文摘

这项研究的目的是确定循环C19MC小分子核糖核酸的概要文件(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 518 b, mir - 520 a *, mir - 520 h, mir - 525,和mir - 526 a)建立了子痫前期患者()、胎儿生长受限()和妊娠高血压()。我们检查了血浆的浓度之间的相关性和表达水平的小分子核糖核酸和疾病的严重程度与临床体征,要求交付,和多普勒超声参数。使用绝对和相对定量方法,增加细胞外C19MC微rna水平(mir - 516 - 5 - p,,;mir - 517 *,,;mir - 520 a *,,;mir - 525,,;mir - 526,,在子痫前期患者中发现。协会分析指出没有C19MC microRNA原生质的浓度和表达谱之间的关系,确定风险因素对于一个贫穷的围产期结果。然而,之间的依赖程度的原生质的C19MC小分子核糖核酸和使用大脑中动脉和cerebroplacental比的值。的研究带来了有趣的发现,upregulation mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 520 a *, mir - 525, mir - 526 -子痫前期建立的是一种特有的现象。

1。介绍

正常怀孕与系统性炎症反应有关。很多正常怀孕的生理变化是一种急性期反应的一部分,这是由炎症反应生成的。胎盘的近端原因是这些问题[1]。自胎盘不断改建在胎盘的正常发展,细胞外核酸胎儿和胎盘的起源,挤进trophoblast-derived凋亡的身体或脱落合胞体滋养层微粒,可以发现在产妇流通过程中正常妊娠(2- - - - - -6]。

循环合胞体滋养层碎片被假设为孕产妇炎症和孕产妇综合症的一些特征(7]。孕产妇炎症的迹象,这似乎是目前在正常怀孕在子痫前期的词被夸大了(PE)和胎儿生长受限(FGR),能够占他们的临床特征1,8]。

子痫前期和胎儿生长受限(FGR)是主要并发症影响约2 - 10%的妊娠孕产妇和围产期发病率和死亡率(负责9,10]。子痫前期一般妊娠20周后发展,特点是慢性或妊娠期高血压与蛋白尿相结合,结果从有缺陷的胎座式诱发子宫胎盘血液灌注不足和缺血8,11,12]。子痫前期的病因和FGR仍然未知。滋养层的碎片和微粒脱落在正常妊娠促炎,这个过程是放大在子痫前期(13]。缺氧环境诱发过度的滋养层细胞死亡和胎盘脱落增加碎片进入母体循环;因此,胎盘机能不全相关的妊娠并发症与异常的胎儿DNA和细胞外水平mRNA转录(5,14]。

最近的证据表明,子痫前期可以进一步细分为早期PE(妊娠34周之前),中间PE(34至37周的妊娠期)和晚期PE(怀孕37周后)15,16]。早期和晚期体育是现代的概念,和人们普遍认为这两个实体有不同的病因和应被视为不同形式的疾病,早期发作的PE和IUGR被认为是placenta-mediated疾病(17- - - - - -19]。

有趋势在过去十年发展的无创性方法利用量化小分子核糖核酸的核酸包容性游离孕产妇循环(6,20.- - - - - -39]。特定的分子生物标志物的诊断潜力及其实现在当前的预测和诊断算法怀孕相关的并发症是感兴趣的主题(6]。

小分子核糖核酸属于一个家庭的小非编码RNA调节基因表达的转录后的降解或阻塞翻译水平的信使核糖核酸(mRNA)目标(40,41]。

最近的研究表明,子痫前期与改变细胞外微rna表达。使用实时PCR分析,Gunel et al。42]证明了mir - 210的upregulation mir - 152的差别,对这些患者子痫前期。下一代测序技术的应用程序显示一个更广泛的流传特异表达的小分子核糖核酸在子痫前期。控制相比,15小分子核糖核酸被发现是调节(mir - 521, mir - 520 h, mir - 517 c, mir - 519 d, mir - 520 g, mir - 517 b, mir - 542 - 3 - p, mir - 136, let-7f-1 *, mir - 518 e, let-7a *, mir - 125 b, mir - 125 a-5p, mir - 519 a,和miR-29a)和7小分子核糖核酸是表达下调(let-7f, mir - 223, mir - 1260, let-7d, mir - 320 c, mir - 185,和mir - 1272)在四个检查preeclamptic血清样本(43]。

之后,使用微阵列分析吴et al。44]报道的upregulation 13小分子核糖核酸(mir - 574 - 5 - p miR-26a mir - 151 - 3 - p, mir - 130 a, mir - 181 a, mir - 130 b, miR-30d, mir - 145, mir - 103, mir - 425, mir - 221, mir - 342 - 3 - p,和miR-24)和下调2小分子核糖核酸(mir - 144, miR-16)在重度子痫前期患者。其中七13小分子核糖核酸(mir - 574 - 5 - p miR-26a mir - 130 b, mir - 181 a, mir - 342 - 3 - p, mir - 103,和miR-24)验证了实时PCR分析从严重升高血浆preeclamptic怀孕。

在一个小规模的分析中,Mouillet et al。45)没有观察到任何区分正常的怀孕,胎儿生长受限胎儿循环相比微rna表达水平(miR-27a miR-30d, mir - 141, mir - 200 c, mir - 205, mir - 424, mir - 451, mir - 491, mir - 517 a, mir - 518 b, mir - 518 e和mir - 524)。

然而,大多数的调查人员关注这些小分子核糖核酸的研究,基因位于染色体外的19个microrna的集群(C19MC和集群mir - 371 - 3)或染色体14 microrna的集群(C14MC)编码乳小分子核糖核酸(46- - - - - -50]。

我们以前确定C19MC小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 518 b, mir - 520 a *, mir - 520 h, mir - 525,和mir - 526 a)出现在妊娠产妇血浆区分正常怀孕和个人(51]。我们选择从染色体19 microRNA集群,其中包括46个microRNA基因,(48- - - - - -50,52]优先那些以前的小分子核糖核酸证明只表示在胎盘组织(mir - 520 a *, mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 518 b, mir - 519 a, mir - 524 - 5 - p, mir - 525, mir - 526 a, mir - 526 b和mir - 520 h)与小分子核糖核酸,据报道,胎盘组织中高度表达(mir - 512 - 5 - p, mir - 515 - 5 - p, mir - 518 f *, mir - 519 d,和mir - 519 e *) (51,53,54]。

之后,我们证明显著增加细胞外C19MC小分子核糖核酸水平(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 518 b, mir - 520 a *, mir - 520 h, mir - 525,和mir - 526 a)随着时间的推移,在通常进展怀孕(51,54]。

我们的初步研究结果表明没有区分正常和复杂的怀孕,但不能得出明确的结论由于涉及的研究对象数量少51,54]。目前的研究是一个跟踪我们的先前的研究[51,54)首次综合描述和表达谱的循环C19MC小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 518 b, mir - 520 a *, mir - 520 h, mir - 525,和mir - 526 - a)的全新的样本集临床建立子痫前期患者和/或胎儿生长受限。据我们所知,没有研究的概要描述循环C19MC microrna在妊娠期高血压进行了。

2。材料和方法

2.1。病人

63年白人女性涉及研究队列由子痫前期(PE) w或w / o胎儿生长受限(FGR), 27个FGR 23妊娠高血压(GH), 55岁的控制。24女性轻度子痫前期的迹象,39岁的女性被诊断出患有重度子痫前期,24 preeclamptic病人需要交付前34周的妊娠和39名患者怀孕34周后交付。前高血压18例,子痫前期叠加;否则,它发生在血压正常的患者(45例)。八growth-retarded胎儿妊娠34周之前交付和19那些怀孕34周后。羊水过少或anhydramnios出席7增长限制胎儿。

多普勒研究显示异常使用指数(PI)脐动脉(14子痫前期±FGR和14 FGR)和/或在大脑中动脉(10子痫前期±FGR和11 FGR)。Cerebroplacental比(CPR),表示为一个比脐动脉和大脑中动脉之间使用指数低于第五百分位21例(9子痫前期±FGR和12 FGR)。在脐动脉缺失或逆转enddiastolic速度波形发生在8例(2子痫前期+ FGR和6 FGR)。

正常怀孕被定义为那些没有并发症足月,单例,健康婴儿权重>怀孕37周完成后2500克。子痫前期>定义为血压140/90毫米汞柱在两决定4小时与蛋白尿> 300毫克/妊娠20周后24小时。被诊断为重度子痫前期的存在一个或多个结果根据妇产科委员会的指导方针11]。

被诊断为胎儿生长受限估计胎儿体重(EFW)时,使用Hadlock公式计算(Astraia软件GmbH),低于第十百分位评估胎龄。

妊娠期高血压被定义为高血压,妊娠20周后开发的。

所有的病人提供书面知情同意。研究伦理委员会批准的第三个医学院,在布拉格查尔斯大学。研究样本选择的基础上平等在存储和妊娠年龄。胎龄评估使用超声。

2.2。样品的处理

9毫升收集外周血EDTA管和离心两次在1200 g在室温下10分钟。血浆样本存储在−80°C到后续处理。

总RNA提取1毫升的等离子体和25毫克的正常胎盘组织保存在RNAlater(美国奥斯汀Ambion)其次是小RNA的浓缩过程使用mirVana microRNA隔离设备(美国奥斯汀Ambion)。试剂盒LS试剂用于等离子体样品的总RNA提取生物体液(美国卡尔斯巴德英杰公司)和之前小RNA浓缩过程。DNA污染降到最低,我们筛选了RNA治疗5µL DNase我(Fermentas国际,加拿大)为30分钟37°C。

2.3。逆转录酶反应

每个microRNA reverse-transcribed成互补DNA使用TaqMan microRNA化验,包含microRNA-specific茎环结构RT引物(表1),TaqMan微rna逆转录工具包(美国应用生物系统公司,Branchburg)反应总量的50µL 7500实时PCR系统(美国Branchburg应用生物系统公司)与下面的热循环参数:30分钟16°C, 30分钟42°C, 5分钟在85°C,然后在4°C。

2.4。量化的小分子核糖核酸

15µL cDNA相应microRNA与TaqMan microRNA分析组件和混合成分的TaqMan普遍PCR反应混合液(美国应用生物系统公司,Branchburg) 35µL反应总额。TaqMan PCR条件设置为TaqMan指南中描述。分析了使用7500实时PCR系统。所有pcr进行重复。样品被认为是积极的,如果放大信号发生前40阈值周期。个人小分子核糖核酸的浓度总RNA的表达为pg丰富的小分子RNA每毫升血浆。

特定的microRNA在母亲的血浆的表达决心使用比较Ct方法(55]相对于微rna表达相同的参考样品,随机选择来自与正常妊娠胎盘。

小RNA RNA分数高纯度分离胎儿胎盘的一部分(胎盘的一部分来源于包含胚胎绒毛膜囊,由绒毛膜板和绒毛)被用来建立标准曲线和作为参考样本相对量化的研究。

微RNA合成秀丽隐杆线虫(cel-miR-39、试剂盒、希尔登,德国)作为内部控制的变化在准备RNA,互补脱氧核糖核酸的合成,实时PCR。由于缺乏公认的标准,所有实验实时中存在数据规范化cel-miR-39,因为它并没有显示出任何人类微rna序列同源性。1µl 0.1 nM cel-miR-39飙升在孵化后试剂盒LS试剂人血浆样品。

2.5。统计分析

微rna水平组之间的比较(Mann-Whitney非参数测试U测试两组之间的比较和对比的克鲁斯卡尔-沃利斯检验三个或更多组)使用Statistica软件(美国StatSoft Inc .)。变量之间的相关性包括绝对或相对microRNA量化和多普勒超声参数(脐动脉的使用,使用在大脑中动脉,和cerebroplacental比率)计算使用的斯皮尔曼等级相关系数()。如果不同−0.5 0,有弱负相关。显著性水平是建立在一个的价值。

3所示。结果

3.1。循环C19MC microrna区分复杂和正常怀孕

总的来说,增加血浆的mir - 516 - 5 - p(水平),mir - 517 * (),mir - 520 a *。(),mir - 525 ()和mir - 526 a ()观察女性妊娠相关并发症(妊娠期高血压、子痫前期和胎儿生长受限)相比,正常怀孕。

同样,基因表达的差异之间的循环小分子核糖核酸与怀孕相关的并发症和控制队列(正常怀孕)达到统计学意义mir - 516 - 5 - p (),mir - 517 * (),mir - 520 a * (),mir - 525 ()和mir - 526 a ()。

3.2。Upregulation循环C19MC小分子核糖核酸在妊娠子痫前期建立的

连续详细的组分析证实了不同水平的细胞外小分子核糖核酸在5/5 C19MC小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p,;mir - 517 *,;mir - 520 a *,;mir - 525,;和mir - 526,)。

而血浆的小分子核糖核酸水平控制群与群之间FGR患者和GH没有差别,增加水平检测组建立了子痫前期患者(mir - 516 - 5 - p,;mir - 517 *,;mir - 520 a *,;mir - 525,;和mir - 526,)(数据1(一)- - - - - -1 (e))。

平行,microRNA基因表达显著差异是子痫前期组之间发现,妊娠期高血压、胎儿生长受限、控制(mir - 516 - 5 - p,;mir - 517 *,;mir - 520 a *,;mir - 525,;mir - 526,)。再次,microrna的表达之间的控制队列、妊娠高血压、胎儿生长受限并没有不同,最高的表达检测组患者子痫前期(mir - 516 - 5 - p,;mir - 517 *,;mir - 520 a *,;mir - 525,;mir - 526,)(数据1 (f)- - - - - -1 (j))。

3.3。协会研究循环C19MC小分子核糖核酸和疾病的严重程度对临床体征和交付要求

原生质的浓度和/或C19MC小分子核糖核酸的表达谱进行分析与疾病的严重程度与临床症状的程度(轻度和重度子痫前期)和要求交付(妊娠34周之前和之后)。没有疾病的严重程度的影响在原生质的C19MC微rna浓度(mir - 516 - 5 - p,;mir - 517 *,;mir - 520 a *,;mir - 525,;和mir - 526,)或C19MC microRNA表达水平(mir - 516 - 5 - p,;mir - 517 *,;mir - 520 a *,;mir - 525,;mir - 526,)被观察到。

此外,C19MC microRNA原生质的水平之间的关系和/或基因表达和先前的高血压的发生子痫前期患者群的决心。没有区别的子痫前期叠加在慢性高血压和/或妊娠期高血压和意想不到的发生子痫前期患者组的显示(绝对量化:mir - 516 - 5 - p,;mir - 517 *,;mir - 520 a *,;mir - 525,;mir - 526,;相对量化:mir - 516 - 5 - p,;mir - 517 *,;mir - 520 a *,;mir - 525,;mir - 526,)。

3.4。协会研究循环C19MC小分子核糖核酸和疾病的严重程度对多普勒超声监测

血浆的浓度之间的关系和基因表达水平的C19MC小分子核糖核酸和多普勒超声参数(使用在脐动脉大脑中动脉的使用,和cerebroplacental比率)是研究群有子痫前期的怀孕复杂和/或胎儿生长受限。

没有区别的组内复杂怀孕正常和异常值的流量在脐动脉发现除了mir - 526 a,这是调节患者的血流速度异常波形(绝对量化:;相对量化:)。

此外,统计分析显示没有影响使用的大脑中动脉和cerebroplacental比血浆的浓度(a .大脑媒体:,,,,;心肺复苏:,,,,)和表达水平(a .大脑媒体:,,,,;心肺复苏:,,,,)的小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 520 a *, mir - 525,和mir - 526 a)被识别为调节血浆样本来自子痫前期有或没有胎儿生长受限。

变量之间的相关性包括绝对或相对量化的microRNA在母亲的血浆和流量的值在脐动脉和胎儿血管使用斯皮尔曼等级相关系数的计算。脐动脉的使用没有任何关系,microRNA原生质的浓度和/或微rna基因表达。然而,使用之间的弱负相关在大脑中动脉和微rna原生质的浓度(mir - 516 - 5 - p:,;mir - 517 *:,;mir - 520 - a *:,;mir - 525:,;mir - 526 a:,)或微rna基因表达(mir - 516 - 5 - p:,;mir - 517 *:,;mir - 520 - a *:,;mir - 525:,;mir - 526 a:,)被观察到。此外,弱cerebroplacental比率和microRNA原生质的浓度之间的负相关(mir - 520 - a *:,;mir - 526 a:,;图2(一个))或微rna基因表达(mir - 520 - a *:,;mir - 526 a:,;图2 (b))被发现(表1)。

3.5。函数和功能关系分析目标基因的差异表达细胞外C19MC microrna在子痫前期

预测目标的功能和功能关系分析的五个提升细胞外C19MC microrna建立子痫前期患者表示,一大群基因与免疫系统和炎症反应的调控(表2)。收集到的数据从数据库miRDB (http://mirdb.org/miRDB/)。所有的目标都是预测的生物信息学工具MirTarget2,由分析成千上万的基因影响microrna SVM学习机器。

4所示。讨论

我们之前的初步研究结果强烈支持需要更详细的勘探出细胞外微产妇流通与视图向其识别潜在生物标记胎盘机能不全相关并发症(51,54]。

起初,一些细胞外胎盘特定小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p, mir - 520 *, mir - 518 b和mir - 526 a)趋势只是为了一个更高的水平在小群胎盘机能不全患者相关并发症(16子痫前期,5子痫前期与IUGR 11 IUGR),然而,相比不具备统计学意义gestational-age-matched控制。虽然我们曾表明,正常的怀孕和placental-insufficiency-related并发症的表现并不影响miR-16的水平和let-7d孕产妇等离子体(51,54),现在毫无疑问的是,无所不在地表示miR-16和let-7d不应该进一步利用各种细胞外的规范化表达谱小分子核糖核酸是我们做过的试验研究。我们的最新研究表明,miR-16的表达水平显著降低子痫前期患者胎盘组织来源于(数据提交出版)。同样,Maccani et al。56)也报道,miR-16在胎盘组织中表达降低可能与低出生体重相关术语婴儿小胎龄。相比之下,miR-16以前观察到的是过表达与重度子痫前期胎盘组织的影响,分别是(38]。吴等人的最新研究。44)带来的证据循环mir-16下调子痫前期患者严重。此外,杨et al。43]显示减少的表达传播let-7d preeclamptic患者应用新一代测序技术等更为复杂的方法。

因此,替代内生控制候选人应该使用正常细胞外微rna的基因表达数据。

在最近的研究中,妊娠相关并发症的群体扩大到实现足够的研究。这一次,循环正常化microRNA表达了对合成秀丽隐杆线虫微rna (cel-miR-39)。使用绝对和相对定量方法,细胞外的能力C19MC小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 520 a *, mir - 525,和mir - 526 a)区分正常和复杂妊娠子痫前期的发病期间w或w / o胎儿生长受限了。

不幸的是,有限的数据比较细胞外C19MC微rna水平组之间的正常的和复杂的怀孕是可用的。我们的数据与杨不一致等。43),观察到细胞外的upregulation mir - 520 h在四子痫前期患者。

我们的发现可能支持Mouillet et al。45),最近也观察到相对胎盘特定微rna水平无显著差异(mir - 518 b)血浆样本中那些通常进展和胎儿生长受限怀孕。

我们的研究结果的基础上,我们进一步研究了循环C19MC小分子核糖核酸与疾病的严重程度和临床症状的程度,要求交付(妊娠34周之前和之后),和多普勒超声检查。

协会分析指出没有C19MC microRNA原生质的浓度之间的关系和/或基因表达和识别风险因素对于一个贫穷的围产期结果。microRNA原生质的水平没有区别和/或怀孕之间的基因表达有轻度和重度子痫前期,与怀孕相关的并发症,需要交付34周妊娠之前,和那些交付这个关键时期,怀孕后异常和正常的血液流动速度波形。然而,mir - 526 a的水平显著增加的患者脐动脉流量的异常值。

另一方面,之间的依赖程度的原生质的C19MC小分子核糖核酸和使用大脑中动脉和cerebroplacental比的值。之间的关系水平的提高血浆的C19MC小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 520 a *, mir - 525,和mir - 526 a)和减少流量的值在大脑中动脉达到统计学意义复杂的怀孕。

同样,之间的关系水平的提高血浆的C19MC小分子核糖核酸(mir - 520 - a *和mir - 526 - a)和减少cerebroplacental比率的值了。

总之,小分子核糖核酸发挥根本性作用在多种生理和病理过程中涉及妊娠相关并发症。本研究首次证明循环C19MC小分子核糖核酸可能在子痫前期的发病机制中发挥作用,但不是在妊娠期高血压的发病机制和胎儿生长受限。研究带来了有趣的发现,循环的upregulation C19MC小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 520 a *, mir - 525,和mir - 526 a)是子痫前期建立的特征现象。

5。结论

研究带来了有趣的发现,循环的upregulation C19MC小分子核糖核酸(mir - 516 - 5 - p, mir - 517 *, mir - 520 a *, mir - 525,和mir - 526 a)是子痫前期建立的特征现象。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

确认

支持的工作是专门拨款机构捷克(没有。304/12/1352)和部分支持的查尔斯大学研究项目PRVOUK第9。