP-13生产。此外,thrombin-induced MMP-13表达式不能减少与标准杆4杆核转染的细胞。因此,PAR1 PAR3受体介导thrombin-stimulated增加MMP-13软骨细胞中表达。除了基因表达,类似的受体信号传导机制也被报道thrombin-induced HO-1表达人类的滑膜成纤维细胞,这是通过PAR1 / PAR3受体(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),在凝血酶调节基质金属蛋白酶的表达和细胞迁移在软骨肉瘤gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。相比之下,据报道,凝血酶增加il - 6生产在人类通过PAR1滑膜成纤维细胞受体(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。我们以前报道,PAR1但不是PAR3参与了thrombin-mediated CCL2表达成骨细胞(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。因此,在不同的细胞类型凝血酶通过不同票面受体诱导行为不同的基因表达调节细胞功能。gydF4y2Ba

PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba端依赖c - src激活已被证明thrombin-mediated调节细胞功能(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。在当前的研究中,我们发现特定的PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba抑制剂rottlerin和c - src抑制剂PP2废除了thrombin-mediated MMP-13表达的增强作用,表明激活PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba和c - src的激活的事件thrombin-induced MMP-13人类软骨细胞表达。这小干扰rna实验证实了thrombin-induced MMP-13表达式被转染的细胞PKC减弱gydF4y2BaδgydF4y2Bac - src和核。此外,也与凝血酶治疗软骨细胞PKC诱导gydF4y2BaδgydF4y2Ba或c - src磷酸化激酶活性。这些影响被rottlerin抑制,表明PKC的参与gydF4y2BaδgydF4y2Ba端依赖c - src激活thrombin-mediated MMP-13生产。gydF4y2Ba

据报道,transactivation EGFR和后续的PI3K / Akt激活介导信号增强凝血酶反应(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。在这项研究中,治疗的细胞与表皮生长因子受体PI3K和Akt抑制剂或转染的细胞与表皮生长因子受体PI3K和Akt siRNAs减少thrombin-mediated MMP-13表达式。此外,我们还发现,凝血酶增加了表皮生长因子受体,p110和一种蛋白激酶磷酸化。然而,PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba、c - src和表皮生长因子受体抑制剂抑制thrombin-mediated p110和一种蛋白激酶磷酸化。这些结果表明,凝血酶通过PKC诱导MMP-13生产gydF4y2BaδgydF4y2Ba、c - src和EGFR transactivation和PI3K / Akt信号通路在人类软骨细胞。gydF4y2Ba

先前的报道表明,AP-1控制诱导转录MMP-13人类软骨细胞(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。我们目前的研究结果表明,AP-1激活有助于thrombin-induced MMP-13人类软骨细胞表达。预处理的细胞AP-1抑制剂姜黄素降低了thrombin-induced MMP-13表达式。因此,AP-1结合位点可能是最重要的网站thrombin-induced MMP-13生产。小君和安全系数的家庭成员AP-1转录因子结合的序列。这些核蛋白质与AP-1交互网站6月为或Jun-Fos由蛋白质形成异二聚作用通过亮氨酸拉链主题(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。我们的研究结果表明,凝血酶诱导c-Jun,磷酸化而c-Jun siRNA废除thrombin-induced MMP-13表达人类软骨细胞,表明c-Jun激活介导thrombin-induced增加MMP-13表达式。此外,凝血酶增加了绑定的c-Jun AP-1 MMP-13启动子内的元素,如图所示的染色质免疫沉淀反应试验的结果。绑定的c-Jun AP-1元素被rottlerin减毒,PP2 AG1478, Ly294002, Akt抑制剂。利用瞬时转染AP-1-luciferase AP-1活动的一个指标,我们也观察到,凝血酶诱导AP-1活动的增加,减少了rottlerin, PP2, AG1478, Ly294002或Akt抑制剂。这些结果表明,凝血酶可能通过PAR1/3行为,PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba、c - src和EGFR transactivation和PI3K Akt, c-Jun, AP-1通路诱导MMP-13生产人类软骨细胞。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们确定所涉及的信号通路thrombin-induced MMP-13人类软骨细胞表达。我们发现凝血酶增强MMP-13表达式通过绑定到PAR1 / PAR3受体和激活PKCgydF4y2BaδgydF4y2Ba通过表皮生长因子受体和c - src transactivation,进而导致PI3K和Akt激活,从而提高绑定c-Jun AP-1站点和导致增加MMP-13表达式(图gydF4y2Ba6 (g)gydF4y2Ba)。凝血酶信号通路的发现帮助我们理解底层机制关节炎发病机制,这可能会导致在未来有效的治疗方法的发展。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

所有作者没有财务或个人关系与他人或组织不当可能影响他们的工作。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

彭译葶。黄和学术界。唐的构思和设计实验。彭译葶。黄,周宏儒。林,H.-S。陈,S.-Y。程,H.-C。许执行和分析实验。彭译葶。 Huang and C.-H. Tang wrote the paper.

确认gydF4y2Ba

这项工作是由国家科学委员会的资助支持台湾(NSC 100 - 2320 - b - 039 - 028 - my3)和中国医科大学Beigang医院(CMUBH-R101011)。研究赞助商没有参与这项研究设计、数据收集、分析或论文的写作。gydF4y2Ba