文摘

高血压中风损伤的炎症生物标记和免疫细胞水平一直被认为是中风的结果。然而,最近的研究表明,炎症发生中风发作之前。在这项研究中,我们旨在阐明炎症的作用在中风发病病患者自发性高血压大鼠(SHRSP)。在4周的年龄(中风发作之前),血浆il - 1的水平β明显高于SHRSP (pg / ml)比纯种京都大鼠(WKY) (pg / ml,对SHRSP)或自发性高血压大鼠(月)(pg / ml,对SHRSP) (每应变)。刺激il - 1β信号也被观察到在SHRSP脑血管内皮细胞。基因的表达il - 1β,caspase-1 il - 1受体(MCP-1和ICAM-1)和下游基因,与免疫细胞相关招聘,在SHRSP明显大于WKY或萎缩,与更大的NF重合κB蛋白水平相比,SHRSP WKY或萎缩。此外,il - 1的持续管理β(2μ克/天)使用一个渗透泵略增加中风的发病率在月(),显著加快了中风的发病SHRSP ()相比,每个控制(每组)。这些结果表明,刺激了il - 1β信号可能是导致中风的发病时伴随有严重高血压。

1。介绍

炎症过程中发挥核心作用在血管疾病及其并发症的发病机制。在临床,血浆炎性细胞因子水平升高,c反应蛋白(CRP),和趋化因子与未来心血管风险相关联1]。此外,血清水平的细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)在缺血性中风和心肌梗死患者(高2,3),这可能被视为stroke-induced增加炎症活动。然而,等离子体水平的ICAM-1和MCP-1也提高原发性高血压患者在缺乏其他疾病(4]。因此,炎症是中风的一个危险因素高血压,但无论是是中风的原因尚不清楚5]。

治疗用药物,具有抗炎作用,可以预防中风在人类和动物模型。在健康的人没有高脂血症与高灵敏度CRP水平升高,但伐,降低高灵敏度c反应蛋白和胆固醇水平,中风和心肌梗塞的发病率降低了50%(相对于安慰剂6]。病患者自发性高血压大鼠(SHRSP),一个独特的遗传出血性中风模型(7),曾被用来检查炎症中风的贡献。SHRSP美联储高盐饮食,伐治疗显著延迟中风的发病和减毒的转录炎症生物标记(MCP-1转化生长因子-β1,白介素(IL) 1β和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α))(8]。此外,吡格列酮延迟中风的发病通过改善血管内皮功能障碍,抑制大脑炎症,减少氧化应激(9,低剂量的阿司匹林(阿司匹林)也推迟了中风的发病SHRSP通过抑制炎症反应(10]。经常服用阿司匹林也可能带来风险的保护作用在人类(出血性中风11]。除了这些抗炎药,我们此前报道称,饮食限制隐含的全身和局部炎症和显著延迟中风的发生和扩展寿命SHRSP [12]。我们还报道,血浆il - 1β水平高与il - 6和TNF -相比α限制饮食水平SHRSP,明显降低血浆il - 1β的水平。限制饮食似乎推迟了通过降低血浆il - 1发生中风β的水平。

我们发现血浆il - 1的水平β,但不是il - 6和TNF -α,也显著大于SHRSP高于WKY或萎缩的这份报告。il - 1β粘附分子的表达增加(ICAM-1和血管细胞粘附molecule-1)和MCP-1脑血管内皮细胞(CVECs) [12],它刺激单核细胞/巨噬细胞渗透到大脑和诱导血脑屏障损害(13,14]。这些机制可能是中风发病基础。除了动物研究,il - 1信号集中在人类作为中风的治疗目标(15]。因此,本研究的目的是阐明炎症的作用,尤其是il - 1β,在SHRSP中风的发病。

2。材料和方法

2.1。动物

纯种京都老鼠/ Izm (WKY) / Izm自发性高血压大鼠(月),和SHRSP / Izm(男性)从日本购买SLC Inc .(日本静冈县)和特定的无菌条件下保持在一个温度控制的房间里(°C) 12小时光/暗周期。每个动物都保存在一个单独的钢罩。所有动物实验与批准,国家健康和营养研究所动物研究伦理委员会。

2.2。食物摄入、体重和血压

食物摄入、体重和血压测量如前所述[16]。

2.3。血浆细胞因子水平

WKY、萎缩和SHRSP(男,4周的年龄,在每个应变)获准在一夜之间迅速。血液从腹主动脉在麻醉下,迅速和等离子制备。血浆il - 1β、il - 6和TNF -α与Quantikine鼠il - 1水平测定β(最小检测量是5 pg / mL), il - 6(最低可检测剂量14-36 pg / mL),或TNF -α(最小检测量是5 pg / mL)免疫测定设备,分别(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国)。血浆CRP水平决定了大鼠c反应蛋白ELISA检测组件(最小检测量3.9 ng / mL)(生活诊断,Inc .,西切斯特,PA,美国)。

2.4。脑血管内皮细胞

WKY、萎缩和SHRSP(男,4周的年龄,在每个应变)麻醉下丧生。大脑被移除,CVECs收获如前所述[16]。CVECs与内皮细胞培养基底Medium-2 (Lonza Walkersville,医学博士,美国)和10通道中使用数字。

2.5。定量实时聚合酶链反应

从CVECs总RNA提取试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和反向转录Omniscript RT工具包(试剂盒、GmbH是一家现代化的、希尔登,德国)和低聚糖(dT)引物。反应在96孔板进行SYBR绿色PCR大师混合和7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。结果表示为目标的拷贝数比mRNAβ肌动蛋白mRNA。以下rat-specific底漆对使用:il - 1β提出5′-AGCAGCTTTCGACAGTGAGGAGAA-3′;反向5′-TCTCCACAGCCACAATGAGTGACA-3′;IL-1RI向前5′-AATGCATGGCGGCACCATAATCTG-3′;反向5′-CCATCTTGGCGGGAACAAACCAAA-3′;IL-1RII向前5′-AAGGTTCAGGGCACACATGTCCTA-3′;反向5′-ATTGGTTCCGTTCTCCGTGTGAGT-3′;Caspase-1向前5′-GAAAGAATTTGCTGCCTGCCCAGA-3′;反向5′-GCTTGTCTTTCAAGCTTGGGCACT-3′;MCP-1向前5′-TGCTGTCTCAGCCAGATGCAGTTA-3′;反向5′-TACAGCTTCTTTGGGACACCTGCT-3′;ICAM-1向前5′-TGCAGGTGAACTGCTCTTCCTCTT-3′;反向5′-AGCTTCCAGTTGTGTCCACTCGAT-3′;β肌动蛋白向前5′-TTGCTGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′;反向5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3′。

2.6。免疫印迹分析

蛋白质从提取CVECs PRO-PREP(内含生物技术有限公司、京畿道、韩国)根据制造商的指示。CVECs(90毫米)在600年被细胞溶解μL PRO-PREP和孵化30分钟−20°C。然后样本离心机(15000×g 5分钟4°C),和上层清液收集整个蛋白质分数。蛋白质(10μg)隔开sds - page凝胶(12.5%)是electrophoretically转移到Immun-Blot PVDF膜(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国),然后用特定的免疫印迹主要抗体:NFκB p50 (sc - 7178), p52 (sc - 298), p65 (sc - 372), RelB (sc - 226): (sc - 71),和我κB -α(sc - 1643)(1: 200 - 1000稀释,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)。Peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白或anti-mouse免疫球蛋白g(1: 2000稀释,通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)作为二级抗体。乐队是由增强化学发光系统可视化(通用电气医疗集团),并分析了NIH形象(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.7。il - 1β政府

月或SHRSP(男,10周的年龄)皮下注射管理重组鼠il - 1β(2μ克/天)(PeproTech Inc .,落基山,新泽西,美国)或车辆(磷酸盐)使用渗透泵(Alzet模型2 ml4 (2.5μL /人力资源部28天);Alzet公司库比蒂诺、钙、美国)和被喂以普通食物的饮食(热量成分:20%的蛋白质,10%脂肪和70%碳水化合物),从研究饮食公司购买。(美国新泽西州新不伦瑞克)随意和饮用水补充1%氯化钠。SHRSP保持直到死亡,中风和月被杀后麻醉4-week-administration时期。每组由10个动物。

2.8。中风的发病

中风的发病是评估神经症状的出现和生理变化如前所述16]。

2.9。组织学分析

大脑与10%缓冲福尔马林固定的解决方案,切成六冠状部分,嵌入在石蜡,切成4 -μ米部分,并与hematoxylin-eosin染色。出血区域被定义为区域集群血细胞。梗死区被定义为区和坏死,神经胶质过多症,神经胶质疤痕。病变的梗塞、出血或水肿被分为五度损伤区域的百分比在每个部分:整个区域(−),没有异常;(+),0 - 10%;(+ +),10 - 20%;(+ + +),20 - 30%;(+ + + +),30 - 40%;(+ + + + +),超过了40%。

2.10。统计分析

数据均值±SD。统计分析是用单向方差分析进行Bonferroni事后测试参数数据(Statview 5.0, Abacus概念,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。两组数据比较未配对的学生的以及。中风的发病和生存曲线,kaplan meier曲线得到,使用生存率较组进行比较。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。体重、组织重量和血压的压力

在4周的年纪,WKY血压正常的人,月和SHRSP高血压。月和SHRSP显示血压明显高于WKY相比,然而,没有明显萎缩和SHRSP之间的血压差异(表1)。在10周的年纪,WKY仍血压正常的人,月是高血压,SHRSP严重高血压。SHRSP显示血压明显高于WKY相比,月(表1)。然而,SHRSP在这个时代没有任何中风的症状。体重和肝脏重量显著降低在SHRSP高于WKY或萎缩4和10周的年龄。附睾的脂肪组织的重量不是三国不同的老鼠菌株在4周的年龄;然而,它显著低于SHRSP高于WKY或月在10周的年龄。

3.2。SHRSP本地系统和高炎症状态与WKY和萎缩

在4周的年纪,等离子WKY的炎性细胞因子水平,月,SHRSP也测量。il - 6、CRP水平没有显著差异在三个菌株(数据未显示),和TNF -α在我们的检测系统检测不到所有的菌株。另一方面,il - 1β在SHRSP水平显著高于WKY或月(图4周的年龄1(a))。这些结果表明,SHRSP有较高的炎症状态,尤其是il - 1β相比,与WKY或萎缩,尽管SHRSP并不肥胖与WKY或月(表1)。

为了解决il - 1的作用β在中风发作,il - 1β在CVECs signal-related基因表达测定,表型对中风发病的重要。il - 1βmRNA表达在SHRSP CVECs可被检测到,而在WKY察觉和月(图1(b))。此外,mRNA的表达il - 1受体(IL-1RI和IL-1RII), il - 1β处理酶(caspase-1)和il - 1的下游基因β信号(MCP-1和ICAM-1)也显著大于SHRSP高于WKY或月(图1(b))。此外,治疗外源性il - 1β(10 ng / mL) 24小时不仅增加下游基因(MCP-1和ICAM-1),而且il - 1β信使rna表达SHRSP CVECs通过积极的反馈回路(数据未显示)。NF的蛋白质含量κB, il - 1β信号相关的转录因子,也决定从每个老鼠CVECs压力。p50和RelB SHRSP中蛋白质含量明显大于WKY和月(图2)。另一方面,内生NF的蛋白质水平κB抑制剂,我κB,比在低SHRSP萎缩。这些结果表明,系统性和当地il - 1β信号增强SHRSP与WKY或萎缩,这增强了爆发之前,斯托克城。

3.3。il - 1β政府未能诱发中风发作,但月中风的发生率增加

中风SHRSP严重高血压的主要原因;然而,相信其他因素也必须在SHRSP导致中风的发病。增强il - 1βSHRSP信号可能是中风发病的因素之一。澄清这种可能性,月有il - 1持续管理β(2μ使用渗透泵g /天)。管理的il - 1β显著减少食物摄入量在1和2周,体重在1周,但并不影响血压与控制四周政府时期(表2)。等离子体水平的il - 1β显著增加到几乎相同级别的同龄SHRSP第一周内,这和il - 1增加至少持续3周吗β政府(表2)。然而,没有一个动物在两组患中风的迹象(神经症状和生理变化)在四周政府时期,可能是因为在月血压仍低于SHRSP(表1和2)。确定il - 1的影响β在中风的发病率,进行组织学分析。组织学分析显示il - 1β政府稍微增加中风的发病率在萎缩,尽管每个损伤很小,没有引起任何叹息中风的发病(表3和图3)。这些结果表明,il - 1β中风发作的可能是一个原因,但它不可能加剧高血压中风损伤不严重的存在。

3.4。il - 1β政府加速SHRSP中风的发病

地址是否il - 1β信号在中风发病过程中发挥作用SHRSP患有严重高血压、SHRSP接受il - 1的持续管理β(2μ克/天)使用一个渗透泵4周。管理的il - 1β显著减少食物摄入量和体重略有下降,但并不影响血压与控制在1周后管理(表4)。第一个动物il - 1β9组中风迹象表明在天。因此,我们停下来测量血压和取血,以避免任何影响中风的发病。等离子体水平的il - 1β明显高于il - 1β集团控制。在这种情况下,il - 1的管理β大大加速了中风的发病与控制()(图3(一)),即使il - 1β并不影响血压(表吗4)。血浆il - 1之间显著负相关β水平和中风发作的日子在所有大鼠(=−0.600 ()(图3(b))。然而,老鼠的数量是有限的,和额外的实验是需要确保血浆il - 1之间的负相关β水平和中风发作的日子。此外,il - 1的管理β还缩短寿命与控制相比虽然这种差异没有达到统计学意义(图3(c))。为了解决il - 1的影响β恶化的中风损伤和中风类型,进行了解剖分析。没有严重程度和梗死发生率的差异,控制和il - 1之间的出血和水肿β组(表5)。这些结果表明,il - 1β信号会引发中风发作在SHRSP而不是加剧每种类型的中风损伤。

4所示。讨论

虽然中风病灶内炎症存在的迹象,目前尚不清楚引起炎症或中风的结果。炎症条件,如il - 1β在等离子体和il - 1水平βsignal-related基因表达在CVECs SHRSP与WKY相比更大或月中风发作前。除了这些生理条件SHRSP, il - 1β政府稍微增加中风的发病率显著萎缩和加速SHRSP中风的发病。这些数据表明,炎症,尤其是il - 1β信号,可能在中风发病起着重要的作用。

临床研究使用他汀类药物已经使用煽动性的事件作为预防中风的端点。他汀类药物试验的荟萃分析显示,他汀类药物可以减少中风的发病率减少低密度脂蛋白胆固醇不增加出血性中风的发病率(17]。除了cholesterol-dependent效果,cholesterol-independent他汀类药物对中风的影响也被认可(18,19]。然而,他汀类治疗出血性中风的风险增加患者的脑血管疾病的历史,尽管它也明显降低缺血性中风的风险(20.]。因此,接受他汀类药物治疗的患者应仔细监控,避免实现非常低水平的胆固醇,这是一个众所周知的出血性中风的危险因素(21]。

il - 1β可能是一个更重要的目标相比,患中风的预防或治疗与il - 6和TNF -α。血浆il - 6和TNF水平α同样低在本研究中所有老鼠菌株。此外,il - 6介导抗炎作用除了其促炎作用[22),因此,其操纵有害或有益的影响。之前的报告还表明TNF -α有一个双重角色在脑损伤23]。尽管anti-TNF -α策略被证明是有益的其他临床设置,如炎症性肠病,没有anti-TNF -临床试验α代理在中风。相比之下,il - 1的开创者是中风的治疗目标。慢性增加il - 1β表现在大脑中导致白细胞浸润,增加MCP-1和ICAM-1表情在小鼠模型24),这是一个表型也出现在中风病灶。此外,大量的研究已经证明,抑制il - 1的释放或行为显著减少缺血性脑损伤。il - 1α和il - 1β双基因敲除小鼠表现出极大地降低了缺血性梗塞体积与野生型小鼠相比,(25]。动物研究的荟萃分析表明,il - 1受体拮抗剂(IL-1Ra),这是最先进的方法来修改il - 1操作,减少梗塞体积在局灶性脑缺血动物模型(26]。在人类中,静脉注射的II期临床试验IL-1Ra与安慰剂比较急性中风患者目前正在[27]。此外,IL-1Ra基因多态性是缺血性中风的一个危险因素(28]。这些报告表明,il - 1的抑制β信号可能会延缓或预防中风的发生。

我们试图抑制il - 1β信号使用anti-rat il - 1β多克隆抗体。anti-IL-1管理β抗体(600μ稍微g /天),但是不明显,推迟了中风的发病与控制(的生存率较)。有一些原因anti-IL-1β抗体没有延缓中风的发生。首先,anti-rat il - 1β多克隆抗体并不奏效在活的有机体内。等离子体水平的il - 1β(anti-IL-1 pg / mL)并没有改变β1周后抗体管理。看来anti-IL-1β抗体未能抑制il - 1β信号,包括il - 1β-正面反馈调节。然而,抗il - 1β抗体可以抑制il - 1β全身的cox - 2 mRNA表达SHRSP CVECs在体外(数据未显示),这表明anti-IL-1β抗体没有下工作在活的有机体内条件。第二,剂量的anti-IL-1β抗体用于这项研究可能没有足够大的延迟发病。anti-IL-1管理β抗体略有影响中风的发病,但似乎高剂量可能需要看到更大的影响。不幸的是,更多的集中抗体水平使用渗透泵不工作。我们应该解决这个问题在另一项研究。

IL-1R I型和IL-1R II型在SHRSP CVECs mRNA水平是高于WKY或萎缩。IL-1R I型受体是一个信号,而IL-1R II型通常被称为一个诱饵受体,抑制了炎症反应。最近,据报道,IL-1R II型介导il - 1的内化和/或运输β通过血脑屏障(29日]。目前尚不清楚IL-1R II型有促炎和抗炎作用在SHRSP CVECs,但下游基因的表达,如ICAM-1 MCP-1,从SHRSP CVECs显著高于WKY或萎缩。这些结果表明,il - 1β信号增强在SHRSP CVECs,即使IL-1RII充当诱饵。此外,NFκB是一个关键分子参与中风(30.),和p50 RelB蛋白质CVECs SHRSP比WKY大或萎缩。我们的数据支持增加NF的观察κB表达人类中风损伤(31日]。

高血压表型也可能有助于刺激了il - 1β在SHRSP信号,因为高血压导致内皮功能障碍和诱发血管炎症(32]。CVECs用于我们的实验收获4周的年龄,当血压在SHRSP没有不同于萎缩;然而,增强il - 1β信号在CVECs SHRSP而萎缩。因此,刺激了il - 1β信号可能独立建立了基因和高血压。此外,与年龄相关的血压增加可以在SHRSP夸大血管炎症。然而,导致人类和中风更复杂的各种相关因素,如高血压、肥胖、糖尿病、血脂异常、氧化应激、感染,炎症(33]。需要更多的研究来描述il - 1的作用β信号在中风发病。

5。结论

高血压是中风的主要危险因素在SHRSP和人类。我们的研究表明,炎症,尤其是il - 1β信号,可能是中风发作的风险。需要更多的研究来描述il - 1的作用β在中风发病信号,确认如果这个信号可能是中风的治疗目标。

利益冲突

作者没有利益冲突的披露。

确认

这项工作是支持的部分科研补助金(Kakenhi)从日本教育部,文化、体育、科学和技术(下边了,东京,日本)。作者感谢Yasumitsu Akahoshi与病理分析的技术援助。