支气管全氟化碳减少炎症活动前后肺移植的动物实验模型

文摘

背景。本研究的目的是评估使用的全氟化碳液体(PFC)作为肺癌的辅助物质保存和评估其在移植后肺保护作用。方法。七十二鼠肺刷新低钾葡聚糖(LPD)解决方案和随机分为三类:控制与LPD孤独和实验3 (PFC3)和7毫升/公斤(PFC7)支气管PFC灌输刚刚收割。每组分为四组根据保留时间(3、6、12和24小时)。之后,我们进行了肺移植用鼠肺保存12小时LPD单独或与支气管PFC 7毫升/公斤。结果。有显著增加氧化应激在对照组6 h(冷缺血时间较PFC3和PFC7组。凋亡活动和NF -B的表达显著高于对照组与PFC组3相比,12日和冷藏24小时。移植后,NF -B,进气阀打开,硝基酪氨酸表达式以及半胱天冬酶3活动在PFC组显著降低。结论。支气管PFC作为佐剂的使用当前保护策略提高移植物的生存能力。

1。介绍

肺移植是治疗终末期肺病患者(1]。在术后早期接受者可能会出现严重的并发症如缺血再灌注(IR)损伤,急性排斥和感染(2]。红外损伤影响多达20%的患者肺移植后,可能导致严重的原发性移植物功能障碍,增加发病率和死亡率(3]。

严重原发性移植物功能障碍的最终结果是一系列事件发生时间的脑死亡的移植后肺再灌注(4]。策略来阻止肺功能障碍导致红外受伤一直专注于供体肺的选择性评价5),有效的肺保护技术(6后,小心的管理移植肺再灌注(7]。

肺移植后早期再灌注损伤最初通过激活先天免疫反应介导的肺的肺泡巨噬细胞供体与随之而来的促炎细胞因子的生产,加重炎症反应,导致细胞死亡通过凋亡途径(8- - - - - -12]。更长的缺血期导致细胞死亡的不断升级的比例,导致肺功能的一个重要精神错乱,这表明积极的保存时间和器官性能之间的相关性(13]。这种炎症反应和诱导细胞凋亡可能由核转录因子(NF -κBB),这将触发的肺损伤和细胞死亡途径具有重要的意义8,14]。

许多研究已经进行优化肺保护的技术(15- - - - - -19]。肺移植检索包括肺部的冲洗和低温保存的解决方案来减少其代谢率和能源需求在存储(20.]。虽然低温器官保存策略仍然是一个至关重要的组成部分,它是什么,然而,相关的一系列事件,可能诱发的upregulation分子在细胞表面膜和促炎介质(21]。

全氟化碳液体(全氟化物)支气管一直用于管理不同的肺损伤模型(22,23),主要是作为替代肺通气的方法,称为部分液体通气(19]。全氟化物洗掉肺泡碎片,招募倒塌的肺泡,改善气体交换,保护肺结构和有抗炎、抗氧化24,25]。有一个有限的研究在肺移植的设置使用支气管全氟化物,冲突的结果(19,22,26]。

本研究的目的是评估使用液体PFC作为辅助肺保存和移植后肺保护性物质地位。这项研究是为了测试的影响不同的PFC剂量不同保存时间和评估PFC在细胞死亡的影响,炎症反应,氧化应激在移植肺移植。

2。方法

所有实验动物手术涉及的协议研究医院的伦理委员会批准的丹尼·德·阿雷格里港。所有的动物获得了人道关怀的按照国家研究委员会(指导的护理和使用实验动物,NIH修订19)。雄性Wistar鼠从医院的中心动物实验室体重介于250和300 g用于所有动物实验。

2.1。PFC剂量与保存时间的研究

定义的PFC支气管肺保护管理,我们评估三种不同剂量方案。最初,我们测试了3、7和15毫升/公斤体重的PFC支气管试点研究。二十个雄性Wistar鼠被分成四组(根据PFC剂量)。一个对照组没有使用曼宁动物麻醉(氯胺酮100毫克/公斤,甲苯噻嗪15毫克/公斤,腹腔内接种)和通风的潮汐卷8毫升/公斤的体重,呼吸速率为70 - 80次/分钟,一小部分氧气0.2(室内空气)的启发,和积极的呼气压力2厘米H₂O(哈佛啮齿动物呼吸机,683型;美国哈佛大学仪器有限公司,米尔斯的)。动物被通风15分钟稳定生理参数。据PFC的剂量计算每组,剂量被分成三个相等的整除,每隔一分钟管理通过气管切开术(室温)来实现均匀分布。PFC管理后,动物是通风30分钟,心肺块收获了组织学和形态学分析。形态测量学是基于韦贝尔建立的技术。(27),包括确定的次数,肺实质的结构相交的直线。

剂量的研究完成后,另一个72雄性Wistar鼠体重250 - 300克被用于剂量与保存时间研究。其它地方描述的动物准备肺灌注(28]。保存执行使用20毫升的低钾葡聚糖葡萄糖保护解决方案(LPD)在4°C通过广泛性、中空的肺动脉与污水的排水通过左心房。冲洗后,肺被随机分为3组():控制的肺与LPD刷新;PFC 3毫升/公斤(PFC 3),和PFC 7毫升/公斤(PFC 7)管理通过气管切开术在室温和灌注LPD的解决方案。每组分为4个亚组()根据保留时间(3、6、12和24小时)。

分析变化的硫代巴比土酸活性物质(TBARS),确定半胱天冬酶3和NF -B(亚基p65)活动,TUNEL原位(终端dUTP缺口末端标记)染色在肺移植被用来评估肺保护的质量。

2.2。原位左肺移植研究团体

原位左肺移植手术使用修改后的袖口技术我们之前描述的28]。简单地说,与腹腔内氯胺酮全身麻醉后(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪(15毫克/公斤),气管插管仍,机械通气,抗凝(300 U肝素),平均sternolaparotomy,供体鼠肺提交20毫升的广泛性、冲洗通过肺动脉冷(4°C) LPD解决方案的压力20厘米H₂o .心肺块提取与肺膨胀end-tidal体积。左肺移植是孤立的,准备,并存储在在4°C LPD 12小时。收件人动物麻醉,气管插管(14号导管),和通风。然后他们接受了左胸,左支气管和肺血管网状使用标准袖口技术(9]。移植进行每组6动物,总计24动物。平均动脉压和动脉血液气体分析测定15分钟后在仰卧的通风和观察期结束。

肺移植组(肝移植组),移植进行如上所述。第/ PFC集团PFC的剂量7毫升/公斤灌输支气管前心肺收成。冷缺血12小时后,以相同的方式执行肺移植的肝移植组。120分钟的再灌注后的动物实施安乐死。一半的左肺切除和存储在−80°C,而另一半是存储在10%福尔马林。

2.3。氧化应激和抗氧化酶

醛的量所产生的脂质过氧化作用被TBARS测量方法,衡量物质的量与硫代巴比土酸反应(29日]。超氧化物歧化酶(SOD)的分析是基于超氧化物自由基的反应的抑制肾上腺素(30.]。过氧化氢酶(CAT)活性的分析是基于测量的减少过氧化氢形成(31日]。

2.4。半胱天冬酶3活动分析和TUNEL染色

半胱天冬酶3活动进行了分析描述Forgiarini et al。32)和TUNEL费舍尔等人所描述的研究。13]。

2.5。西方墨点法

从冷冻肺肺匀浆准备(−80°C)为p65亚基的表达和分析,半胱天冬酶3和硝基酪氨酸(美国细胞生物技术信号,波士顿,MA),和伊诺(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)通过免疫印迹分析(33,34]。

2.6。免疫荧光

我B和半胱天冬酶3免疫荧光染色法进行石蜡包埋部分deparaffinization后乙醇、二甲苯和水。首先,主要多克隆抗体anti-IB和anti-caspase 3(美国细胞信号生物技术,波士顿,MA)在1:一夜之间,1000年被孵化在4°C。Cy3-conjugated山羊anti-rat二级抗体(西格玛奥德里奇,美国)1:200年孵化1小时。山羊血清和主鼠抗体作为消极的控制。2小时内安装片是可视化奥林巴斯蔡司荧光显微镜。

2.7。肺组织学

肺组织标本在福尔马林固定,脱水,清除和嵌入在石蜡。标本切成8μm序列部分和沾苏木精伊红。一个病理学家被抽样的实验协议和该地区通过光学显微镜进行了定量分析。每个样本检查在低和高功率领域。至少四个部分是来自每一块,和20个字段被随机选择和分析每个部分。组织学病变的严重程度是由分数(他:组织学评分)35]。

2.8。统计分析

数据表示为±标准差。单向方差分析(方差分析)是用来确定统计学意义。的值被认为是具有统计学意义。当达到统计学意义是,随后使用Student-Newman-Keuls测试事后分析。使用双尾未配对的非参数的数据进行了分析测试。数据分析使用社会科学统计软件包版本17.0统计软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

减少线性拦截被发现当PFC7 PFC15肺肺与控制()。然而,PFC15肺显示更明显减少的数量交叉septae相比PFC3和PFC7肺()。此外,因为所有PFC15肺肺泡破裂提出septae由于过度伸张,我们决定排除15毫升/公斤剂量实验。

当脂质过氧化作用是评估不同的肺保护时期,PCF3之间有显著差异,PFC7组织脂质过氧化反应产品的数量在3个小时的保护()。在6个小时,我们观察到显著增加在对照组相比PFC3和TBARS PFC7 ()。然而,在保存24小时,没有差异有无PFC(图组1)。当细胞凋亡是衡量半胱天冬酶3活动,显著增加肺的对照组观察与保护肺的组织利用PFC相比在肺部提交6中,12和24小时的存储()(图1)。TUNEL染色显示更多FITC-positive细胞的存在(TUNEL-positive)的保存(图3和12个小时2)。

NF -的表达B是显著降低3、12和24小时的保护PFC肺与控制肺()。然而,肺保存24小时后,显著减少NF -的表达B被发现PFC7组与肺PFC3组()(图1)。

移植后,没有不同的脂质过氧化和抗氧化酶PFC和对照组之间在TBARS和过氧化氢酶化验。超氧化物歧化酶的活性明显高于肝/ PFC组与肝移植组()。

动脉氧的分压(PaO₂),二氧化碳(帕科₂)、平均动脉压(MAP)没有任何明显的两组之间的差异在不同的时间点(表1)。肺移植后,有一个显著增加的核易位NF -B(亚基p65)在肝移植组与肝/ PFC集团()(图3)。也有显著增加伊诺肝移植组的表达式和半胱天冬酶3表达式()与肝/ PFC(图组3)。观察相同的模式对硝基酪氨酸(图3)。当我们评估免疫荧光细胞凋亡和抑制NF -我的抑制剂B,我们观察到半胱天冬酶3的增加和减少B在肝移植组。然而,肺部受到保护与液体PFC显示下降半胱天冬酶3和抑制磷酸化的我B(图4)。

肺肝移植组的组织病理学显示严重肺形态学变化特征是细胞浸润,肺泡septae增厚,肺不张,没有观察到肝/ PFC组。组织学损害的严重程度的分析使用组织学评分(他)显著减少肺损伤肝/ PFC组与肝移植组(图5)。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,全氟化碳液体管理支气管能够改善肺保护和减少了有害的影响红外受伤。据我们所知,本研究是第一次报告的好处在肺保护肺移植的实验模型。

最初,PFC管理到航空公司提高移植物保护和评估两种不同的PFC在四个不同冷藏时间剂量。PFC剂量(3和7毫升/公斤)能够减少细胞凋亡和炎症反应的时间长达12个小时的保护与对照组相比。我们的研究不同于费舍尔等人的研究(13]显示,几乎没有细胞凋亡和细胞死亡大鼠肺保存12 h。然而,这些作者有显著提高细胞死亡在18和24小时的保护,这是类似于我们的发现。这个微小的变化可能来自不同的技术用来演示细胞凋亡在这两项研究。

在我们的研究中,半胱天冬酶3中的PFC取得了显著减少活动24 h,这是一个指示器,PFC可能移植提供额外的保护。另外,我们观察到显著减少TUNEL-positive细胞7毫升/公斤,显示更少的坏死细胞24小时。

另一个重要的球员在移植保存NF -的存在B,是至关重要的一个重要快速反应转录因子调控细胞凋亡和移植后可以触发炎症反应(8,14通过复杂的离解和我)b释放p65。我们的研究表明,7毫升/公斤PFC显著降低p65活动相比,3毫升/公斤24小时。这一发现使我们能够定义7毫升/公斤是理想的剂量与炎症活动赋予再移植保存。

在我们的实验性肺移植模型中,我们使用肺保存12小时,这与对照组凋亡细胞的表达最高。这一发现将是潜在可逆细胞活性。

全氟化碳在表面活性剂系统具有保护作用,肺泡膜(36]。尽管PFC氧气和高有限公司₂扩散能力,我们没有观察到任何改善气体交换后两组肺移植。这些发现可以与缺血时间,因为在12小时,坏死细胞的数量不足以诱导可检测的生理变化。此外,对侧肺可以负责维护足够的气体交换,因为它并不排除在我们的模型中。此外,在肺移植模型,映射在两组相似,证明PFC没有导致任何血流动力学不平衡posttransplantation时期。

评估氧化应激的过氧化氢酶和TBARS不够敏感,在我们的模型中。等测试isoprostane量化可以演示更早该设置的变化。之前的研究中发现了类似的结果Pilla et al。10在缺血预处理的动物模型。然而,研究使用不同的技术发现显著差异在类似的氧化应激动物模型的肺移植(9,37]。最后,支气管PFC已被证明对活性氧保护肺肺移植后,证明了超氧化物歧化酶的增加(38]。

肺移植后再保存期限有红外受伤严重,一个重要的肺功能障碍,和死细胞的数量增加21]。半胱天冬酶活动的镇压已被证明与细胞凋亡减少(13]。我们的研究表明,PFC可以显著抑制半胱天冬酶3的表达,从而表明有一个减少细胞死亡。表示“四”等。39]表明,细胞死亡过程的开始似乎发生在更早的阶段的红外比先前认为的伤害。还3和8活动后立即有了显著提高肺部与LPD刷新。这样的红外光谱研究结果表明,机制损伤以及程序性细胞死亡中早就开始红外受伤,继续影响细胞内的过程即使在寒冷的缺血性存储。

在我们的研究中,PFC移植后显著降低伊诺表达式,表明其对红外的抗炎和肺保护特性。此外,PFC的化学和物理性质带来额外的保护肺部,防止肺泡塌陷和保护肺泡结构。最近,使用模型的缺血再灌注损伤(32),为了避免变量的干扰可能影响结果的肺移植模型,我们表明,支气管PFC的使用减少了炎症反应,肺泡结构,保存和保护肺部的有害影响红外损伤(40]。

利用PFC的基本原理主要是保护肺部一旦建立了肺损伤(19,23,26,40]。基于这样的观察和本研究的结果,这表明之前的PFC也可以使用出现严重的肺损伤,肺移植可以PFC可以提供一个合适的模型移植物保护和红外伤害减少。

我们认为,在目前的动物模型,使用支气管PFC佐剂当前保护策略改善移植保护和减少红外损伤肺移植后的有害影响。未来的研究在一个更大的动物模型是必要的确认目前的发现。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

确认

这项研究支持由FIPE / HCPA(医院丹尼·德·阿雷格里港机构研究基金会)和国家技术委员会和科学发展(CNPq,没有。483364/2007-0)。作者表达了感谢《美国专家校对。

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