文摘

结构不同的类合成CpG寡核苷酸(ODN)不同激活人体免疫细胞。k ODN引发血浆树突细胞(髓)分化并产生肿瘤坏死因子α。相比之下,d型ODN刺激大量的干扰素α髓样分泌物。细胞表面受体CXCL16以前所影响的性质和特异性CpG ODN-induced免疫激活。在这里,我们评估的表达和功能CXCL16健康志愿者的pDC。我们报告,增加CXCL16表达式与增强体外反应完全型CpG ODN。相反,酶消化干扰素受体导致减少的α生产。此外,ox-LDL存在显著地抑制D-ODN干扰素介导的α生产的髓。Coculture CXCR6表达的丰富pDCs Jurkat T细胞的激活阈值降低这些细胞应对D-ODN,表明CXCL16 / CXCR6交互可能扮演重要的角色在修改pDCs环境危险信号的反应。

1。介绍

合成oligodeoxynucleotides (ODN)包含unmethylated CpG图案刺激生产的先天免疫反应的特点是细胞因子,趋化因子,和搞笑的B细胞,树突状细胞(DC), NK细胞和巨噬细胞1- - - - - -4]。在人类,这些图案是被B细胞和血浆树突细胞(pDC)表达toll样受体(TLR9识别)[95,6]。人类PBMC识别和应对结构不同的CpG类主题(7- - - - - -13]。这些ODN类,K型(也称为B类)phosphorothioate ODN表达多个TCGTT和/或TCGTA图案刺激B细胞增殖和分泌il - 6, IgM,促进生存,激活,成熟的pDC干扰素的缺失α生产(7,8,10]。相比之下,D型ODN(也称为一个类)包含一个磷酸二酯嘌呤嘧啶/ CG、嘌呤、嘧啶主题限制在每一端由phosphorothioate polyG尾巴很穷刺激器B细胞(8- - - - - -10]。然而,D型ODN刺激髓产生高水平的干扰素α(8- - - - - -10]。以前的工作建立了D但不是K型ODN绑定到趋化因子和清道夫受体CXCL16表面表达髓(14]。这种互动指导D ODN回收endosomal隔间,TLR9-MyD88-IRF7信号通路被激活,导致健壮的干扰素α生产(15]。CpG ODN的第三类,指定为c型,包含一个或两个CpG图案在5′末端(磷酸二酯骨架11,12]。C ODN还包含一个回文序列phosphorothioate骨干3′端,可以诱导B细胞扩散和生产的低剂量的干扰素α从髓11,12]。

CXCL16函数作为一个清道夫受体(16),趋化因子(17),和一个粘附[18)分子,扮演一个重要角色在动脉粥样硬化的发病机制19和牛皮癣20.]。CXCL16趋化因子受体结合CXCR6 /疯狂的表面表达CD4 +和CD8 + T细胞(21]。可溶性细胞表面表达CXCL16由金属蛋白酶控制ADAM10积极开辟膜结合受体(22]。这个活动可以抑制金属蛋白酶抑制剂GM6001,从而增加细胞表面表达的数量CXCL16 [14,22]。相反,治疗o-sialoglycoprotease选择性消化的膜结合CXCL16 [14,21]。为了澄清CXCL16表达式的作用在人类pDCs CpG ODN-mediated免疫激活,我们修改这个蛋白的表达水平在人类外周血单核细胞刺激之前。结果表明,防止膜结合的乳沟CXCL16增加表达CXCL16 pDC的数量和他们的应对D-ODN。相比之下,消化膜结合CXCL16降低pDC的数量表达D-ODN CXCL16及其反应。有趣的是,我们的数据表明,循环ox-LDL可能不利影响pDC派生D-ODN干扰素介导的α生产,建议在病毒感染过程中不利的角色为个人ox-LDL水平升高。此外,我们还首次显示,coculture的纯化pDCs CXCR6 Jurkat T细胞表达降低阈值浓度D-ODN干扰素介导的α生产。这种效应是特定于CXCR6 CCR5表达Jurkat细胞被证明是无效的。这些结果表明CXCL16 / CXCR6交互的一个重要的角色在修改的反应pDCs环境危险信号。

2。方法

2.1。试剂

内毒素免费ODN从踊跃购买。使用的ODN序列()K3 CpG ODN ATCGACTCTCGAGCGTTCTC;K3-flip控制ODN ATGCACTCTGCAGGCTTCTC;D35 CpG ODN GGtgcatcgatgcaggggGG;D35-flip控制ODN GGtgcatgcatgcaggggGG;C类型CpG ODN TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG。phosphorothioate基地所示大写字母,小写是磷酸二酯。所有FITC -藻红蛋白(PE),和PE-Cy5共轭抗体除了BDCA-2买来Biolegend(英国伦敦)。FITC -或者PE-conjugated BDCA-2是从Miltenyi生物技术(美国CA)。BDCA-4基于磁珠的pDC隔离设备是从Miltenyi研究。多克隆山羊反CXCL16(纯化和生物素标记)及其同形像匹配控制来自研发系统。

2.2。细胞培养条件

PBMC (/毫升)健康志愿者获得知情同意,并培养后RPMI 1640含5%胎牛血清(FCS), 50 U /毫升青霉素、50μ0.3 g / mL链霉素,μg / mL谷酰胺,1μM不必要的氨基酸,1μ丙酮酸钠,10毫米玫瑰,10⁵M 2-mercaptoethanol。与1 - 3细胞被刺激的24 - 48 hμM ODN取决于试验。在一些实验中,磁珠富集pDCs镀(100000 /)是在96年的平底盘子。细胞表面CXCL16表达式修改/被治疗细胞50μM GM6001或25μg / mL O-sialoglycoprotein肽链内切酶(从巴斯德菌haemolytica), 10μ10 g / mL OxLDL,μg / mL的低密度脂蛋白,重组干扰素γ和肿瘤坏死因子α(20 ng / mL),或者PMA / ionomycin (250 pg / mL / 100 pg / mL)为30分钟37°C。Jurkat细胞稳定表达CCR5或CXCR6一种礼物Keith博士Peden逆转录病毒免疫学(FDA、cb、部分),并在96年与丰富pDCs cocultured——U-bottom板块(1:1的比例;100000细胞/)。

2.3。流仪结果

培养细胞被洗冷PBS、固定和染色如前所述14]。数据(20000 - 50000年事件)收购FACScalibur流式细胞分析仪,和数据分析使用CELLQuest软件(Beckton迪金森,圣何塞,CA)。以下结合的抗体被用于识别pDCs: CD123 (+) / BDCA-2 (+)。

2.4。ELISA

九十六好微量滴定板(微孔,贝德福德,MA)被涂上一层抗体识别人类的干扰素α培养生物医学实验室、新布伦瑞克,新泽西州),IP-10 (e-biosciences),或il - 6 (Biolegend) [14]。pbs - 5% BSA盘子被封锁。上层清液添加了从培养细胞,细胞因子量化的内容添加biotin-labeled anti-cytokine抗体紧随其后phosphatase-conjugated抗生物素蛋白和phosphatase-specific比色底物。标准曲线生成使用已知的重组人干扰素α2 IP-10或il - 6。所有分析都在重复执行。

3所示。结果与讨论

3.1。金属蛋白酶抑制剂gm - 6001增强D-ODN引起的细胞因子的生产

膜结合CXCL16是表达的专职性抗原提呈细胞(APC),如髓和巨噬细胞(14,23]。先前的研究已经表明,可溶性细胞表面表达的比率CXCL16由disintegrin-like控制金属蛋白酶ADAM10,积极开辟膜结合受体,这个活动可以抑制金属蛋白酶抑制剂GM6001,从而增加细胞表面表达CXCL16 [22,23]。评估抑制ADAM10是否会影响响应CpG ODN的三个类,PBMC从6捐助者为30分钟,然后用GM6001预处理刺激与D C或K ODN类型。接触金属蛋白酶抑制剂导致增加CXCL16表达式pDCs(图1(一)),而未经处理的髓样细胞表面表达相关CXCL16金属蛋白酶抑制剂治疗引起了~表面蛋白质的表达水平增加72%(表1)。GM6001预处理也导致显著增加D-ODN响应(~ 2倍为个人捐赠者,)(图1 (b)和表1),但没有影响细胞刺激C(图1 (c))或K-ODN(图1 (d))。这些结果支持先前的结果(14],加强对于CXCL16参与D-ODN特定细胞的激活。

3.2。表面的解理的CXCL16 pDCs减少D-ODN引起的细胞因子的生产

治疗的细胞酶O-sialoglycoprotease了分裂细胞表面表达CXCL16 [22]。与这种酶治疗PBMCs引起显著减少pDC surface-associated CXCL16蛋白质含量(表1,和图2(一个))。这种减少与显著减少D-ODN响应(、表1和图2 (b))。

这些结果表明,相关因素调节pDC细胞表面CXCL16可以影响免疫反应的大小D-ODN。还有待观察是否CXCL16中也扮演了重要的角色在修改pDCs在病毒感染的免疫反应。

3.3。CXCL16 / CXCR6交互阈值降低了pDCs应对D-ODN激活

跨膜CXCL16由三个领域:趋化因子与受体CXCR6交互领域,糖化mucin-like茎,胞质域包含一个潜在的酪氨酸磷酸化和SH2-protein-binding网站(21,24]。因此,胞质域也可能在细胞信号传导中发挥作用。评估是否CXCL16订婚pDCs可以修改CpG ODN介导的免疫反应的免疫激活,pDCs从三种不同的捐赠者丰富使用immunomagnetic分离(至少80%的纯由pDC-specific标记染色,人物3(一个))。丰富pDCs然后孵化与CXCR6表达Jurkat T细胞来源提供CXCL16订婚。一套独立的pDCs孵化了CXCR6 - CCR5阳性Jurkat细胞-控制。cocultures被刺激与次优的浓度D-ODN没有产生干扰素的检测水平α生产(0.75μ在初步试验所确定的g / mL)。结果表明coculture与CXCR6表达纯化pDCs Jurkat细胞减少阈值浓度D-ODN干扰素介导的α生产,使细胞响应一个否则nonstimulating浓度ODN(图3 (b))。这种效应是特定于CXCR6自coculture CCR5表达细胞没有表现出这样的效果(图3 (b))。这个结果表明CXCL16 / CXCR6交互可能修改pDC响应环境危险信号。

3.4。氧化低密度脂蛋白和重组干扰素γ/肿瘤坏死因子α修改D-ODN引起的细胞因子的生产

我们进一步研究了清道夫受体配体的影响氧化低密度脂蛋白(oxLDL) D-ODN介导免疫激活。预培养与oxLDL导致丰富的髓干扰素减少50%α与D-ODN生产样品的刺激,而本地低密度脂蛋白表现出抑制作用很弱或者检测不出来(图4(一))。高脂血症和高胆固醇血症是两个主要的风险因素在动脉粥样硬化的发展,越来越多的证据表明,DC功能可能会阻碍(25]。我们证明了oxLDL水平的增加会影响pDC的信号通路,从而改变对病原体的免疫反应。这个结果表明oxLDL水平可能在修改pDC响应的重要性在宿主抵抗微生物感染。

表达CXCL16诱导的炎性细胞因子IFN-gamma和tnf。这两个细胞因子协同加强移植可溶性和相关的细胞表面CXCL16 [26]。评估是否会影响pDC应对D-ODN条件下复制一个持续的慢性炎症,丰富的髓刺激的CpG ODN缺席或重组细胞因子的干扰素γ/肿瘤坏死因子α。结果表明,类似于GM6001,重组细胞因子预处理提高了D-ODN干扰素的依赖α生产2倍(图4 (b),)。相比之下,PMA / ionomycin预处理强烈会使CXCL16表达式(27]未能诱导后细胞因子生产D-ODN刺激(图4 (c))。

K和D-ODN不同激活人体细胞产生不同的细胞因子(TNFα与干扰素α)。评估期间CXCL16表达式是否改变CpG ODN刺激,PBMC与K或刺激D-ODN 48 h,染色的细胞表面表达CXCL16紧随其后。细胞刺激K-ODN表示3.4倍多的膜相关CXCL16相比控制ODN治疗细胞(图4 (c),)。相反,D-ODN刺激细胞显示适度增加(1.4倍),这表明CXCL16表达式不是由I型干扰素。

总之,我们表明,因素可以改变细胞表面的程度CXCL16表达式能深远的改变免疫反应诱导专门通过D-ODN CXCL16 / CXCR6交互降低阈值浓度D-ODN干扰素介导的α生产。这可能D-ODN敏感性取决于CXCL16 / CXCR6信号级联的协同作用和更有效的交付D-ODN核内体TLR9识别驻留的地方。

利益冲突

Mayda Gursel,丹尼斯·m·Klinman和Ihsan Gursel专利相关CpG ODN的使用。所有这样的专利权利分配给美国联邦政府。作者声明没有利益冲突。