文摘
背景。氧化应激作用在许多慢性炎症性肺疾病的发病机理。呼出的气息凝结(EBC)集合是一种非侵入性方法探讨肺部氧化应激标志物如丙二醛(MDA)。对象和方法。我们测量EBC中MDA含量大量的患者()与呼吸道疾病:哮喘()、支气管扩张(,)、慢性阻塞性肺疾病(慢性阻塞性肺病,)、特发性肺纤维化(IPF),)。14个健康不吸烟的受试者作为控制。结果。不包括IPF主题,在所有疾病组MDA水平明显高于对照组。哮喘和慢性阻塞性肺病的MDA显著高于主题。在哮喘患者中,corticosteroids-treated受试者MDA水平低于未经处理的主题。COPD受试者显示MDA浓度和FEV之间的负相关1%(ρ:,)。结论。EBC-MDA增加受试者的慢性呼吸道疾病,尤其是在慢性阻塞性肺病,FEV有关1减少。
1。背景
氧化应激中起着重要的作用在许多慢性炎症性肺疾病的发病机制,特别是在COPD和哮喘,这是一个重要的后果irritant-induced支气管上皮细胞的损伤,代表一种放大机制通过炎症细胞在气道的招聘1,2]。
在众多生物氧化应激的目标、膜脂质是最常涉及的生物分子。脂质过氧化反应产生大量的二次产品能够提高氧化损伤(3]。除了他们的细胞毒性特性,脂质过氧化物越来越认可作为信号转导的重要事件的炎症反应(4]。
呼出的气息凝结(EBC),通过冷却空气呼出,最近被证明是一个很好的生物工具来监控下呼吸道的炎症和氧化应激(5]。一些生物标记已经以EBC,包括醛、H2O2、腺苷、isoprostanes白细胞三烯和细胞因子,越来越多的研究报告使用EBC气道粘膜液成分的调查在几个呼吸系统疾病(6]。
丙二醛(MDA)已被广泛研究,多不饱和脂肪酸过氧化的产物。高MDA水平曾被观察到在几个生物液体从不同的呼吸道疾病包括哮喘患者7- - - - - -11),慢性阻塞性肺病(11,12),和支气管扩张13]。MDA在EBC一直以研究相对较少9- - - - - -12),只有其中的一些包括大量的科目(9,10]。
在这项研究中,我们测量和比较EBC的MDA水平的一大群被试者有不同的肺疾病为了探索可能的有效性的测量评估不同的肺部疾病。
2。方法
2.1。主题
呼出的气冷凝收集194例受不同气道疾病参加到我们的肺组。哮喘患者(A,)、支气管扩张(,)、慢性阻塞性肺疾病(慢性阻塞性肺病,)和特发性肺纤维化(IPF,)包括在这项研究中。14个健康不吸烟的受试者作为控制。
对于每一个主题,诊断和评估不同的疾病的严重程度进行根据国际准则的建议14- - - - - -17]。特别是,哮喘患者分为根据常规治疗与吸入糖皮质激素的存在,而慢性阻塞性肺病患者根据FEV分为中度或重度1≥或< 50%的预测,分别15]。支气管扩张的诊断确认所有病人的胸部高分辨率计算机断层扫描(HR-CT);支气管扩张是主键或特发性13个病人,二级6例(17]。所有IPF患者除了6在低剂量口服糖皮质激素与咪唑硫嘌呤(9例)和/或N-acetyl-cysteine(23例)。病人和健康受试者的临床资料表1。
肺功能测试和其他测量用来评估诊断和严重程度不同的疾病根据标准方法进行。特别是,通过计算机进行肺功能测试肺活量计(Medgraphics、心和肺的诊断,圣保罗,明尼苏达州,美国)和盲肠的结果表示为百分数(欧洲共同体对钢铁和煤炭)预测值(18]。
所有患者疾病的检查在一个稳定的阶段,没有急性恶化的前一个月。知情同意参与这项研究是获得所有的病人。
2.2。呼出的气息凝结(EBC)集合
EBC收集与专门设计的冷凝器冷却呼出空气(Ecoscreen, Jaeger,维尔茨堡,德国)。受试者呼吸潮15分钟通过双向non-rebreathing阀门以防止吸入唾液和呼吸空气混合和陷阱(5]。立即EBC样本存储在−80°C到分析,6个月内进行收集,作为推荐的先前的研究[9,11]。
2.3。丙二醛分析EBC
丙二醛(MDA)浓度测定在EBC样本根据Larstad描述的方法et al。19]。样本与硫代巴比土酸(25毫米derivatized H2阿宝40.3米,pH值3.5)在95°C水浴60分钟,冷却5分钟的冰中,然后可以在室温下恢复了40分钟前分析。
使用高效液相分析cromatography(高效液相色谱)连接到一个荧光检测器(二进制高效液相色谱泵1525和2475多λ荧光检测器、水域、意大利米兰),配备了北极星C18柱,150×4.6 mm ID、颗粒大小5μ米(美国瓦里安)。激发和发射波长是532和553海里,分别。流动相是由乙腈:20 mM磷酸钾缓冲pH值6.8 (25:75,v / v),流速为1.3毫升/分钟。该方法检测极限为4.1 nM, 96%的复苏。内部,interassay再现性分别为8.7%和1.9。图1显示了Bland-Altman散点图的两种重复测量的150个样本:组内相关系数是0.854。
2.4。痰归纳和分析
哮喘患者痰液进行了108年)、慢性阻塞性肺病()和支气管扩张()。痰液进行了归纳和分析如前所述[20.,21]。吸入沙丁胺醇预处理后,高渗盐溶液(HS:氯化钠4.5% w / v)是通过一个超声波雾化器(2.8毫升/分钟输出;DeVilbiss Ultraneb 2000,萨默塞特,美国宾夕法尼亚州)诱导痰生产。在受试者FEV1低于35%,等渗盐水(w / v)是:氯化钠0.9%作为推荐(20.]。雾化后停止如果FEV 15分钟或更早1从基线值下降了20%或更多。之前,每5分钟之后开始雾化,FEV1测量,然后患者要求仔细冲洗自己的嘴和喉咙去丢弃唾液和咳嗽痰变成一个容器。
从收集痰液样本处理在两个小时内;更多的半流体的和密集的痰选择和加工部分如下。简单,样品匀浆通过添加0.1%(德勤)震动浴在37°C,持续15分钟,然后从上层清液离心分离细胞。细胞颗粒在PBS resuspended可行性和细胞总数和整除准备幻灯片用于微分细胞计数。至少300炎症细胞数。巨噬细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞值表示为炎症细胞总数的百分比。幻灯片细胞生存能力< 50%,300年鳞状细胞,炎症细胞的数量无法计算被认为是不足和丢弃。
2.5。统计分析
功能数据表示为平均值和标准偏差和生物数据值和范围。两组之间的差异进行了测试使用未配对t以及和Mann-Whitney测试正常,非正态的分布变量,分别。差异三个或更多组测试使用方差分析和克鲁斯卡尔-沃利斯测试正常,非正态的分布变量,分别。功能和生物指标之间的相关性评估使用斯皮尔曼等级相关测试。一个P值低于。05年被认为是重要的。
组内相关系数计算评估MDA interassay再现性(值超过0.70通常解释为满意)和Bland-Altman情节用于图形化表示两者之间的变化测量(22]。协议的限制表示为±2个标准差(SDs)的均值差异的两个测量95%的重复措施预计将谎言。
3所示。结果
所有测量的MDA的分布在患者EBC在正常人和不同的疾病报告图2。健康受试者和IPF患者分布在较低的MDA,而慢性阻塞性肺病患者主要表现在MDA浓度较高的类别。
除了IPF患者,显示MDA水平与健康对照组相似(15.2(4 - 79)和15.6(4-25)纳米,职责),所有疾病组的MDA水平高于健康对照组(图3)。在哮喘患者中,没有区别在抑制MDA观察和轻/中度哮喘(26.0(14 - 72)和26.1(6 - 91)海里)。哮喘患者根据治疗比较,我们发现ICS-treated受试者的MDA水平低于未经处理的对象(21.5(6 - 72)和32.0(8 - 91)海里,)。慢性阻塞性肺病患者的MDA水平显著高于哮喘和主题(37.0(8 - 126)和26.3(6 - 91)海里,和19.2(6-54)纳米,、职责)。COPD组内,受试者患有严重慢性阻塞性肺病的MDA水平高于中度COPD患者(39.0(8 - 126)和29.1(9 - 81)海里,分别地。)。
MDA浓度和FEV之间的负相关1都被观察到在整个组患者(ρ:−0.25)和慢性阻塞性肺病组(;ρ:−(图0.24)4)。没有发现差异MDA划分整个组患者根据他们的吸烟状况。分别考虑每个疾病组,我们发现,在COPD患者中,MDA水平在当前吸烟者没有不同于前和非吸烟者,而在哮喘患者中,吸烟者MDA水平高于前和非吸烟者(38.5(19 - 91)和25.5(6 - 72)海里,)。
108年亚组病人诱导痰液分析,没有EBC的MDA水平之间的关系,发现痰炎性细胞计数。然而,患者高(> 64%23])痰中性粒细胞显示MDA水平显著提高比低的患者痰中性粒细胞,即使慢性阻塞性肺病患者只被认为是(图5(一个))。之间没有区别为MDA值被发现高(> 2%23])或低整个组患者痰中嗜酸性粒细胞,但COPD受试者高痰嗜酸性粒细胞降低MDA水平(图5 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
我们发现受试者患有慢性气道疾病EBC的MDA含量增加,从而证实氧化应激在肺部疾病的病理生理学过程中发挥作用。我们还发现,MDA浓度EBC FEV相关1和中性粒细胞炎症,尤其是在慢性阻塞性肺病患者。
MDA是氧化应激的标记,可以测量,使用不同的、有时甚至复杂的分析方法(10,11),在血液、痰、支气管肺泡灌洗液,和EBC。脂质介质,事实上,在体温获得一些波动,因此也成为检测EBC。一些作者MDA显示之间的关系和其他呼吸道疾病的严重程度的标记(24,25)以及它对治疗的影响(26,27),但这些数据并没有被证实由其他人(11]。这种差异可以归因于不同人群研究(考虑到哮喘和慢性阻塞性肺病)的异质性和不同的测量方法。
在我们的经验中,MDA EBC是可再生的,准确的测量:interassay重现性很好,没有不同于其他作者使用不同的报道,更复杂的方法(11]。我们检查存储稳定性EBC样本,仅在几个样本显示良好的重复性;然而,我们分析了所有6个月内收集样品,所显示的国际建议和之前的论文(5,9,11]。
我们的方法区分正常人从不同的呼吸道疾病患者尽管有一些重叠的测量。此外,MDA的变化是敏感引起的治疗干预,降低MDA如图所示的哮喘病患者对ICS与未经治疗的哮喘患者进行比较。这个问题是有争议的文学:尽管一些研究报道减少MDA水平皮质类固醇治疗后(24),其他的研究没有发现区别ICS-treated和未经处理的对象11]。抗氧化治疗普遍报道在修改无效的氧化应激的标记28,29日]。在初步研究中,我们观察到一个温和,显著衰减臭氧感生EBC-MDA增加四周治疗后哮喘患者口服N-acetyl-cysteine [30.]。
COPD受试者显示,EBC MDA的最高价值。这个观察预计,考虑到氧化应激在扮演相关角色烟雾诱发气道损伤和慢性炎症。这证实了MDA的更高层次更高比例的患者痰中性粒细胞,EBC-MDA和FEV之间的负相关1。这些结果与其他报告[协议11),这表明MDA可能是一个好的疾病的严重程度的标志。类似的结果在慢性阻塞性肺病当其他氧化应激的标记被认为是(如8-isoprostane、过氧化氢、LTB4或其他COPD-related细胞因子)(31日- - - - - -33]。之间没有区别观察当前吸烟者和前女友——或者不抽烟的COPD患者,这可能是由于小数量的吸烟者和类似的模式和慢性阻塞性肺病患者的气道炎症程度,无论他们的吸烟习惯34]。
在哮喘患者中,EBC-MDA水平低于观察在COPD患者中,但高于正常人。根据哮喘的严重程度没有差别,但ICS治疗是降低MDA的价值观。有些作者表现出显著降低血中MDA复苏与口服糖皮质激素治疗哮喘恶化[24),其他作者没有发现任何区别ICS-treated和未经治疗的哮喘病人11]。在我们的哮喘患者,吸烟者比不吸烟者表现出更高水平的EBC-MDA;这个观察是一致的突出中性气道炎症在吸烟的哮喘患者35]。
在支气管扩张,我们发现EBC-MDA水平略高于正常人,但低于慢性阻塞性肺病患者。这个结果可能出乎意料,考虑到痰嗜中性是这种病人的一个重要特征。我们没有发现论文评价支气管扩张EBC-MDA水平,和只有一纸报告增加血液中MDA含量在儿童支气管扩张13]。其他标记的氧化应激水平增加(如过氧化氢或pH值)为支气管扩张(EBC已报告36,37]。
在IPF, EBC-MDA水平没有区别是观察与健康受试者相比。在文献中,很少有数据报告显示EBC增加过氧化氢,8-isoprostane和硝酸盐与健康受试者相比(38,39]。EBC-MDA观察到的低水平在我们的研究可以解释大多数IPF患者口服皮质类固醇和/或N-acetyl-cysteine治疗。
5。结论
总之,我们证明了MDA可能准确地测量了EBC大多数慢性肺部疾病患者,这是部分气道阻塞和中性粒细胞炎症的严重程度相关。这在慢性阻塞性肺病患者尤为明显,氧化应激似乎发挥重要作用在疾病的病理生理学。因此,MDA可能是一个有前途的氧化应激的标记哮喘和慢性阻塞性肺病。它的实用性在这些疾病的管理,以及其他炎症标记物,需要探索和精心设计的,具体的研究。
缩写
| EBC: | 呼出的气息凝结 |
| MDA: | 丙二醛 |
| 高效液相色谱法: | 高效液相cromatography |
| 慢性阻塞性肺病: | 慢性阻塞性肺疾病 |
| IPF: | 特发性肺纤维化 |
| 是: | 支气管扩张 |
| FEV1: | 一秒钟用力呼气量 |
| H2O2: | 过氧化氢 |
| 盲肠: | 欧洲共同体对钢铁和煤炭 |
| : | 组内相关系数 |
| 海关: | 食盐水 |
| 是: | 等渗盐水 |
| 德勤: | 二硫苏糖醇 |
| PBS: | 磷酸盐缓冲溶液 |
| 集成电路: | 吸入糖皮质激素 |
| 护士: | 中性粒细胞 |
| 艾凡: | 嗜酸性粒细胞 |
| LTB4: | 白三烯B4。 |
确认
p . l . Paggiaro过去5年收到资金从雅培,阿斯利康,勃林格殷格翰的发言,基耶西制药、葛兰素史克、Menarini, MerckSharp&Dohme,诺奈科明,Valeas教学和研究活动。没有其他作者有任何竞争利益要申报的东西。