文摘

肺气肿是一种t细胞介导的自身免疫性疾病主要是由于吸烟引起的。Th17细胞及相关细胞因子可能导致这种疾病。然而,可能意味着Th17细胞在调节炎症反应在肺气肿还有待阐明。在当前的研究中,我们测试了IL-17的蛋白质含量和IL-21在外周血和肺组织免受香烟(CS)暴露小鼠和air-exposed老鼠,CD4的频率分析⁺IL-17⁺Th17细胞,IL-21⁺Th17细胞、CD8⁺IL-21R⁺T细胞在外周血和小鼠的肺组织,和桶状病变的关系,细胞毒性CD8 IL-21的影响进行了探讨⁺T细胞功能体外。结果发现,Th17的频率,IL-21⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺T细胞和IL-17的水平和IL-21 CS-exposed老鼠远远高于那些air-exposed老鼠和与肺气肿的病变。此外,IL-21的数量⁺Th17细胞与CD8的数量成正比⁺IL-21R⁺T细胞。的在体外实验表明,IL-21显著增强穿孔素的分泌和CD8 granzyme B⁺从CS-exposed小鼠T细胞。这些数据间接提供证据表明,Th17细胞可能参与当地的控制和系统炎症反应在调节CD8肺气肿⁺细胞毒性t细胞功能。

1。介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球残疾和死亡的主要原因1- - - - - -3]。它主要是由吸烟引起,表现为不可逆的气流限制。慢性阻塞性肺病的肺气肿是一个重要的组成部分。虽然慢性阻塞性肺病是越来越普遍,分子和细胞机制,负责慢性阻塞性肺病的发展是不清楚。早期研究表明,慢性阻塞性肺病的CD4的积累⁺和CD8⁺T细胞在气道和肺实质,CD8⁺心态占据主导地位的T细胞(4]。最近的研究表明,慢性阻塞性肺病是一种自身免疫性疾病,其特征是一个协会antielastin抗体和Th1反应(5,6]。Th1细胞主要贡献,但不仅限于,COPD的发病机制。

IL-17(也称为IL-17A)在1993年首次克隆和鉴定细胞毒性T lymphocyte-associated抗原(CTLA) 87]。IL-17F后来发现并与IL-17A密切相关。他们都是表达CD4激活⁺记忆T细胞(8]。越来越多的证据表明,IL-17参与炎性疾病的肺部9,10]。IL-17可能COPD的发病机制中发挥重要作用,因为它能诱导中性气道炎症刺激中性粒细胞趋化性和粘蛋白基因表达在支气管上皮细胞(11,12]。IL-17的超表达转基因小鼠的肺可能引起肺部炎症与COPD-like表型(13]。Th17细胞CD4的新描述的子集⁺T细胞和发展有重要作用的几个T细胞的自身免疫性疾病,如风湿性关节炎、多发性硬化症,以前认为是完全由Th1细胞(14,15]。最近,Th17细胞被发现在慢性阻塞性肺病和肺气肿16,17]。然而,Th17细胞调节炎症反应在肺气肿的作用仍有待证明。

IL-21的多效性的细胞因子γ链家,从事共同的细胞因子受体γ链表达的淋巴细胞和骨髓血统。这CD4细胞因子最初认为是受限制的⁺T细胞(Th1、Th2细胞)和NKT细胞,但它现在清楚的是,IL-21也是由Th17细胞(18,19]。IL-21可以招募Th17细胞到组织发炎,也提供细胞内信号通过IL-21R和影响t细胞激活和分化20.]。最近,曾庆红et al。21)表明,在体外接触IL-21 CD8的生成⁺T细胞数量增加和增强功能。这些数据表明,Th17细胞可能在调节CD8发挥作用⁺通过IL-21 / IL-21R细胞毒性t细胞功能。

在目前的研究中,我们假设Th17细胞和IL-21参与当地使用的小鼠模型和系统炎症反应引起的肺气肿吸烟。我们测试了IL-17和IL-21蛋白质含量在外周血和吸烟的肺组织——(CS)暴露小鼠和air-exposed老鼠,,IL-21 Th17的表达分析⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺T细胞在外周血和小鼠的肺组织,及其与气肿病变的关系。最后,我们评估了可能的重组IL-21调制效应对CD8 (rIL-21)⁺T细胞在体外。

2。材料和方法

2.1。动物和香烟烟雾暴露协议

具体无菌近亲交配的雄性BALB / c小鼠体重(8周的年龄,20 - 25克)是购买从广西医科大学实验动物中心(中国南宁)。综述了所有动物程序和实验动物伦理委员会批准广西医科大学。所有老鼠关在笼子消毒和维护在12:12 h光暗周期和接收消毒食物和水随意。

老鼠(CS)暴露全身,像前面描述的那样22]。简而言之,组10只老鼠(CS-exposed老鼠)暴露在香烟五(南宁环过滤香烟:12毫克焦油和0.9毫克的尼古丁),一天4次30分钟无烟间隔在一个封闭的0.75米³房间里,一周5天24周。香烟烟雾暴露小鼠容忍没有毒性的证据(碳氧血红蛋白水平~ 10%和没有减肥)。最优的烟:空气的比例1:6。对照组(air-exposed老鼠)暴露在24周的空气。CS-exposed小鼠的血清碳氧血红蛋白是8.4±1.2%和1.0±0.3% air-exposed老鼠(),这是类似于人类的吸烟者(碳氧血红蛋白血药浓度23]。

2.2。组织处理

24小时后过去接触空气或烟,与戊巴比妥钠麻醉老鼠牺牲。收集血液样本通过retroorbital出血和被分成2部分。大约有200μL外周血流仪分析得到,和大约1500μL的外周血分离血清酶联免疫吸附试验(ELISA)分析。左肺被用于组织学。对肺的一部分(30到50毫克)对ELISA是均质,和剩余部分用于单细胞悬浮液的制备。脾脏是收获无菌和切碎的文化。

2.3。形态测量学

左肺膨胀灌输10%福尔马林的恒压25厘米H₂O(10分钟),然后结扎和删除。肺膨胀固定前24小时在石蜡包埋。石蜡包埋后,5μ部分被削减和苏木精和伊红染色进行组织学分析。对于每一个动物,10场放大100 x随机被捕的4个不同区域的左肺。我们决定扩大量化的肺泡空间均值线性拦截(Lm)和肺泡壁的破坏通过测量破坏性指数(DI)在CS - air-exposed老鼠,像前面描述的那样24,25]。两个独立调查人员测量Lm和失明的方式。

2.4。肺单细胞悬架的基本准备

肺单细胞悬浮体是由对肺的一部分,正如前面详细(26]。简而言之,肺是彻底碎,消化,通过70年μm细胞过滤器,清洗和离心机冷两倍在1200 rpm PBS 10分钟在4°C,并在PBS resuspended。单核细胞被孤立于肺单细胞悬浮Ficoll-Hypaque梯度离心(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典),清洗和离心机冷两倍在1200 rpm PBS 10分钟在4°C,并保持在冰上,直到标签。

2.5。淋巴细胞的准备

红细胞和红细胞裂解细胞溶解缓冲区(Sigma-Aldrich) 10分钟在室温和剩下的细胞被洗两次冷PBS和离心机在1200转10分钟。新鲜的外周血单核细胞(PBMCs)被用于细胞内细胞因子染色在1 h。

装腔作势的脾脏后,细胞悬浮液迅速用移液器吸取了无菌巴斯德吸管3毫升的RPMI 1640(美国Gibco),尼龙网过滤消除碎片,在1000转离心5分钟。脾脏resuspended在PBS的细胞球,和淋巴细胞分数被Ficoll-Plaque孤立(Solarbio科技、中国)梯度离心法。淋巴细胞维持乘24-well细胞培养板RPMI 1640补充10%胎牛血清(美国Gibco) 37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂。

2.6。免疫荧光标记和流式细胞术

表达标记T细胞流式细胞术测定表面染色或细胞内染色后使用藻红蛋白cyanine-5-conjugated anti-mouse CD4 (PE-Cy5-CD4),荧光素isothiocyanate-conjugated anti-mouse CD8 (FITC-CD8) phycoerythrin-conjugated anti-mouse IL-17 (PE-IL-17) phycoerythrin-conjugated anti-mouse IL-21R (PE-IL-21R)和Alexa萤石647 -共轭anti-mouse IL-21 (Alexa萤石647 - il - 21)。这些老鼠Abs买来BD生物科学或eBioscience (CA)圣地亚哥。简而言之,PBMCs十四烷酸刺激与佛波醇酯(PMA, 25 ng / mL, Sigma-Aldrich,美国)和ionomycin (10μ美国Sigma-Aldrich g / mL)的存在GolgiStop (BD生物科学)5 h。这些细胞被洗,然后固定/ permeabilized eBioscience固定/透化作用和透化作用缓冲区根据制造商的协议(27),用荧光抗体染色CD4, CD8, IL-21R IL-17, IL-21。流式细胞术进行了BD FACSCalibur flowcytometer和分析采用FCS ExpressV4软件。

2.7。脾脏CD8⁺T细胞培养和rIL-21刺激

大部分CD8⁺从脾脏T细胞积极选择使用顺配共轭微anti-mouse CD8 (Ly-2)单克隆抗体根据制造商的指示(mac, Miltenyi研究)。CD8的纯度⁺T细胞从而获得大约是95%。

纯化CD8⁺T细胞培养细胞/毫升RPMI 1640中含有10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,链霉素100克/毫升、2毫米谷酰胺,50米巯基乙醇(RPMI 1640完全培养基2毫升)在96 -孔板(200μL) 37°C, 5%的公司₂,100%的湿度与植物凝集素(PHA 10 ng / mL)和治疗有或没有50 ng / mL的mrIL-21 3天。50 ng / mL的细胞因子浓度选择基于初始剂量反应实验10到100 ng / mL浓度和出版文学达到最大影响CD8 t细胞细胞毒性(21,28]。这些细胞被洗一次,重振PMA / ionomycin存在GolgiStop (BD生物科学)5 h,然后固定/ permeabilized eBioscience固定/透化作用根据制造商的协议和沾抗体对细胞内特定穿孔素(PE-perforin)和granzyme B (APC-granzyme B)。

2.8。细胞因子测定

IL-17的浓度和IL-21外周血和肺,以及穿孔素和granzyme B在文化上清液,测定由ELISA包根据制造商的协议(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。都在重复样本化验。

2.9。统计分析

所有数据被描述为均值±SD。Independent-samples以及和皮尔逊相关性用于统计分析。统计分析是由使用SPSS统计软件版本16 (SPSS Inc .,芝加哥,IL)值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。组织学和肺的形态学研究

肺气肿是一种结构性障碍,其特征是破坏肺泡壁和肺泡的扩张空间。组织学检查肺部air-exposed老鼠的部分显示正常的肺泡结构和表现出正常大小与薄隔(图空域1(一))。相比之下,CS-exposed小鼠的肺部分显示增加空气空间扩张和破坏。一些空域看起来不规则的大小,和隔膜薄(图1 (b))。DI是高CS-exposed老鼠(45.16±3.13)相比air-exposed动物(28.86±2.07,;图1 (c));暴露于香烟烟雾中显著诱导领空扩大。Lm也是高CS-exposed老鼠(46.87±7.16μ米)而air-exposed动物(32.60±3.21μ米,;图1 (d))。

3.2。IL-17 IL-21蛋白质水平显著升高CS-Exposed老鼠

在目前的研究中,我们使用ELISA指出肺IL-17水平和IL-21 CS-exposed老鼠air-exposed老鼠相比显著增加(,数据2(一个)和2 (b))。同样,我们也指出,IL-17的水平和IL-21 CS-exposed小鼠外周血的显著高于air-exposed老鼠(,数据2 (c)和2 (d))。

进一步证实了我们的结论,我们研究之间的关系的水平IL-17 IL-21和肺气肿的病变以DI和Lm CS-exposed老鼠。肺IL-17和IL-21水平呈正相关,与迪(,和,,分别地。,图s3(一个)和3 (b)与Lm)和(,和,,分别地。,图s3 (c)和3 (d))。同样,外周血IL-17和IL-21与DI呈正相关(,和,,分别地。,图s3 (e)和3 (f)与Lm)和(,和,,分别地。,图s3 (g)和3 (h))。

3.3。IL-21 Th17的频率⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺在CS-Exposed小鼠T细胞增加

我们分析了Th17的频率,IL-21⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺外周血中T细胞用流式细胞仪和肺部。Th17和IL-21的频率⁺Th17细胞在外周血CS-exposed air-exposed同窝出生的老鼠相比显著增加(,数据4(一)和4 (b))。还慢性CS-exposure 6个月后,CD8的显著增加⁺IL-21R⁺观察T细胞在外周血从CS-exposed air-exposed同窝出生的老鼠比(,图4 (c))。此外,Th17的频率,IL-21⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺T细胞在肺部的CS-exposed老鼠明显高于那些控件(,数据5(一个),5 (b),5 (c))。

3.4。联系的频率Th17 IL-21⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺T细胞和气性病变CS-Exposed老鼠

的频率外周血Th17 IL-21⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺T细胞与DI呈正相关(,;,和,职责。)(数据6(一),6 (c),6 (e)与Lm)和(,;,和,职责。)(数据6 (b),6 (d),6 (f))CS-exposed老鼠。此外,IL-21⁺积极与CD8 Th17细胞相关⁺IL-21R⁺T细胞(,)(图6 (g))。

肺的频率Th17 IL-21⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺T细胞明显与DI呈正相关(,;,和,职责。)(数据7(一),7 (c),7 (e)与Lm)和(,;,和,职责。)(数据7 (b),7 (d),7 (f))CS-exposed老鼠。此外,IL-21⁺积极与CD8 Th17细胞相关⁺IL-21R⁺T细胞(,)(图7 (g))。我们的研究结果表明,Th17细胞可以调节CD8⁺T细胞通过IL-21 / IL-21R系统。

3.5。在CD8 IL-21上调表达穿孔素和Granzyme B⁺T细胞

评估的贡献IL-21 CD8的功能⁺下培养的CD8 T细胞在CS-exposed老鼠,我们⁺T细胞在体外与rIL-21分析细胞因子的生产。我们孤立CD8⁺T细胞通过mac从air-exposed CS-exposed老鼠和老鼠。的纯化CD8⁺T细胞培养在PHA的存在(10 ng / mL)和rIL-21 (50 ng / mL)或PHA (10 ng / mL)仅为3天。结果表明,rIL-21和PHA显著调节的表达穿孔素和CD8 granzyme B⁺T细胞;这种效应在air-exposed CS-exposed老鼠比老鼠(图8(一个))。值得注意的是,有更多的穿孔素+细胞(88.29±11.03%)比granzyme B +细胞(69.47±5.31%,在CD8)⁺CS-exposed小鼠的T细胞(图8(一个))。同时,穿孔素的蛋白质含量和B在文化granzyme上层清液显著增加后3天的文化IL-21和PHA;这种效应也大CS-exposed老鼠比air-exposed老鼠(图8 (b))。穿孔素的蛋白质含量的文化上层清液CS-exposed老鼠(24.47±2.61 ng / L)显著增加超过granzyme B的水平(1.92±0.21 ng / L,)(图8 (b))。这些数据表明,IL-21R⁺CD8⁺T细胞能够分泌穿孔素和granzymes进一步支持的潜在相关性Th17细胞肺气肿。

4所示。讨论

肺气肿是一种T-cell-mediated自身免疫性疾病,但其病因和病理尚未阐明。在这项研究中,我们使用一个小鼠模型的香烟烟雾诱发肺肺气肿调查Th17细胞的能力参与肺气肿发病机制。我们发现的数量Th17 IL-21⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺T细胞和水平的IL-17 IL-21 CS-exposed小鼠外周血和肺的更高比air-exposed老鼠和与肺气肿的病变。此外,IL-21的数量⁺Th17细胞与CD8的数量成正比⁺IL-21R⁺T细胞。此外,IL-21显著增强穿孔素的分泌和CD8 granzyme B⁺从CS-exposed小鼠T细胞在体外。这些数据间接证明IL-21 CD8 Th17细胞可以产生的⁺促进细胞毒性T细胞功能。

CD4⁺免疫调节T细胞被称为重要的关键细胞,而CD8⁺在慢性阻塞性肺病(T细胞有细胞毒性作用29日]。经典,天真的CD4⁺T细胞是分化成两个主要的血统,Th1、Th2细胞的基础上他们的细胞因子分泌和免疫调节功能30.]。调节性T细胞CD4仅占一小部分⁺T细胞的末梢循环和负责免疫反应的平衡,这对健康是必不可少的(31日]。Th17细胞变化的古典Th1 / Th2范式Th细胞分化[32]。早期的研究表明,渗透CD4⁺T细胞在慢性阻塞性肺病展览Th1表型(29日]。我们之前的研究表明,减少发现调节性T细胞在肺肺气肿集团(33]。最近,我们报道,增加Th17细胞在肺smoke-exposed小鼠,能找到这些Th17细胞可能是因为Th17分化刺激肺促炎细胞因子和招募Th17细胞通过CCR6 / CCL20 [34]。在当前的研究中,我们也证明了增加Th17细胞在外周血和肺的CS-exposed老鼠。更重要的是,Th17细胞频率的增加与气肿病变呈正相关。这些研究结果是一致的在活的有机体内山等数据。17),表明Th17细胞存在于肺肺气肿患者,和哈里森et al。35)还发现,Th17细胞呈现在BALF smoke-exposed老鼠。因此,这些研究表明,Th17细胞在当地中相关角色和系统炎症慢性阻塞性肺病的过程。

Th17细胞分泌不仅IL-17A IL-17F, IL-21,以及这些细胞因子il - 22生成时,最有可能引起组织炎症(36]。最近的研究已经表明,IL-17A IL-17F可以刺激中性粒细胞和巨噬细胞的趋化因子的生产,促进招聘肺(37,38]。但这额外的角色和其他Th17-derived细胞因子在慢性阻塞性肺病在很大程度上仍未知。IL-21可能采取积极的反馈循环,保护和/或放大代Th17细胞(39,40),招募Th17细胞发炎组织(41]。此外,莱纳德和Spolski [42]表明IL-21可以显著提高淋巴细胞存活率和细胞溶解的潜力。鉴于这些发现,这或许并不令人意外,夸大IL-17和IL-21响应与COPD的发病机制。在目前的研究中,发现IL-17和IL-21含量严重超标CS-exposed小鼠的外周血和肺。此外,IL-17水平之间的正相关和IL-21气肿病变在CS-exposed老鼠被发现。

虽然这些研究结果表明,增强Th17细胞和肺气肿IL-21生产生物相关,Th17细胞在肺气肿发病机制仍然不明。多项研究表明,CD8的数量⁺T细胞的肺部发现COPD患者与疾病严重程度(43),和肺CD8⁺可能直接导致细胞毒性T细胞导致肺气肿通过诱导细胞凋亡穿孔素的分泌,granzyme, Fas / Fas配体(FasL)相互作用[44]。此外,它已经表明,CD4细胞⁺在促进功能性CD8 T细胞是必不可少的⁺急性感染后t细胞记忆(45]。因此,很可能Th17细胞可能参与COPD通过代CD8免疫调节⁺细胞毒性T细胞。

IL-21是一种效应细胞因子,主要由Th17细胞(36]。它介导的影响通过一个类我家族细胞因子受体IL-21R,特别结合IL-21 [20.]。在目前的研究中,我们表明,IL-21的数量⁺Th17和CD8⁺IL-21R⁺T细胞在肺部显著增加,外周血CS-exposed的老鼠。更重要的是,IL-21数量之间显著正相关⁺Th17和CD8⁺IL-21R⁺T细胞和肺气肿的损伤被发现在CS-exposed老鼠,这表明IL-21的重要性⁺Th17和CD8⁺IL-21R⁺T细胞发展的肺气肿。此外,IL-21之间存在显著的相关性⁺Th17和CD8⁺IL-21R⁺肺和外周血T细胞的CS-exposed老鼠。这表明,Th17细胞可以产生IL-21通过IL-21R调节炎症反应,这是对CD8表示⁺T细胞。因此,我们推测IL-21释放Th17细胞的免疫病理反应可能会发挥更重要的作用通过其行为对CD8肺气肿⁺T细胞。

为了进一步解决这一问题,我们检查了rIL-21促进CD8的能力⁺T细胞功能在体外,发现coculture IL-21和CD8⁺T细胞导致细胞生产增加大量的穿孔素和granzyme-B慢性吸烟暴露。有趣的是,CD8⁺穿孔素⁺比CD8细胞比例高⁺granzyme B⁺细胞,穿孔素水平也远高于granzyme B的水平。穿孔素可以形成毛孔在目标细胞的细胞膜,而granzymes丝氨酸蛋白酶,进入靶细胞的细胞质,改变它们的功能和/或激活细胞死亡(46]。这些观察产生的间接证明IL-21 Th17细胞可以促进CD8⁺T细胞诱导凋亡和组织损伤通过granzyme-B / perforin-mediated通路。然而,Th17细胞的作用的确切机制连续烟雾诱发肺气肿无疑需要研究的发展。

5。总结

我们的数据表明,Th17的频率,IL-21⁺Th17, CD8⁺IL-21R⁺T细胞和水平的IL-17 IL-21 CS-exposed外周血和肺的老鼠相比显著增加控制和与肺气肿的病变。此外,表达穿孔素和CD8 granzyme B⁺T细胞是增加了在体外与IL-21刺激。我们的研究结果支持这一概念,Th17细胞及相关细胞因子IL-21参与了COPD的发病机制。然而,我们所知,虽然在体外实验IL-21促进CD8⁺T细胞的细胞毒性反应,是否IL-21源自Th17细胞有助于增强CD8⁺T细胞功能的反应尚不清楚。进一步的研究应该由使用Th17细胞过继转移和IL-21-null(或IL-21不足)老鼠。

作者的贡献

Min-Chao段设计进行研究,分析数据,写论文;小宁钟设计研究和综述论文;黄应参与建立小鼠肺气肿模型归纳,进行研究和分析数据;Hai-Juan唐参与建立小鼠肺气肿模型归纳并进行研究。所有作者阅读和批准了期末论文。Min-Chao段和黄应了同样的工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金资助81160010和2011 gxnsfa018178广西自然科学基金资助。初等数学谢谢娇局域网博士,医学研究中心,广西壮族自治区人民医院,她优秀的流仪援助。