文摘

客观的。探讨血管内皮生长因子(VEGF)的表达抗血管新生同种型 在人类肌肉特发性炎性肌病(IIM)和血管生成/抗血管新生vegf的分布进行比较,在其他自身免疫性疾病亚型变化描述。对象和方法。我们分析了 并通过免疫印迹和免疫组织化学VEGF-A骨骼肌活检从21患者影响IIM(多肌炎、皮肌炎和包涵体肌炎)和6控制肌肉样本。TGF -β著名的VEGF电感器,类似地评估。群际检测免疫印迹乐队密度在统计学上的差异。Endomysial血管化、炎症评分和肌肉再生,作为IIM的病理参数,定量确定,水平面对VEGF表达。结果。 在IIM显著调节,以及TGF -β。对影响肌纤维VEGF-A是广泛表达,而再生/萎缩性myofibres VEGF-A异型体的强烈反应。大多数人肌内膜血管炎性细胞和表达两个亚型。 水平在炎症分数正相关,endomysial血管化,TGF -β。结论。我们的研究结果表明骨骼肌抗血管新生的表情 和优惠upregulation IIM,表明调制VEGF-A亚型在myositides可能发生。

1。介绍

特发性炎性肌病(IIM)包含三个子集:皮肌炎(DM)、多发性肌炎(PM)和零星的包涵体肌炎(IBM)有明显的免疫病理过程模式。人肌内膜毛细血管,在DM,补体沉积在微血管,和主要血管周的炎症是观察,而点和IBM显示t细胞入侵在IBM的肌肉细胞退行性特征。最近,坏死性自身免疫性肌病(南),缺乏或根本没有炎症,被公认为第四个IIM实体(1]。IIM炎症效应物的表达是广泛调查,从药理针对免疫调节因素越来越被认为是一种有效的治疗工具(2- - - - - -4]。

血管内皮生长因子(VEGF)家族由一群强有力的内皮细胞有丝分裂原。VEGF-A、血管生成生长因子、炎性介质和促进血管渗透性,是由各种类型的细胞,包括细胞和炎症细胞。它的表达式是由多个分子转录监管:生长因子、激素、和致癌基因(5]。可变剪接的八个外显子VEGF-A基因生成一个家庭内的蛋白质,名叫根据他们的氨基酸数目,VEGFxxx。VEGF家族包括proangiogenicxxx和反血管增生xxxb亚型,原始备用终端外显子拼接选址。分子长度相同但是不同的c端氨基酸序列和反对生物对血管生成的影响:proangiogenic VEGFxxx亚型是由近端拼接选址和反血管增生VEGFxxxb亚型的远端拼接选址(6]。 是第一个发现反血管增生VEGF分子(6]。抑制血管生成的VEGFxxxb亚型是由于竞争受体结合,抑制受体磷酸化,和下游的细胞内信号7]。

在目前的工作中,我们调查了组织的本地化 和VEGF-A IIM以及转化生长因子-β(TGF -β),参与血管生成和增殖过程和著名 电感,连同myositides的病理参数。

2。对象和方法

2.1。病人和诊断程序

肌肉样本档案与IIM 21例患者诊断性活检标本的影响,目前的临床病理的诊断标准(1),DM ( ),点( )或IBM ( )。人口数据表1。控制样品,我们肌肉活检标本处理( )对象抱怨肌肉疼痛,或与正常或轻度痉挛,增加血清肌酸激酶水平和正常或轻度肌病肌的发现。我们只选为控制对象的肌肉组织学、组织化学、免疫组织学、超微结构的形态学结果正常,排除炎症、degeneration-regeneration,去神经,或者改变代谢存储的暗示。所有受试者签署知情同意与津贴科学利用肌肉样本为研究目的。标本被冻结在液体nitrogen-cooled异戊烷和存储在−80°C到使用。低温恒温器部分,10μ米厚,提交诊断常规组织学和组织化学染色。

表1
人口统计数据。
2.2。免疫印迹分析

世行分析肌肉对照组样本和IIM患者进行标准程序。肌肉样本细胞溶解radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区;蛋白质(40μg负载)被sds - page分离4 - 20% Tris-Glycine预制的凝胶(表达载体S.R.L.意大利米兰)和转移到硝化纤维膜。阻塞后,样本主要抗体孵育VEGF-A(鳕鱼。MAB3734;美国密理博公司Billerica的), (Abcam Plc,剑桥,英国),TGF -β(圣克鲁斯生物技术有限公司,圣克鲁斯,CA,美国),和β肌动蛋白(细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,妈,美国),然后用适当的二次抗体。结合抗体被可视化增强化学发光(ECL检测设备,通用电气医疗集团,意大利米兰),和乐队密度被使用量化使用NIH图像软件β肌动蛋白带正常化。

2.3。免疫组织化学

炎症免疫组织学诊断分析(HLA-ABC C5-b9, CD4、CD8 CD11b, CD20, CD45Ro-Dako,斯特鲁普,丹麦;Carpinteria、钙、美国)7日进行μ米厚的低温恒温器部分silane-coated幻灯片(StarFrost;Knittel格拉泽,布伦瑞克,德国)。Immunolocalization VEGF-A和 进行连续部分。免疫组织化学TGF -β和内皮标记CD31 (Dako),船舶检测,也进行了。再生纤维是被antifoetal肌凝蛋白重链抗体(Novocastra实验室有限公司、纽卡斯尔、英国)。分析是由immunoperoxidase技术,由HRP-labeled聚合物(Dako),和3、3′-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich、米兰、意大利)可视化。消极的控制主要的抗体进行的遗漏。

2.4。免疫组织化学定量分析幻灯片

形态测量学是由蔡司显微镜AxioPlan2配备AxioVision 4.6软件(卡尔蔡司视觉GmbH, Hallbergmoos,德国)。人肌内膜血管的密度,炎症的程度,以及肌肉再生的实体进行评估,作为组织病理学参数肌炎。

人肌内膜血管的密度是表示为数字/毫米2肌肉区域通过计算整个CD31的部分应用。炎症评分评估部分彩色激活白细胞CD45Ro的标志。对于每一个样本,三个随机选择的字段在100 x放大分析自动化的比色像素评估、检测过氧化物酶反应产物。CD45Ro过氧化物酶标记的区域和整个领域的面积测量:炎症得分是表示为CD45Ro +总面积的百分比。

再生指数表示为胎儿肌凝蛋白重链活性纤维的百分比的考试至少700纤维。

2.5。统计数据

数据,采用SPSS统计软件进行评估。IIM检查作为一个整体与控制和单独的子组。群际可变性分析Mann-Whitney配对分析,试验和方差分析是由克鲁斯卡尔-沃利斯检验多个组。斯皮尔曼等级测试是用于分析WB乐队密度之间的相关性和其他研究病理参数。意义是 。数据表示为±SD方法。

3所示。结果

3.1。免疫印迹
3.1.1。VEGF-A和VEGF-A165 b

VEGF亚型都较高的蛋白质含量IIM主题(图1)。VEGF-A增加大约30%和2.5倍 与控制(图1 (b))被观察到。 显著调节IIM子组的DM, IBM和点与控制;组间方差分析evidentiated显著更高水平的 在IBM和PM和DM(图1 (c))。这一比率 / VEGF-A IIM(图中显著增加1 (d)),表明抗血管新生的优惠upregulation亚基:IIM (最低0.15,最大值2.09);任务: (最小0.03,最大0.68)。点和IBM子组与控制(图明显不同1 (e))。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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图1
增加VEGF-A和 蛋白质表达炎性肌病。代表VEGF-A和 西方的屁股(a)。光密度VEGF-A和量化 乐队显示为比例加载控制β肌动蛋白在IIM (b)和DM, IBM和点的子集(c)。 / VEGF-A比获得了所有样品((d)、(e))。数据表示为任意单位从五个独立的实验。直方图代表平均值±SD。所有的统计显著差异报告。
3.1.2。TGF -

IIM样本显示TGF -一个几乎2倍增加β水平与控制(图2 (b)与统计学意义),IIM子集(图2 (c))。TGF -β蛋白质含量与VEGF亚型IIM呈正相关内容(数据2 (d)和2 (e))。

(一)
(一)
(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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图2
增加了TGF -β蛋白表达在炎性肌病。代表TGF -β西方的屁股(a)。光密度量化的TGF -β乐队获得了β肌动蛋白正常化((b)、(c))。直方图代表平均值±SD从五个独立的实验。所有的统计显著差异报告。TGF -β水平与VEGF-A正相关(d) (e)。
3.2。免疫组织学
3.2.1之上。VEGF-A, VEGF-A165 b,和TGF - 本地化

肌肉纤维显示本构细胞质表达VEGF-A扩散,在控制(图3(一个)IIM)和(数据4 ;4 ;4 ;4 )。细胞质的本地化 人肌内膜血管在控制肌肉非常微弱,出现蛋白质的主要来源(图3 (b)IIM)和形态正常纤维(数字4 ;4 ;4 ;4 )。肌炎、萎缩性和再生纤维(图4 由胎儿肌凝蛋白(图),确定4 亚型),强烈反应。一个温和的 在大多数nonregenerating upregulation观察,形态正常纤维(图4 ),neolocalization MHC I分子HLA-ABC(图4 )。坏死纤维,由存款终端复杂的补充(图4 ),没有VEGF或显示 表达式(数据4 - - - - - -4 )。IBM有液泡的纤维(数字4 - - - - - -4 )强烈的表达 有框的邻接的液泡,IBM的病理特点。围萎缩性DM的纤维也显示增加VEGF的表达亚型(数字4 - - - - - -4 )。领域的VEGF upregulation显示大量VEGF-A / co-localization但是更强大的分散应用和高发生焦反应性存款是独特的 特性(数据4 - - - - - -4 ,4 - - - - - -4 )。两个vegf表达的也多数毛细血管的内皮(数据4 - - - - - -4 人肌内膜血管(图)或更大4 - - - - - -4 )。单核细胞浸润的发生与稀缺VEGF-A染色观察对象提交给类固醇治疗(图4 ),而 表达式是维护(图4 )。在活检进行治疗之前,炎症细胞VEGF亚型(人物的强烈反应4 - - - - - -4 )。TGF -β发现在邻接浸润的炎性细胞和肌肉纤维,以及血管壁(图4 ),在大量colocalization vegf(数字4 - - - - - -4 )。

(一)VEGF-A
(一)VEGF-A
(b)
(b)
(c)消极的控制
(c)消极的控制
图3
Immunohistological VEGF亚型的分布控制肌肉。(一)——(c)连续部分。扩散VEGF-A肌纤维的胞质染色观察(一);非常温和的胞质 人肌内膜稀疏单核细胞反应性,染色较强的人肌内膜小血管和(b),没有污点遗漏负控制幻灯片的主要抗体(c)。


图4
代表VEGF-A immunohistological分布的图像, ,TGF -β在炎性肌病。 连续的部分中,IBM。再生纤维(星号),嗜碱(1)和反应胎儿肌凝蛋白重链(1 d),显示VEGF-A upregulation (1 b),对基底的表达相邻纤维。这些纤维是强烈 反应(1 c),相比之下较低或相邻的零活性纤维,并显示高活性疫源地。人肌内膜血管弥漫性VEGF-A和小 反应性。一个温和的 upregulation (1 c:箭头)是观察到nonregenerating纤维显示sarcolemmal和细胞质HLA-ABC neoexpression (1 e:箭头)。 负控制幻灯片。 连续的部分,点。坏死纤维,由存款终端复杂的补充,或membranolytic攻击复杂(MAC)(2:箭头),不表达既VEGF-A (2 b:箭头)也 (2 c:箭头),出现不起化学反应的苍白的元素。单核细胞和部分入侵周围坏死纤维(2 c:星号)的强烈反应 。 连续的部分中,IBM。纤维和有框的液泡(3,箭头)显示VEGF-A upregulation (3 b,箭头),偶尔的高活性疫源地, upregulation与多个点的反应(3 c,箭头)。单核细胞浸润显示一种稀缺反应VEGF-A (3 b),而他们强烈的表达 。 IBM。TGF -β(3 d)表达人肌内膜船大(箭头)和炎症细胞。肌肉纤维直径较小的显示更高的反应性。在不相邻的串行部分,本地化的VEGF亚型观察到((3 e) -(3))的容器。星号标识一个纤维炎症细胞包围。 连续部分,DM。围萎缩性纤维(箭头)显示增加了血管生成反应(3)和反血管增生(3 b) VEGF亚型。单核细胞还反应两种亚型。
3.3。定量分析
3.3.1。人肌内膜血管的密度

人肌内膜血管化的变化被发现,因此文献数据。IBM的案例显示,血管密度明显高于控制(图5(一个))。方差分析在IIM子集evidentiated人肌内膜血管化明显高于在IBM和PM和DM。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
图5
在炎性肌病病理参数的定量分析。(a)显著增加血管密度在IBM的情况下检测到。PM和DM病例显示轻微减少船舶密度。(b) IBM病例显示炎症得分最高。§DM异常,异常高炎症评分,一例严重的多种DM,高度的肌纤维坏死和炎症。(c)再生指数:再生的发生显示主体间高可变性,IIM子集。值的±SD报告为手段。所有的统计显著差异报告。

IIM Endomysial血管密度与VEGF-A正相关( , ), 水平( , ),以及 / VEGF-A比( , )。

3.3.2。炎症评分

IBM的案例显示,最高程度的炎症而其他组(图5 (b))。炎症评分在IIM正相关 水平( , ),以及与血管密度( , )。

3.3.3。再生指数

再生纤维的发生高度变量和子组内(图中5 (c)):IBM和点显示更高的百分比比DM再生。

TGF -再生指数呈正相关βIIM的蛋白质含量在整个集团( , )和 / VEGF-A比( , )。

4所示。讨论

目前的报告表明 是人类骨骼肌中表达及其水平IIM的强劲增长。

组成型表达VEGF的细胞被发现对毛细现象[监管是必要的8岁),在人类,人肌内膜毛细血管的低密度与VEGF当地减少(9]。因此,我们报告的VEGF增加IIM不是偏见,而是强调,由年轻的中值年龄控制检测不到发炎的迹象。

增加VEGF在托托在骨骼肌损伤后,与纤维再生,是记录10]。

基本最近的一项研究强调增加肌肉的表达VEGF-A IIM,与临床病理的相关性疾病的阶段,同时也具体解决问题的治疗影响(11]。糖皮质激素治疗(3 - 6个月)的PM和DM降低VEGF-A表达,反正住明显高于在控制,通过减少VEGF-A反应毛细血管和单核炎症细胞的数量,我们也观察到在治疗病人。因此类固醇的作用也可能是肌肉的调制 ;然而,最高水平的VEGF亚型都在我们组发现IBM的病人,通常对类固醇(4),所有提交1 - 4个月糖皮质激素治疗,前活检组织学诊断。

抗血管新生的组成型表达VEGF亚型(高度变量(复查12])。他们在高度表达下调血管生成组织,如胎盘(13),但他们可能达到总数的90% VEGF蛋白在结肠癌14]。

一项研究调查反血管增生VEGF-A亚型的人类肌肉没有检测 轻快、基底或后高频运动,在健康受试者,通过PCR (15),而以前的PCR (6),而ELISA (16识别的 骨骼肌的报道。骨骼肌血管丰富,免疫印迹或ELISA,在蛋白质水平和PCR在mRNA水平,不排除检测内皮细胞分子。我们认为,在正常肌肉,抗血管新生的VEGF表达的亚基主要是内皮细胞,炎症和萎缩共存的事件/再生IIM似乎引发很大 upregulation肌肉。一个基底本构 由细胞合成,对相邻的炎症细胞的扩散,也没有建议的污点,要么VEGF亚型,坏死纤维。特异性的利用 抗体,针对反血管增生COOH-terminal序列,进行完整的血管生成VEGF-A缺乏认识165年蛋白质由世行同种型,所记录的制造商(http://www.abcam.com/vegf - 165 b -抗体mrvl56 - 1 - ab14994.html)。两种亚型的染色模式的差异进一步支持抗体特异性。

研究解决备用远/近端站点拼接在人类疾病描述一个拼接切换到pro-angiogenic同种型angiogenesis-associated障碍,如实体肿瘤和糖尿病性视网膜病变(17,18]。的选择性upregulation反对 据报道与增生性玻璃体视网膜脱离相关,青光眼(19],fibrosing自身免疫性疾病的系统性硬化症(20.,21),减少血管生成。

在我们IIM样本,当地 优惠upregulation提出的增加 / VEGF-A比率。

研究数据 提供线索,阐明其增加IIM:生长因子及相关信号通路作用于VEGFxxx/ VEGFxxxb可变剪接(5,17),和多效性的纤维发生的TGF -β切换到远端站点是一个关键因素选择拼接合成的 (5,20.]。在我们IIM样本,如前所述[2,22),TGF -β是调节,我们观察到一个正相关TGF -β/ 通过免疫印迹。因此,特殊的 染色的退化/再生纤维可能与肌肉再生的分子事件,其中upregulation TGF -β发生(23),由相关程度的再生和支持 / VEGF-A比率。然而,缺乏直接相关VEGF-A /再生指数和温和 nonregenerating纤维neoexpressing主要组织相容性complex-I定位,改变符合肌纤维激活(了24]),建议其他因素显著 IIM upregulation。免疫组织学显示TGF -β反应内皮细胞和炎症细胞也是一个重要的来源 。这一发现炎症评分/相关联 和VEGF亚型/船舶密度正相关性。

虽然我们的病人的子组数值太小,让一般的结论,IBM人肌内膜血管炎症评分和密度较高,IBM的一个承认病理特征(3),导致我们的学习严格相关 / VEGF-A比,似乎同意更高 表达式。这显然是有争议的问题可能取决于引发的负面反馈 。事实上,它提出了6,25), 可以抑制VEGF-A-mediated内皮细胞的增殖和迁移,通过counterregulatory机制,限制的速度新创肌肉斜阳能力。

此外,缺氧,一个强大的VEGF调制代理(14,21,26,27),由于微血管的参与,有一个角色在所有的细胞因子的主要通过激活电路IIM子集,粘附分子,白细胞招募(3]。骨骼肌与VEGF-A基因表达增加反应缺氧引起的急性运动(27]。作为一个电感的TGF -β(28),缺氧会导致额外的诱发因素的地方 IIM的增加。

有趣的是,除了抗血管新生作用,cytoprotective活动 对缺血性损伤最近记录结肠上皮细胞(14)和视网膜上皮和内皮29日),因此它的复合生物效应仍需阐明。

5。结论

当地VEGF在炎症和坏死反血管增生开关/骨骼肌的再生可能依赖于一群体液和细胞效应器,可能参与组织抵御炎症过程。

VEGF治疗调制的亚型是目前在癌症研究12,14)和眼内血管生成障碍(17,考虑到潜在的发展在自身免疫性疾病的系统性硬化症(20.,21),进一步的研究需要一个完整的理解之间的平衡反血管增生和proangiogenic VEGF在炎性肌病亚型。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Nila沃尔皮和朱塞佩•Valacchi同样导致了这项研究。

补充材料

控制情况:VEGF一个表达的肌肉纤维IBM(相邻部分的图3 - 1 a e) -控制的遗漏主要抗体。没有出现在纤维染色,血管和结缔组织。

  1. 补充材料