文摘
目标。肿瘤坏死因子-α(TNF)在宿主炎性反应中起着举足轻重的作用。的血清中肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子的生产lympho /单核细胞,然而,似乎显示出高的个体差异。本研究的目的是探讨肿瘤坏死因子的变化和可诱导性活动在两个年龄组的健康志愿者。方法。六十老人,健康的志愿者进行了研究。这些人免费的恶性疾病,和三个月内,他们没有任何外伤或炎性疾病和没有服用任何类固醇或nonsteroid消炎药。三十的年轻志愿者还被包括在内。血液采集标本;lympho /单核细胞分离和培养有或没有内毒素(LPS)刺激。浮在表面的肿瘤坏死因子血清和文化通过生物测定使用WEHI 164细胞水平测定。结果。结果显示显著的个体肿瘤坏死因子的变化水平的健康志愿者不分年龄。子组与低、中、高血清TNF-levels是杰出的。在大约50%的志愿者serum-TNF较低活动,LPS刺激未能增加肿瘤坏死因子生产由孤立lympho /单核细胞。结论。我们的数据表明有机会为感染性并发症选择患者增强敏感性。
1。介绍
内毒素脂多糖(LPS)革兰氏阴性细菌外膜的)强有力地刺激人类单核细胞释放几个重要的生物活性物质,包括白介素1 (il - 1)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和前列腺素E2(铂族元素2)[1]。这些因素促使大量的生物反应体内平衡的重要性,在宿主防御机制,可能在一些疾病的发病机理1,2]。
据报道,单核细胞可以在体外处理没有“自发”激活monokine分泌,但极低浓度的有限合伙人可以引起显著的il - 1的分泌TNFα和铂族元素2从人类单核细胞(3]。这是证明IL-1-TNF的分泌α和肿瘤坏死因子α铂族元素2有紧密的关联,个人间的差异monokine和PGE2分泌物发生(3]。
Cyclo-oxygenase (CO)代谢产物如铂族元素2可以抑制肿瘤坏死因子α生产高浓度,大概增加营水平的细胞。低浓度的铂族元素2然而,似乎刺激鸟苷酸环化酶,导致增强TNFα生产。肿瘤坏死因子α信使rna的积累也被铂族元素2,与降低TNF产生影响α转录(4]。
循环水平,活动,和肿瘤坏死因子的生产速度α强烈受内在和环境因素。启动子区域的基因变异tnfa(5],TNF-processing金属蛋白酶的活性[6),其他细胞因子的水平3,4)和可溶性肿瘤坏死因子受体(7),以及密度和信号级联的cell-bound TNF受体(8)都参与建立实际的TNFα活动。监管途径的多样性导致波动和大型个人间的差异。即使个别差异背后的原因不是完全探索,TNFα状态估计可能的免疫化学测定循环蛋白质水平或评估的转录率tnfa基因。生理活性细胞因子水平,然而,可以通过生物最好的接近,表明这种物质的生物有效性。每个方法都有优点和缺点。在提出研究中,生物wehi - 164细胞被用来评估生物活性的肿瘤坏死因子水平α。
本研究的目的是调查可能的个人间的差异血清TNFα活动和在肿瘤坏死因子α生产外周血单核细胞(PBMCs)有限合伙人和将这种差异与健康个体的年龄。
2。材料和方法
60岁老年志愿者包含在这个实验。受试者的居民在一个拥有80个床位的综合医院康复机构。排除标准是恶性疾病、炎症、感染、创伤后三个月内,nonsteroid消炎药和/或抗生素。三十青年志愿者(两性)收集从医院工作人员相同的排除标准。il - 1血清水平变化与排卵(9),年轻女性研究1和14天的月经周期。包括七个女性30个志愿者。获得知情同意后,血液样本取自捐献者没有体育锻炼血液采样和上午正常温度。表中描述的主题研究1。
2.1。样本采集
真空采血管系统用于取血。静脉血是EDTA管收集。为达到最佳效果,血是PBMCs 2小时内处理。另一管用于获得血清样本,是储存在−20°C到TNFα化验。
2.2。分离外周血单核细胞(PBMCs)
7毫升全血仔细分层到7.0毫升histopaque - 1077(σ、匈牙利)50毫升锥形管和离心机在400 g在室温下10分钟。离心后,小心翼翼地将不透明的界面转移到一个干净的锥形离心管和混合10毫升等张磷酸盐(PBS;pH = 7.2)。后离心10分钟(250克),细胞颗粒在12毫升resuspended PBS。程序是为了消除重复共产党连续HISTOPAQUE污染,那么细胞resuspended RPMI 1640的玫瑰(Gibco,佩斯利,英国)和谷酰胺,0.8×10−3mol / L补充5%牛血清(称为培养基(CM))。细胞计数,分成至少两个aliqots和培养106细胞/毫升1厘米有或没有μg / mL有限合伙人,在圆底聚丙烯瓶(38×12.5毫米,Nunc、鲁开德、丹麦)5%股份有限公司2/湿空气在37°C。有限合伙人剂量选择剂量效应的有限合伙人在这个系统(0.1 ng / mL - 1000 ng / mL)。24小时后,终止了孵化离心250 g和整除的上层清液储存在−直到TNF 80°Cα测量。孵化时间短(3小时)演示了通过PBMCs TNF生产低很多。
2.3。肿瘤坏死因子的生物α活动
十μL整除的血清样本稀释了40μL无血清最低基本培养基(MEM;σ)在96年组织培养板,和50μ暂停wehi - 164 L细胞无血清MEM添加导致2×104细胞/在10%(病人的)血清含有液体环境。测量肿瘤坏死因子的活动lymphomonocyte条件媒体,20μL培养基从lymphomonocyte文化的整除(增长在10% FCS补充MEM)被添加到小文化区wehi(2×10 - 164细胞4细胞/ 80年)增长μL MEM培养基补充10%胎牛血清。控制文化生长在MEM补充FCS为10%。校准,wehi(2×10 - 164细胞4细胞/)孵化与不同浓度(0.005 -10 ng / mL)的人类肿瘤坏死因子α在相同的条件下。
WEHI细胞孵化24小时37°C公司为5%2。在孵化的结束,文化是由MTT-reduction方法的可行性。简单地说,50μL培养基的吸气和10μL(1.25毫克/毫升股票加入了麻省理工的磷酸盐溶液(最终MTT浓度为0.125毫克/毫升)。1.5小时孵化后,150年μL盐酸(0.08米)增加了异丙醇酸化,和生产甲瓒被磨碎溶解。光学吸附决心在570 nm(测量)和630 nm波长(参考)在一个微型板块读者(MWG-BIOTECH / BioRad)。
每个数据点被确定为平均数±标准差的数据来自四妹妹的文化。可行性计算控制的光密度的百分比(100%)。被转换为TNF的生存能力值α浓度方程得到可行性决定在肿瘤坏死因子定义α浓度。
TNF测量样本来自不同的子组的志愿者和样本重复3个月,1年和9年。
临床实验室值如淋巴细胞计数、c反应蛋白和γGT是由常规临床评估程序
2.4。统计分析
所有数据是作为意味着±标准差(SD)。使用学生执行统计分析t以及PBMCs的可诱导性。被认为具有统计学意义。
3所示。结果
志愿者的人口数据和重要的实验室值包含在表的研究进行了总结1和2。c反应蛋白和γ老年志愿者的GT值明显高于年轻人。尽管高程,γGT仍在正常范围内,而体内c反应蛋白升高,高于正常范围内。
3.1。老年志愿者
从60岁志愿者,50人被成功的数据进行了分析。明显的个体差异被发现在血清TNFα活动水平(图1(一)和1 (b))。订购个人数据,可以提出三个不同的子组(c):组患者低、中、高TNF-activities是杰出的。类似的个体差异在肿瘤坏死因子被发现α生产PBMCs(数字2(一个)和2 (b))。在大多数文化液体nonstimulated lympho /单核细胞,肿瘤坏死因子α活动0.1 ng和1.0 ng / 10之间6细胞/ 24小时被发现。在大约25%的文化中,然而,显著降低(< 0.1 ng / 106细胞/ 24小时)和大约30%的准备高(> 1.0 ng / 106细胞/ 24小时)TNF-production被发现(图2 (c))。排序的数据导致了类似的分布在体外TNF-production血清TNF活动水平的分布。对内毒素(LPS)刺激,细胞因子活性增加中间和在大多数TNF产生文化低,而高与增强TNF生产商没有回应α生产(图2 (c))。13在5低生产者文化(小于0.1 ng TNFα/ 106细胞/ 24小时),然而,也未能对内毒素刺激(d)。四5这些志愿者血液采样后30天内死于肺炎。
(一)血清肿瘤坏死因子α水平老年志愿者
(b)血清肿瘤坏死因子α值以老年志愿者
(c)在老年志愿者血清肿瘤坏死因子α值
(一)体外肿瘤坏死因子α值由PBMCs老年志愿者
(b)基底肿瘤坏死因子α值由PBMCs为了老年志愿者
由有限合伙人(c)的可诱导性PBMCs老年志愿者
由有限合伙人(d)的可诱导性PBMCs下调老年志愿者的子群
3.2。年轻的志愿者
类似于老年人口,血清TNFα活动展示了大的个体差异(数字3(一个)和3 (b))在年轻的志愿者。因此,三个子组也可以年轻人口(c), TNF的个体差异α生产PBMCs还发现(数字4(一)和4 (b))和低、中、高TNF-producer文化(c)可以分类。在子群与TNF最低α生产(),lympho / 2志愿者没有回应的单核细胞内毒素刺激(d)。
(一)在青年志愿者血清肿瘤坏死因子α值
(b)血清肿瘤坏死因子α值以在青年志愿者
(c)在青年志愿者血清肿瘤坏死因子α值
(一)体外肿瘤坏死因子α值由PBMCs青年志愿者
(b)基底PBMCs肿瘤坏死因子α值的顺序青年志愿者
(c)的可诱导性PBMCs有限合伙人在青年志愿者
由有限合伙人(d)的可诱导性PBMCs下调子群的年轻志愿者
细胞因子生产与月经周期变化,7年轻的女性志愿者的血液标本1和14天的周期。结果随周期分别,在血清和在体外实验(图5(一个)和5 (b))表明类似的个人间的差异女性在男性。这些个人间的差异是由月经周期进一步复杂。
(一)血清中肿瘤坏死因子α值女性志愿者在第一天和day13月经周期
(b)的可诱导性PBMCs女性志愿者在第一天和月经周期的第14天
重复测量的时候给了相同数量的肿瘤坏死因子和子组的个人支持的想法表型差异发现人口质量是一个常数。
4所示。讨论
研究的主要发现可以概括为:(a)老年人和年轻人群展示循环TNF的标志着尊重个体差异α活动以及肿瘤坏死因子的生产αPBMCs;肿瘤坏死因子(b)α活动轮廓,值,中间值和调节子组调查人群,不分年龄;(c)五个人“下调”子群的老年人没有回应LPS刺激,其中四个在一个月内死于肺炎;(d)年轻女性显示肿瘤坏死因子α活动与月经周期的波动。
肿瘤坏死因子α宿主防御服役时在适当的浓度,导致系统性不良反应如果存在超过。在低剂量,这是至关重要的;在高剂量,它是有害的2,10]。在新兴的个性化医疗时代,肿瘤坏死因子生产的重要的个人间的差异,那些没有发现在其他细胞因子(11),应考虑。标志着个人间的差异由人类单核细胞细胞因子和cyclo-oxygenase生产发表(3]。
观察到的个体差异在TNF的生产α,但不是在其他细胞因子(11部分),可以解释为基因多态性。细胞因子基因多态性几件物品已经被确认为因素对各种疾病的易感性,包括自身免疫、感染、过敏,或心血管疾病(10,12,13]。监管区域的细胞因子基因多态性与高、低相关细胞因子的生产和可以调节的大小后移植同种免疫的反应(13]。肿瘤坏死因子的频率α基因型也显著不同的多个器官衰竭患者之间和控制。中间肿瘤坏死因子α生产商是弱势(5.7%比23%),高TNFα生产商过多(35.2%比16%)患者组(14]。
遗传素质高白细胞介素- 10”生产或中间TNFα生产可能保护进入重症监护室虽然曾承认,任何保护所提供的这些基因型似乎迷路了。促炎和抗炎细胞因子基因型支持平衡细胞因子反应是有利的,与延长病人生存时间(14]。
多个基因筛查可能预测潜在的细胞因子反应,TNFα基因分型,但是,不能预测它,不会与死亡率(14]。
肿瘤坏死因子α和其他活动强烈受细胞因子水平。Cyclo-oxygenase代谢物如铂族元素2可以抑制肿瘤坏死因子α生产高浓度但似乎增强它在低浓度。有越来越多的证据表明,类花生酸的生产,拥堵的,和细胞因子可能是相互关联的:il - 1、TNFα各细胞,诱导PG合成,动力,反过来,调节细胞因子的生产(4]。相比之下,leukotriens可以增强il - 1、il - 6和TNF生产和il - 1、TNF和干扰素γ也能导致拥堵的合成在一些细胞类型,包括内皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞,在拥堵的,反过来,增强il - 1、il - 6和TNF生产老鼠和人类细胞。如此积极的反馈回路与潜在放大免疫或炎症反应可能的负反馈作用抵消了il - 6对il - 1和肿瘤坏死因子(4]。这个负面反馈可能占LTB有限生产的il - 14刺激单核细胞,容易产生大量的il - 6。它也可能解释il - 1、TNF的增强生产观察治疗后单核细胞有双重有限公司/ 5-LO抑制剂(4]。
多个法规包括角色的可溶性细胞因子旁TNFRs相声(8启发我们测量肿瘤坏死因子α活动,而不是蛋白质含量的测定。在目前的研究样本的坏死性效果WEHI 164细胞被确定,也就是说,一个平衡的效应细胞坏死和防护材料进行了研究。因此,一个更现实的生物活性测定。
当比较年轻和老年人口内毒素宽容,例如,重复LPS刺激效果低于对肿瘤坏死因子的主要挑战α生产不应该被忽视。CRP值越高老年志愿者可能表明一些炎症过程,包括之前的有限合伙人的挑战,在漫长的人生故事。虽然内毒素耐受是一个众所周知的情况下,有关其有益的或有害的后果有争议的数据(15]。在高肿瘤坏死因子α生产、内毒素耐受可能是有益的,因为它可以防止进一步的TNFα生产。然而,我们的研究结果表明,它可以是有害的,在这种情况下,当低TNFα活动结合低可诱导性。
低可诱导性的解释观察到青年志愿者尚不明朗。即使在缺乏明确的解释,然而,这一事实nonignorable人们显示低TNF的一部分α活动结合低TNFα可诱导性敦促临床考虑。这意味着有个人(调查人口的大约10%)被感染更多的濒危,不论年龄。此外,内毒素耐受可能扩大这种危险与衰老。
5。结论
综上所述,我们的结果,符合观测早些时候,强烈建议对测定的快速检测和监测的可选用TNF水平。有争议的结果的几个anti-TNF治疗人类败血症可能也解释了通过了解个人层面的多效性的细胞因子在治疗(16]。
利益冲突
不存在利益冲突。
确认
这项工作的一部分是外科感染Society-Europe第20届国会,法兰克福,德国,2007年。这项工作是由国家科学基金会支持(OTKA)授予(没有。T38436)。