文摘
巨噬细胞是先天免疫系统的组成部分和病原体间隙和组织改造的关键球员。功能都是通过一个关键网络不同的巨噬细胞亚型,包括M1促炎和抗炎M2巨噬细胞。以前,我们实验室确定了转录因子干扰素调节因子5 (IRF5) M1巨噬细胞分化的主监管机构。IRF5被发现在人类M1与M2巨噬细胞高表达。此外,IRF5规定促炎等基因的表达IL12b和IL23a同时抑制抗炎基因IL10。在这里,我们表明,小鼠骨髓巨噬细胞分化在体外与gm - csf也的特点是高水平的IRF5信使rna和蛋白质,对LPS刺激促炎细胞因子表达。这些巨噬细胞显示特征的表达M1-marker MHC II但缺乏M2-marker CD206。值得注意的是,我们开发的细胞内染色IRF5 -巨噬细胞表达和利用它来概括在体外结果在一个在活的有机体内antigen-induced关节炎模型,强调他们的生理意义。因此,我们建立了species-invariant IRF5在控制炎症巨噬细胞表型在体外而在在活的有机体内。
1。介绍
巨噬细胞是免疫细胞参与识别起始和分辨率的致病性刺激和炎症。他们可以适应各种不同的环境信号引起几个亚型不同的功能(1]。这些子类型可分为M1(经典激活)和M2巨噬细胞(或者激活)。此外,有几个表型与M2巨噬细胞有关,例如,M2-like或肿瘤相关巨噬细胞(2]。M1巨噬细胞分泌高水平的il - 12和IL-23但低水平的il - 10,而M2巨噬细胞分泌il - 12水平低和IL-23但高水平的il - 10 (3]。
几个报告所描述的在体外lineage-defined巨噬细胞的分化。一般来说,这些方法利用csf(巨噬细胞集落刺激因子;CSF-1)区分骨髓祖细胞,随后启动各种刺激。除了干扰素-γ其次是脂多糖(LPS)刺激被用来获取M1巨噬细胞而增加il - 4或IL-13有限合伙人收益率M2巨噬细胞(3]。建立另一个方法是使用gm - csf(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子),以生成M1巨噬细胞或者csf治疗M2分化,之后通常由有限合伙人挑战两个亚型(4,5]。在生理情况下,检测csf在稳态水平低而gm - csf已被证明是在增加刺激和炎症刺激,如il - 1、TNF、有限合伙人(6,7]。
巨噬细胞也扮演着一个关键的角色在自身免疫性疾病如类风湿性关节炎(RA)、退行性疾病的特点是关节炎症和骨破坏8]。在炎症,巨噬细胞存在于大量人们已经发现,损耗,改善了疾病严重程度(9- - - - - -11]。更具体地说,M1巨噬细胞会通过分泌促炎细胞因子,从而导致RA发病机制参与Th1 / Th17响应(12,13]。
不同的巨噬细胞亚型不仅在细胞因子释放的特点是他们的分歧也显示关键转录因子的微分表达式。最近,我们确定了转录因子干扰素调节因子5 (IRF5)促炎的主要监管机构M1巨噬细胞分化[14]。IRF5直接诱发等促炎细胞因子il - 6的表达,IL-12b, IL-23a同时抑制转录等抗炎细胞因子il - 10 (14,15]。IRF5参与各种炎症过程如I型干扰素对病毒感染的反应和病原体识别受体信号(16]。病毒感染后,IRF5被磷酸化,从而转移到细胞核的监管区域,结合目标基因(17]。病毒的刺激toll样受体(TLR)包括TLR4、7和9也会导致激活IRF5 [16]。此外,多态性IRF5基因被发现与RA (18,19]。
IRF5尽管主要角色在巨噬细胞激活,它很少被用于跟踪炎症巨噬细胞疾病。在这项研究中,我们的目标是描述小鼠巨噬细胞和IRF5表达式在体外和在活的有机体内炎症模型。因此我们使用antigen-induced关节炎(AIA)的小鼠模型小鼠在接种与甲基化BSA (mBSA)内注入之前mBSA膝盖,导致局部炎症和Th17响应(20.,21]。首先,我们分析了在体外分化的巨噬细胞对他们IRF5表达式,有限合伙人的反应,和表面受体表达。然后我们使用标签的胞内IRF5流式细胞术在体外巨噬细胞和那些来自于膝盖的友邦小鼠模型的影响。
2。材料和方法
2.1。动物和Antigen-Induced关节炎
在这项研究中野生型小鼠C57Bl / 6背景。这项工作中使用的实验动物程序被肯尼迪风湿病研究所的伦理委员会批准和英国家庭办公室。
我们诱导关节炎如前所述;短暂,在天零,小鼠镇静使用吸入异氟烷麻醉,随后接种100μ克mBSA乳化在0.2毫升的完全弗氏佐剂,管理intra-dermally底部的尾巴。在第七天,我们通过一个intraarticular诱导关节炎注入mBSA (200μg在10μL无菌PBS),或PBS单独使用无菌33-gauge microcannula,镇静的动物。在第九天,老鼠牺牲和膝盖关节切除。
2.2。在体外分化的巨噬细胞
的一代在体外分化的巨噬细胞,骨髓从野生型小鼠与谷酰胺rpmi - 1640年培养基培养实验室(PAA)补充10% FCS,青霉素和链霉素1%,0.01% 2-mercaptoethanol,重组小鼠gm - csf (20 ng / mL;Peprotech)或重组人类- csf (100 ng / mL;Peprotech)。八天后,贴壁细胞被洗PBS和山肩,然后用LPS刺激(100 ng / mL;亚历克西斯生化药剂)。
2.3。RNA提取和定量实时PCR
总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)按照制造商的指示。污染基因组DNA被撤RNA样本使用RNase-Free DNase组(试剂盒)。总RNA reverse-transcribed进cDNA使用高容量cDNA逆转录工具包(生命技术)按照制造商的指示。实时PCR反应进行ABI 7900 ht(生命技术)对小鼠TaqMan底漆集Fizz1,伊诺,Il10,Il12b,Il23a,Irf5,产生Hprt(技术)和基因表达分析使用change-in-thresholdΔΔCt-method。
2.4。免疫印迹
对蛋白质分离、细胞收获与Versene (EDTA) 0.02% (Lonza)。颗粒与巨噬细胞裂解缓冲resuspended(三pH值20毫米300毫米氯化钠,NP40 1%,和10%甘油)包含新添加蛋白酶抑制剂(罗氏)。样本在冰上孵化前30分钟细胞碎片被离心15分钟,在13000转/ 4°C。溶菌产物转移到新管和储存在−80°C。确定整个细胞溶解产物BCA的蛋白质浓度测试(热科学)是根据制造商的指示执行。
5 - 7μ克总蛋白被Novex解决Tris-glycine凝胶(生命技术),转移到PVDF膜(通用电气医疗集团)湿西方墨点法,并受孵化与兔子anti-IRF5 (Abcam)或鼠标反β肌动蛋白(σ),其次是检测辣根过氧化物酶,(合)共轭二次抗体和化学发光底物溶液发射极耦合逻辑(通用电气医疗集团)。
2.5。酶联免疫吸附测定(ELISA)
上层清液的刺激细胞转移到管,在3300转离心5分钟,储存在−20°C,直到需要。细胞因子分泌是小鼠il - 10 (eBioscience),量化IL-12p70 (eBioscience)和IL-23 (eBioscience)根据制造商的指示。吸光度是在450 nm的光谱光度测量的ELISA板读者(Labsystems Biochromic断层)和使用提升Labsystems分析软件。所有的样本分析一式三份,在一卷50μl
2.6。流式细胞术
单个细胞悬浮液的在体外分化的巨噬细胞和膝盖用流式细胞仪缓冲区(1% BSA、叠氮化钠0.01% PBS和pH值7.4)和染色后抗体:APC共轭anti-CD206抗体(BioLegend) APC-Cy7共轭anti-CD11b抗体(BD生物科学),PE共轭anti-MCH II[我/我]抗体(BD生物科学),PerCP共轭anti-CD45抗体(BD生物科学)和PE-Cy7共轭anti-F4/80 (eBioscience)。细胞内流式细胞仪染色,细胞被固定的固定/ permeabilisation解决方案(eBioscience)和洗permeabilisation缓冲区(eBioscience)。样本然后沾兔子anti-IRF5抗体(Abcam)其次是二次染色山羊anti-rabbit Alexa萤石488(生命技术)。流式细胞仪分析使用流式细胞仪第二章(BD生物科学),乔和数据分析与流软件,版本7.6 (Treestar)。
2.7。统计分析
统计分析了使用GraphPad v5.0 (GraphPad软件)使用双向方差分析(与Bonferroni多个比较)或未配对单侧Mann-Whitney测试(两组之间的比较)。值小于0.05被认为是重要的。
3所示。结果与讨论
3.1。高水平的IRF5表达小鼠骨髓gm - csf分化派生的巨噬细胞
为了评估IRF5的表达在体外,骨髓中巨噬细胞分化与gm - csf或csf (GM-BMDM M-BMDM, resp)。9天的分化后,巨噬细胞被质疑为0 h有限合伙人,1 h, 4 h, 8 h, 24 h和分析IRF5 mRNA和蛋白水平。
如果小鼠细胞,IRF5水平相当高的gm - csf分化而csf分化的巨噬细胞(图1(一))。有趣的是,这种表达模式也表现出由人类巨噬细胞如果同行,gm - csf IRF5表达显著升高在体外分化与csf相比人类巨噬细胞分化[14]。
(一)
(b)
(c)
LPS刺激后,IRF5 mRNA和蛋白表达在csf分化诱导小鼠细胞和gm - csf分化进一步诱导小鼠细胞。Irf5mRNA水平增加4到8 h,但蛋白质含量已经走高,此前1 h poststimulation(图1(一)),因此我们提出IRF5 LPS-induced生产很可能由于两个因素:(1)mRNA水平,(2)蛋白质稳定增加,可能与激活的磷酸化和泛素化(22,23]。IRF5已被证明是必不可少的人类单核细胞衍生的炎性表型gm - csf对LPS刺激巨噬细胞。然而,信使rna和蛋白质含量在人类- csf中巨噬细胞不进一步诱导LPS刺激后,暗示一些数据源特定菌种或细胞的差异LPS-regulated IRF5生产。
3.2。不同的细胞因子表达谱- csf和gm - csf BMDMs派生而来
接下来,确定的炎症性质在体外分化小鼠巨噬细胞,细胞因子的表达和分泌il - 10、il - 12,和IL-23进行分析。
正如预期的那样,每一个巨噬细胞亚型被发现显示微分行为对其细胞因子表达对LPS刺激(数字1 (b)和1 (c))。转录和分泌的抗炎细胞因子il - 10在csf高分化的巨噬细胞与gm - csf细胞治疗。LPS刺激M-BMDMs导致增加il - 10表达转录和蛋白质水平。在24小时,Il10信使rna回到几乎基准面,而蛋白质分泌依旧很高。il - 10的蛋白质分泌明显高于在M-BMDMs 8 h LPS刺激后而GM-BMDMs只显示基底il - 10的表达。
促炎细胞因子il - 12和IL-23被发现被表达在gm - csf中巨噬细胞而M-BMDMs更高水平只显示最小的促炎细胞因子的表达,虽然有类似的动力学表达式如图S1A GM-BMDMs(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/245804)。细胞因子表达的差异在统计上显著的转录和蛋白质含量。Il12b信使rna在GM-BMDMs诱导LPS刺激后,观察8 h后的最高水平的刺激。的分泌IL12p70从4 h的刺激开始增加。尽管M-BMDMs低水平的表达Il23a信使rna 1 h的刺激后,他们没有分泌heterodimeric IL-23蛋白质在任何时间点。在GM-BMDMsIl23a信使rna表达1 h (LPS刺激后达到高峰,而IL-23蛋白质分泌LPS刺激后延长至24小时。
我们还指出,IRF5水平增加M-BMDMs在LPS刺激但没有导致重要的促炎细胞因子诱导。因此,我们假设,这可能是由于较低的功能活动IRF5 M-BMDMs, IRF5蛋白质受转译后的修改如磷酸化和泛素化22- - - - - -24]。然而,转译后的修改的状态在LPS刺激巨噬细胞IRF5尚未确定。此外,激活代数余子式的可用性可能所需IRF5介导促炎细胞因子可能不同的感应M-BMDMs GM-BMDMs相比。
因此,提出符合其角色的主调节器M1巨噬细胞表型和按照数据为人类在体外分化的巨噬细胞(14),gm - csf分化BMDMs IRF5和生产高水平表达的il - 12以及IL-23与LPS刺激后,而csf分化BMDMs表达低水平的IRF5并产生il - 10。这些数据证实弗利特伍德的研究等。4表明gm - csf和M1和M2 - csf诱发明显BMDM表型,分别。
3.3。特定的细胞内IRF5染色- csf和gm - csf BMDMs派生而来
为了建立细胞内IRF5染色,表达是通过测量荧光激活细胞分类(流式细胞仪)的如果和LPS刺激通用,M-BMDMs分化的第九天。已知的细胞表面受体M1和M2巨噬细胞的标记,MHCII,和CD206(甘露糖受体),分别以及锅巨噬细胞标记F4/80被用作控制IRF5染色的特异性。
大约70%的csf中巨噬细胞和(图2(一个))。gm - csf分化的巨噬细胞,另一方面是一般只有1 - 2%的人表示CD206。据报道,尽管F4/80高度表达对所有组织巨噬细胞,gm - csf派生细胞只显示低F4/80 +细胞的比例。这可能是因为gm - csf还可以诱导分化为dc,有效地导致代DC-like巨噬细胞(25]。相反,如果gm - csf派生BMDMs表达MHC II的80%,而在CD206积极M2巨噬细胞只有10%的细胞表现出这个标志(图的表达2 (b))。IRF5相似分布观察,超过70%的如果GM-BMDMs是IRF5 +相比只有5%的如果M-BMDMs。总之,大多数如果M-BMDMs显示M2 CD206标志和F4/80而GM-BMDMs缺乏后者但表达MHC II和IRF5 M1标记。如果细胞基底IRF5水平量化使用平均荧光强度(MFI)(图2 (c))。IRF5 MFI的gm - csf中巨噬细胞被发现6倍高于- csf分化的巨噬细胞。IRF5水平的量化差异的分析进一步证实了IRF5 mRNA和蛋白水平在这些样本(图印地)。
(一)
(b)
(c)
LPS刺激只有最低限度的表达增加F4/80 CD206 GM-BMDMs,在M-BMDMs的百分比 细胞增加了近90%。MHC II表达降低24小时LPS刺激后的细胞类型,与先前的报道表明,有限合伙人不一致导致巨噬细胞表达MHC II (26- - - - - -28]。的意义,IRF5人口+细胞增加到超过80% LPS-stimulated GM-BMDMs但保持不变在M-BMDMs IRF5与观察到的增加蛋白质含量检测到免疫印迹分析(图1(一))。虽然相同的抗体用于这两种技术,免疫印迹,蛋白质变性,而在流式细胞仪蛋白质是在本地配置。有可能在M-BMDMs原生IRF5蛋白质的构象不允许这种抗体的识别,除非变性。蛋白质的结构可以影响转译后的修改如磷酸化和泛素化也决定蛋白质的活动。正如上面强调的,IRF5被修改的方式刺激巨噬细胞是当前的研究课题。
因此,我们开发了胞内IRF5染色和证明M1巨噬细胞IRF5 +细胞的比例高于M2巨噬细胞。值得注意的是虽然在巨噬细胞,流式细胞仪染色IRF5挑战由于相对较高的二次抗体和巨噬细胞自发荧光背景。记者IRF5鼠标应变,类似于描述RelA-GFP敲入(29日),将进一步促进IRF5表达式的分析在巨噬细胞的数量和可能的其他细胞类型在活的有机体内模型。此外,它将有助于分析细胞内的本地化IRF5回应刺激。
3.4。IRF5表达巨噬细胞在炎症在关节炎的实验模型
antigen-induced关节炎的最后,我们利用小鼠模型来探索的可能性使用IRF5作为炎性巨噬细胞在疾病的标志。七天后小鼠接种mBSA和引起的关节炎是关节内注射mBSA(影响膝盖)或PBS(控制膝盖)(图3(一个))。影响膝盖和控制膝盖注入和收获两天后进行流式细胞仪分析。此外,RNA分离从膝盖到mRNA水平的研究Irf5和巨噬细胞标记的炎症。选择标记的伊诺和Fizz1分别为M1和M2巨噬细胞(30.,31日]。
(一)
(b)
(c)
(d)
巨噬细胞被定义为CD45 + CD11b +, F4/80 +细胞。在这个人群中,我们确定了促炎(MHC II + CD206−)和抗炎(MHC II-CD206 +)巨噬细胞子集。巨噬细胞总数量的比例,以及炎性巨噬细胞子集在炎症显著增加膝盖相比控制膝盖(图3 (b))。相比之下,CD206 +巨噬细胞被发现的比例显著降低抗原后的挑战。这些结果也表明,有大量的巨噬细胞不符合类别。这可能反映了巨噬细胞可塑性和大范围的程度在活的有机体内巨噬细胞亚型(32]。这尤其适用于疾病设置传入的巨噬细胞可能在两极分化的不同阶段,炎症环境不断变化。
量化的IRF5流式细胞仪在巨噬细胞染色表明,增加IRF5表达式中可以检测到膝盖(图的影响3 (c))。当IRF5水平在每个人口巨噬细胞分别进行评估,这是发现炎性巨噬细胞表达IRF5的相对较高的水平。CD206 +巨噬细胞表达IRF5少但也显示轻微增加膝盖发炎,建议其余CD206 +巨噬细胞炎症表达更多IRF5比之前的挑战。的在活的有机体内数据证实了这些发现在体外分化的巨噬细胞,促炎巨噬细胞表达高水平的比CD206 IRF5 +巨噬细胞。
分析整个膝盖的RNA提取支持这些观察和证明Irf5转录水平显著增强膝盖(图的影响3 (d))。表达式的M1标记伊诺明显高于mBSA膝盖而注入Fizz1表达减弱。总的来说,这些结果表明,有越来越多的促炎的巨噬细胞的炎症与IRF5信使rna和蛋白质的增加。因此,我们得出这样的结论:IRF5是一个适当的标记检测巨噬细胞炎性关节炎疾病模型。然而,必须牢记,虽然IRF5水平内巨噬细胞数量增加,这可能不一定转化为高蛋白质活动自磷酸化状态和细胞不考虑本地化。它已经表明,IRF5经过转译后的修改,由磷酸化和泛素化22- - - - - -24]。然而,IRF5激活的作用在疾病没有得到广泛的研究和进一步的研究需要阐明这(33]。
最近,IRF5用作M1指标巨噬细胞渗透在屋尘螨引起的哮喘动物模型(34]。尽管这项研究并未详细描述IRF5表达巨噬细胞的表型,这表明IRF5可以用作标志设置和组织在不同的疾病。这尤其重要,因为IRF5将不仅与RA还与其他自身免疫性疾病如炎症性肠病、哮喘、和系统性红斑狼疮35- - - - - -38]。
它最近变得清晰,除了巨噬细胞来源于浸润骨髓单核细胞中产生,tissue-resident不同来源的巨噬细胞在炎症(可能也发挥着至关重要的作用39,40]。此外,转录分析来自不同来源的巨噬细胞异质性的巨噬细胞的数量和揭示组织转录签名(32]。这表明特定的转录因子识别子集需要梳理的贡献不同的巨噬细胞亚型在炎症过程中,尤其是在慢性炎症或自身免疫疾病,到目前为止收到的关注更少(41]。我们假设IRF5可以扮演关键角色在跟踪各炎性疾病炎症巨噬细胞。
4所示。结论
最后,这项研究清楚地表明,IRF5小鼠炎性巨噬细胞中高度表达,可以利用作为一个可靠的标记位点的巨噬细胞炎症。小鼠GM-BMDMs表达IRF5和促炎细胞因子在体外当挑战与有限合伙人。我们表明,它是可能的标签在这些炎性巨噬细胞、细胞内IRF5以及巨噬细胞在膝盖发炎antigen-induced关节炎的实验小鼠模型的发展。因此,这项研究描述了一个有用的方法来跟踪炎性巨噬细胞和小鼠疾病模型演示了其可行性。
补充材料
促炎细胞因子表达M-BMDMs IRF5表达式,用于细胞内IRF5染色样品。a - csf分化细胞的挑战与有限合伙人指定的时间段。在每个时间点RNA(顶面板)和上层清液(底板)收集。误差线代表的标准误差n= 5。这些数据是一样的在图1,但排除gm - csf数据集。b . Irf5转录水平衡量实时PCR。实验重复误差代表标准偏差。IRF5和蛋白质含量β肌动蛋白免疫印迹测定。RNA和蛋白质样本从一个实验为图2 c用于生成数据。