文摘
我们证明visfatin表达单核细胞和中性粒细胞增加了男性急性st段抬高心肌梗死患者的反应。此外,visfatin强烈出现在脂质丰富的冠状动脉斑块破裂和巨噬细胞。这些结果表明另一种解释可能发挥病理作用的白细胞介导visfatin冠状动脉易损斑块破裂。
1。介绍
正如我们所知,急性心肌梗塞(AMI)在大多数国家是死亡的主要原因,在多年之后仍然很大。炎症是涉及开发和动脉粥样硬化斑块破裂,有相当多的证据支持adipocytokines参与炎症过程(1- - - - - -3]。循环单核细胞进入动脉壁的招聘,其次是分化成组织巨噬细胞,是最早的事件在动脉粥样硬化斑块形成4- - - - - -8]。越来越多的证据表明,单核细胞控制血管平滑肌细胞增殖和迁移9- - - - - -12),脂质代谢13),和炎症(14- - - - - -17在血管壁)。单核细胞因此被提议作为标记,发起者和动脉闭塞性疾病的启动子18,19]。因此,白细胞增多的现象可能导致慢性心脏病的发展通过多种病理生理机制,包括血管炎症,蛋白水解,氧化损伤内皮细胞,堵塞微脉管系统凝过快,促进梗死扩张(20.]。
Visfatin,也称为pre-B-cell colony-enhancing因素,是52 - 55-kDa蛋白质,建议在内脏脂肪细胞非常普遍。研究者证明visfatin是有害的,促炎代理obesity-induced代谢和心血管疾病21,22]。临床和基础报告表明,visfatin炎症蛋白质与斑块不稳定和急性冠脉综合征(ACS) (23,24]。我们最近的研究还表明,血浆visfatin水平与相关动脉(IRA)阻塞,增加血浆visfatin可能与心肌损伤程度密切相关[25,26]。此外,脆弱的损伤与断裂的倾向富含激活巨噬细胞,表明巨噬细胞作为动脉粥样硬化斑块稳定性的关键调节器(27,28]。有趣的是,visfatin也被证明是由免疫细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)29日,30.]。然而,visfatin在流通中的单核细胞和巨噬细胞的表达和冠状动脉斑块破裂急性st段抬高心肌梗死患者肝素)尚未阐明。
的可能与炎症和visfatin协会AMI发病机理,因此我们研究的表达visfatin男性STEMI患者循环白细胞的免疫组织化学染色(包含IHC),流式细胞仪分析和实时PCR。此外,我们还研究了在巨噬细胞免疫反应性visfatin表达人类冠状动脉斑块破裂。
2。材料和方法
2.1。研究人群
我们最初注册7个男性患者(年龄、63±14年)承认在12 h (STEMI的诊断症状出现,2011年6月至2012年6月。STEMI表示了长期的胸痛(> 30分钟),典型的上升增加水平的生化标记(简单以及/肌酸磷酸激酶)与缺血性症状持续≥30分钟,和一个st段抬高≥2≥2.0毫米的连续的心电图描记的线索。六个男性专注对照组(年龄、58±13年)发生了冠状动脉造影检查,并记录无关紧要的冠状动脉狭窄是记录。书面通知同意之前从患者获得注册。指导方针的研究是在协议进行人体研究伦理委员会批准的在我们医院。
2.2。在循环白细胞免疫组织化学
avidin-biotin-peroxidase复杂商业方法(DAKO有限公司Carpinteria, CA)是用于包含IHC分析。大约有100μL heparin-containing血液孵化2毫升的红细胞(RBC)赖氨酸溶液(BD生物科学,圣何塞,CA)在室温下15分钟去除红细胞表面。洗后用2毫升DPBS (Gibco,宏伟的岛,纽约)含5%胎牛血清,这些细胞被resuspended在0.1毫升的相同的缓冲和离心机在250 rpm的8分钟poly-L-lysine(密苏里州圣路易斯西格玛化工有限公司),由cytospin预镀幻灯片(日本久保田公司- 5920,日本久保田公司有限公司东京)。细胞在幻灯片上固定有95%甲醛在室温下为3分钟。内源性过氧化物酶活性被孵化的部分0.3% H2O2在磷酸盐(PBS) 30分钟和孵化1%牛血清白蛋白(BSA) 30分钟阻止非特异性染色。幻灯片是排水和孵化一夜之间在室温湿度室与各自的兔子反主要抗体visfatin(1: 200)和抗体稀释剂稀释(DAKO Corp .)、斯特鲁普、丹麦)。主要的抗体购自凤凰制药有限公司(CA)贝尔蒙特。avidin-biotin-peroxidase复杂(ABC复杂;美国DAKO Carpinteria, CA)是应用于部分后孵化与生物素化的二次抗体(美国CA Carpinteria DAKO公司)。幻灯片与民建联substrate-chromogen孵化解决方案(Carpinteria Dako公司、钙、美国),与苏木精复染色,安装在一个水安装介质。负控制研究进行更换的主要抗体多发地抗血清与苏木精复染色。
2.3。细胞内染色和流式细胞术
双重免疫荧光染色法,100μL heparin-containing血液的孵化与PE / CY5-conjugated鼠标反为T淋巴细胞CD3, PE-conjugated鼠标反CD13嗜中性粒细胞,PE-conjugated鼠标反为单核细胞CD14,和PE / CY5共轭鼠标反CD19 B淋巴细胞,在黑暗中在室温下30分钟的余地。所有的抗体使用双重免疫荧光染色从BD购买生物科学。然后,2毫升的红细胞溶解的解决方案是添加和孵化在室温下15分钟。洗后用2毫升DPBS含1%胎牛血清和2%的叠氮化钠,细胞被固定为3%多聚甲醛在DPBS在室温下20分钟。包含0.05%的细胞与DPBS洗两次皂苷(σ),然后孵化与主兔子反PBEF / visfatin血清(凤凰),与DPBS-saponin稀释100倍,在室温下20分钟。洗后DPBS-saponin细胞被孵化,Alexa萤石488山羊anti-rabbit免疫球蛋白(表达载体/分子探针)在室温下为20分钟。细胞被封闭的基于光散射和侧角散射角和进一步分析使用细胞追求Pro软件(Becton Dickinson) visfatin于外周血细胞的表达。
2.4。冠状动脉斑块破裂的Visfatin和CD68免疫组织化学染色
冠状动脉斑块破裂是可以从7 STEMI研究的病人主要经皮冠状动脉介入(PCI)和由美敦力公司吸气安全线和愿望系统设备如前所述24]。一个avidin-biotin-peroxidase复杂的商业方法(ABC复杂;Dako公司Carpinteria、钙、美国)是用于包含IHC分析。在人类冠状动脉斑块破裂是4 -μ米石蜡部分安装在幻灯片,干30分钟的烤箱(60 - 70°C),和deparaffinized二甲苯。幻灯片是用微波加热预处理如前所述[31日]。微波治疗后,部分在PBS洗。在这之后,内源性过氧化物酶活性被孵化的部分0.3% H2O2在PBS 20分钟和孵化1% BSA 30分钟阻止非特异性染色。一夜之间,部分被排干孵化在室温湿度室与各自的兔子反主要抗体visfatin(1: 200)和鼠标反主要抗体CD68(1: 50)稀释抗体稀释剂(DAKO Corp .)、斯特鲁普、丹麦)。ABC复杂应用的部分后孵化与生物素化的二次抗体。与民建联substrate-chromogen孵化的部分解决方案(Carpinteria Dako公司、钙、美国),与苏木精复染色,安装在一个水安装介质。负控制研究进行更换的主要抗体多发地抗血清与苏木精复染色。
2.5。循环白细胞Visfatin mRNA的表达
总循环白细胞RNA分离得到7研究随机AMI患者的血液和6专注控制使用试剂盒试剂。一微克每total-tissue RNA是稀释在水里在最后一卷50μL,使用高容量的RNA是反向转录cDNA档案箱50(应用生物系统公司)μL反应混合物。RT反应进行了9700年GeneAmp PCR系统热循环在两个孵化的步骤中,初始25°C孵化10分钟紧随其后的是最后一个37°C孵化2 h。实时PCR分析使用lightCycler1.5仪器(罗氏,曼海姆,德国)。PCR进行LightCycler毛细管在10μL反应体积,包含1 x DNA主人SYBR绿色我,2.5毫米MgCl2,1μL cDNA、和0.4μ引物。PCR协议如下:初始变性2分钟在95°C, 45周期在95°C,持续10秒,5秒60°C, 12秒72°C。3.5.3结果分析LightCycler软件,版本。Sequence-specific为Visfatin正向引物,引物GCTGCTGGAACAGAATAGCC CATAGGAGCATCTGCTCACTT和反向引物。Sequence-specific引物对β肌动蛋白是一个正向引物,TCCTTCCTGGGCATGGAGTC和反向引物5′-TTCTGCATCCTGTCGGCAATG-3′。
2.6。统计分析
急性STEMI visfatin mRNA表达之间的差异和控制受试者使用非参数Wilcoxon测试分析。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。统计分析使用SAS统计软件,版本8.2 (SAS研究所有限公司;卡里,NC)。
3所示。结果
包含IHC visfatin分析蛋白质在白血细胞(白细胞)显示积极的棕色染色明显的单核细胞(图1(一))和中性粒细胞(图1(B))(放大,×1000)。染色没有在控制部分,主要抗体是取代多发地抗血清(图1(C);放大,×400)。图2表明细胞内染色为区分不同的白细胞计数控制基于前进角光散射角和侧光散射分析。最强烈的染色嗜中性粒细胞(CD13 +)和单核细胞(CD14 +)从所有科目,但是附近没有染色T (CD3 +)或B淋巴细胞(CD19 +)。
此外,CD68免疫反应性冠状动脉斑块破裂的巨噬细胞被发现(图3(一个);放大、×20)和强visfatin免疫反应性动脉粥样硬化冠状动脉斑块破裂从7 STEMI患者被发现(图3 (c);放大,×20)。没有染色时被发现在控制部分主要抗体是取代多发地抗血清(数字3 (b)和3 (d))。此外,进一步探索visfatin的潜在作用在急性STEMI的发病机理,与实时PCR循环白细胞。重大visfatin mRNA表达在循环白细胞比专注控制急性STEMI患者()(图4)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
AMI患者白细胞计数的预测价值近年来被广泛报道(32- - - - - -34]但罕见的研究已经取得了关于任何特定亚型的白细胞adipocytokines可以负责这个详细的协会。目前的研究表明两个主要发现。首先,我们证明了visfatin表达单核细胞和中性粒细胞增加他们在男性急性STEMI患者反应性。第二,visfatin强烈地出现在脂质丰富的冠状动脉斑块破裂和巨噬细胞。这些结果表明另一种解释如何可能发挥病理作用的白细胞介导visfatin冠状动脉易损斑块破裂。
一个大型研究报道,高单核细胞计数在中年健康男性是一个预测冠状动脉事件的后续期间(35]。在白细胞分数评估中,只有单核细胞计数预测冠状动脉事件的风险。炎性浸润过程应考虑冠心病的一个独立的表达程度在所有斑块的AMI。斑块炎症已成为一个必须的特性在事件导致斑块易损性和破裂36]。斑块破裂与大量的炎症细胞和趋化因子共存,主要从巨噬细胞泡沫细胞(37]。巨噬细胞合成和释放多种生长因子,还分泌金属蛋白酶,削弱纤维帽和使它容易断裂可能是AMI的重要机制38]。最近的研究表明,visfatin可能是临床上重要的细胞因子与炎症、动脉粥样硬化、斑块不稳定的角色在ACS (23,24]。已经证明visfatin可以激活人类白细胞表达il - 1β肿瘤坏死因子-α,il - 6 (39单核细胞的)和增加单核细胞矩阵metalloproteinase-9活动THP-1细胞(24]。这些机制可能部分解释我们之前报道血浆visfatin水平与爱尔兰共和军阻塞和密切相关的急性STEMI患者心肌损伤的程度(25,26]。然而,生物机制涉及intraleukocyte visfatin表达式在STEMI的发病机制不清楚。
先前的研究表明,visfatin诱发costimulatory CD80分子的表达(B7-1)和CD40在人类单核细胞并观察显著诱导细胞间粘附molecule-1 (CD54) [39),另一个costimulatory配体结合淋巴细胞功能——antigen-1有关,从而促进t细胞的活化40]。此外,证据表明visfatin影响淋巴细胞反应主要是通过增加增生性反应存在剂量依赖的相关性与visfatin [preincubating单核细胞后41]。在目前的研究中,包含IHC染色合格visfatin位置和mRNA实时PCR量化visfatin表达式揭示了visfatin海拔急性STEMI的部分机制。我们演示了visfatin居多的局部中性粒细胞和单核细胞由实时PCR包含IHC染色和增强的表现。因此,在急性期的AMI患者血清visfatin水平高度,其中一个主要来源是来自嗜中性粒细胞和单核细胞。它可以解释说,在pre-PCI AMI组的急性期主题,中性粒细胞和单核细胞计数的快速生产与visfatin水平升高比non-AMI控制。
此外,我们的研究结果还表明,visfatin弥漫性冠状动脉斑块破裂中表达包括脂质核心和许多巨噬细胞除了破坏内皮和渗透是同意先前的研究[24]。此外,我们还证明了visfatin mRNA表达在循环白细胞显著增加比专注对照组急性STEMI患者。马登et al。42)和巴伦et al。43]发现白细胞计数和激活白细胞升高与降低心外膜血流和心肌灌注以及thromboresistance和病理生理过程中起作用导致爱尔兰共和军闭塞。这些观察的基础上,我们认为炎症细胞过度的visfatin循环和冠状动脉斑块破裂可能解释越来越多的文献,炎症和急性STEMI的链接。我们相信,还需要进一步的研究来确定visfatin在AMI患者的作用。
我们研究的局限性,visfatin水平升高是否发现STEMI可以直接从细胞内信号翻译表达内皮功能障碍,血管炎症,斑块dysabilization,氧化应激,促凝剂活性增加,仍需要进一步的阐明。
总之,男性STEMI患者显示visfatin表达在白细胞增加,这可能会加重动脉粥样硬化斑块的不稳定的发展。因此,白细胞介导visfatin表达可能是一个有价值的冠状动脉易损斑块破裂的标志和可能在STEMI发挥潜在的病理作用。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢E-Da医院中华民国,台湾在经济上支持这号合同下的研究。EDAHP100032。作者感谢员工和心脏保健团队的成员各测量和其他援助组织方面的研究。