文摘

成纤维细胞是重要的宿主防御和免疫力,还可以作为发起人的炎症。作为内生“制动信号”,Lipoxins可以调节抗炎,炎症的决议。我们研究了lipoxinA的效果4在表达cyclooxygenase-2 lipopolysaccharide-stimulated肺成纤维细胞。我们证明cyclooxygenase-2蛋白的表达明显增加,最初在6小时达到高峰,与第二个增加,最大水平发生后24小时内脂多糖的挑战。ProstaglandinE2水平也达到6个小时,prostaglandinD2水平增加6和24小时。外生lipoxinA4抑制第一个峰值cyclooxygenase-2表达式以及prostaglandinE的生产2脂多糖诱导的剂量依赖性的方式。相比之下,外生lipoxinA4第二峰值的增加以及生产prostaglandinD cyclooxygenase-2表达式2脂多糖诱导的剂量依赖性的方式。LipoxinA4受体信使rna表达明显是由脂多糖刺激但lipoxinA所抑制4。我们提供证据小说lipoxinA两相的作用4在表达cyclooxygenase-2 lipopolysaccharide-stimulated肺成纤维细胞,即LXA4有抗炎和proresolving活动在LPS刺激后肺成纤维细胞。

1。介绍

急性肺部炎症反应是一个复杂的反应,但通常是自限性和解决。传统上,免疫效应细胞如淋巴细胞和巨噬细胞被认为是一个基本角色发展的炎症。传统上,成纤维细胞只有被视为一个结构元素。然而,最近的研究表明,肺成纤维细胞,远非仅仅是旁观者的细胞,是重要的宿主防御,但也可能促进肺损伤。最近的证据表明,成纤维细胞可以产生促炎细胞因子和前列腺素(后卫),可以作为发起人的炎症以及监管者的免疫力1- - - - - -3]。当激活时,成纤维细胞能够产生炎症介质,包括interleukin-8(引发)、单核细胞化学引诱物蛋白1,表达cyclooxygenase-2 (cox - 2)与合成释放促炎后卫protaglandinE等2(铂族元素2)[3]。此外,可以直接激活成纤维细胞暴露在脂多糖(LPS) [4]。革兰氏阴性细菌可以负责早期治疗的失败和肺炎患者的发病率和死亡率明显增加(5,6]。有限合伙人,革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,是公认的先天免疫系统的细胞,如居民组织成纤维细胞(7]。具体来说,人数受体表达在这些成纤维细胞可以直接损伤组织的反应促进炎症的决议。

环氧酶是一种关键酶,催化转换arachidonicacid前列腺素(8]。有两个环氧酶亚型,COX-1和cox - 2。COX-1产生持续在大多数的细胞类型,而cox - 2诱导[8]。由花生四烯酸合成前列腺素是脂质介质由考克斯的行动酶(9]。他们可以通过居民纤维母细胞,分泌以及炎症细胞,以应对TNF -α,il - 1β或有限合伙人(10,11]。前列腺素也导致炎症的症状和体征12]。ProstaglandinE2主要PG期间产生的炎症反应,炎症的促炎脂质介质和参与启动炎症13]。先前的研究表明PGD2proresolution中介,还积极有助于解决组织损伤和炎症(14]。

Lipoxins (lx) trihydroxytetraene-containing类花生酸主要通过transcellular形成生物合成涉及5 -和15-lipoxygenases (lox)或5 -和12-lipoxygenases (lox)以及cox - 2在呼吸道组织(15,16]。Lipoxins是第一个proresolving介质识别;他们不仅有消炎作用,而且促进炎症的决议(17]。Lipoxins已经被描述为内生炎症(“制动信号”18- - - - - -20.]。Lipoxins被广泛研究哮喘(21,22),囊性纤维化23- - - - - -25),和在各种感染。这些研究强调了lx小说作为潜在代理治疗炎症性疾病的治疗。

最近的一项研究报道,支气管上皮细胞调节lipoxinA受伤4(LXA4)受体(LXA4R) COX-2-dependent的方式促进LXA4调解解决气道炎症(26]。对酸损伤,上皮细胞迅速增加cox - 2和铂族元素2表达式[26]。cox - 2酶也被牵连的肺纤维化的重要中介,cox - 2−−/老鼠有增加肺纤维化反应(27]。最近,Medeiros LXA等人报道4也抑制cox - 2的表达和活动endotoxin-induced葡萄膜炎(EIU)在大鼠28]。此外,LXA4也已被证明能够抑制结缔组织生长因子(CTGF)——刺激增殖的人类肺成纤维细胞(25),而成纤维细胞直接模拟LPS能够生产cox - 2和铂族元素2(3,4]。然而,cox - 2的表达在肺成纤维细胞刺激由有限合伙人和LXA的效果4cox - 2表达的铂族元素2和PGD2尚不清楚。

在这项研究中,我们检测cox - 2的表达和铂族元素的生产2和PGD2肺成纤维细胞在有限合伙人的挑战。此外,我们还研究了LXA的效果4cox - 2的表达和铂族元素的生产2和PGD2。最后,我们研究了LXA的效果4或有限合伙人LXA4R mRNA表达肺成纤维细胞;我们提供证据小说LXA两相的作用4在LPS-stimulated肺成纤维细胞cox - 2的表达。

2。材料和方法

2.1。材料

LipoxinA4从开曼群岛化工公司,是储存在−80°C,直到在无血清培养基稀释立即使用前。脂多糖(LPS);055年e .线圈血清型:从σB5)购买。DMEM, FCS、胰蛋白酶EDTA和enzyme-free细胞分离缓冲Gibco买来。青霉素和链霉素柠檬酸盐缓冲来自表达载体。赫斯特33258年从罗福斯获得。从Abcam Anti-CD31, anti-Vimentin和anti-COX-2购买。从圣克鲁斯Anti-Cytokeratin-8和anti-F4/80购买。

2.2。细胞培养

大鼠肺成纤维细胞分离从Sprague-Dawley老鼠如前所述29日]。肺组织被切割成< 1毫米3件和分离汉克斯缓冲盐溶液(hbs)含0.25%胰蛋白酶在37°C 1.5分钟。胰蛋白酶抑制了与15%胎牛血清的DMEM (FCS)和分离组织在1000 g离心5分钟4°C。分离组织块被放置与DMEM培养板含有15% FCS,允许纤维母细胞产物。在成纤维细胞从组织生长,通常2 - 3天,其余的组织是被渴望,细胞被允许达到融合。汇合的成纤维细胞然后通过分流比为1:2×胰蛋白酶处理和用于实验在章节3 - 5。纤维母细胞的纯度文化始终在99%以上为建立典型轴形状和形态的特征和成纤维细胞标记波形蛋白的表达和消极的表达内皮(CD31)、巨噬细胞(F4/80)和上皮细胞(cytokeratin-8)标记。

所有实验,细胞被亚文化six-well板块和维护直到subconfluence(80%)、融合性的细胞(100%)与low-serum剥夺了24小时血清培养基(DMEM补充0.1% FCS)之前的有限合伙人和/或LXA4。细胞培养与有限合伙人(1μg / mL) 6、12、24、48和72小时。对于LXA4实验中,细胞被low-serum介质包含1中孵化μg / ml有限合伙人在100年的存在与否,200,或400 nmol /毫升LXA46、24小时。

2.3。苏木精和伊红染色())

成纤维细胞生长在文化上盖玻片和4%多聚甲醛固定在PBS 10分钟,与苏木精染色(英国Lutterworth BDH) 10分钟,孵化在斯科特的自来水(自来水几滴1 M氢氧化钠)5分钟和沾酒精曙红的解决方案5分钟。他们被沉浸在自来水洗2分钟后每一步。细胞被分化沉浸在0.1%盐酸acid-ethanol每30年代和安装通过反演到玻片点缀着凝胶/挂载。图像是由一个倒置显微镜(IX70,奥林巴斯美国,Inc .,梅尔维尔,纽约,美国)1.40 na 60×目标集。图像大小是 。

2.4。间接免疫荧光法

成纤维细胞增长到大约70%融合在poly-D-lysine-coated玻璃盖玻片24-well盘子,4%多聚甲醛固定在PBS 10分钟,用PBS冲洗三次,permeabilized 0.2% Triton x - 100 / PBS 2分钟后0.5% Triton x - 100(皮尔斯)PBS 10分钟。非特异性结合的抗体预防5%的牛血清白蛋白在PBS 30分钟37°C。样品在4°C在一夜之间被孵化antivimentin (1: 100), anti-CD31 (1: 100), anti-F4/80(1: 100)或anti-Cytokeratin-8(1: 200)在2% BSA / PBS。3 PBS洗后,细胞培养2小时fluorescein-conjugated immunopure山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)或山羊antirabbit免疫球蛋白(H + L)(1: 200)分别在室温下5% BSA / PBS。与PBS洗涤三次后,细胞核被柜台沾染了赫斯特(1:1000)15分钟,其次是三PBS洗涤。细胞被倒置安装/挂载玻片上点缀着凝胶。图像是由一个倒置显微镜(IX70,奥林巴斯美国,Inc .,梅尔维尔,纽约)1.40 na 60×客观和FITC,罗丹明和Cy5过滤集。图像大小是 。

2.5。铂族元素2和PGD2蛋白表达

纤维母细胞收集上层清液治疗后,离心机(1500克,5分钟)整除,储存在−80°C。铂族元素2和PGD2蛋白质expressionwas衡量ELISA根据制造商的指示(研发系统)。化验运行一式三份,重复两次。

2.6。cox - 2蛋白表达

成纤维细胞是细胞溶解和均质在200年μL冷裂解缓冲(Triton x - 100年150毫米氯化钠,1%,1%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 50更易与L Tris-HCl (pH值7.2),0.2毫米钒酸钠、1%氟化phenylmethylsulfonyl,和0.2%抑肽酶)。样本在冰上孵化20分钟然后在12000转离心10分钟。上层清液的蛋白浓度测定用BCA蛋白质化验(皮尔斯)。蛋白质在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离和转移到硝化纤维膜。cox - 2的表达决心使用主要兔子anti-COX-2抗体(1:750)和二次辣根peroxidase-conjugated山羊antirabbit免疫球蛋白。蛋白的表达β肌动蛋白作为加载控制。增强化学发光的抗体检测x射线胶片。

2.7。RNA分离、逆转录PCR

总RNA提取使用试剂盒试剂(技术)其次是phenol-chloroform提取和乙醇沉淀(费舍尔科学)。RNA纯度被分光光度法检查,证实了和RNA完整的可视化28日和18年代乐队琼脂糖凝胶。1μ克使用禽成髓细胞瘤病毒反转录RNA逆转录酶(Promega)。使用以下套引物PCR分析:老鼠LXA4受体5′-TGTTGGGCCCTGGATTTTAGC-3′(意义)和5′-TGTTACCCCAGGATGCGAAGTT-3′(反义),放大116 bp的片段(30.),对β肌动蛋白,作为内部控制5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′(意义)和5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′(反义),生成一个281 - bp片段。老鼠LXA PCR4受体由35重复周期在95°C predenaturing 4分钟,在94°C变性30秒,退火在40秒59°C,在72°C扩展40秒,最后一个在72°C扩展了5分钟。对于r-actin使用56°C的退火温度。放大cDNA 1.6%琼脂糖凝胶上分离,并使用溴化乙锭可视化。半定量的分析使用UVP-gel微(美国加利福尼亚州SanGabriel)。

3所示。结果

3.1。原代肺成纤维细胞的纯化和鉴定

未经处理的纤维母细胞与苏木精和伊红染色了传统光学显微镜下形态评价(尼康eclipse 90 i,东京,日本)(图1(一)indirectimmunofluorescence)或彩色的波形蛋白、CD31 Cytokeratin-8和F4/80表情(图1 (b))。成纤维细胞波形蛋白作为标志,CD31的标记内皮细胞(31日),F4/80巨噬细胞的表面标记(32,33),Cytokeratin-8上皮细胞的标记(34]。我们只观察到细胞与成纤维细胞形态学染色波形蛋白,因此,只有纯化成纤维细胞培养。

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图1
原代肺成纤维细胞的纯化和鉴定。(一)未经处理的成纤维细胞与大鼠肺隔离与苏木精和伊红染色光显微镜下传统的形态学评价(尼康eclipse 90 i,东京,日本)。主文化(A1),还包含一些non-fibroblasts细胞。通过3 (A2),纤维母细胞纯度一直超过99%,建立典型形态的纺锤体的形状和特征。(b)文化被间接免疫荧光染色分析波形蛋白、CD31, cytokeratin-8或F4/80。文化只包含波形蛋白阳性细胞的成纤维细胞的说明。
3.2。有限合伙人对cox - 2的影响,铂族元素2和PGD2肺成纤维细胞中表达

确定的动态表达cox - 2在大鼠肺成纤维细胞,我们孤立成纤维细胞与有限合伙人(1孵化μg / mL) 6、12、24、48和72小时。cox - 2蛋白的表达明显增加,最初LPS刺激后6小时达到高峰,与最大水平(图24小时发生2(一个))。相比之下,铂族元素2只在6小时(图水平增加2 (b)),与前列腺素的前体J系列,PGD2(35),水平增加6和24小时。(图2 (c))。

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图2
有限合伙人对cox - 2的影响,铂族元素2,PGD2肺成纤维细胞表达。(一)大鼠肺成纤维细胞与有限合伙人(1孵化μg / mL) 6、12、24、48和72小时。cox - 2蛋白的表达是通过免疫印迹分析评估微相比β肌动蛋白的表达。cox - 2表达最初在6小时达到高峰,然后在24小时内与最大水平after-LPS治疗(* 与non-LPS集团# 对12、48、72小时组)。(b)上层清液收集在有限合伙人(1μg / mL)治疗6、12、24、48和72小时。铂族元素2蛋白质是由ELISA测定。数据表示为每组均值±SE。(* 与non-LPS组;& 与12、24、48和72小时组;# 与6、24、48、72小时组)。(c):上层清液收集在有限合伙人(1μg / mL)治疗6、12、24、48和72小时。PGD2蛋白质是由ELISA测定。数据表示为每组均值±SE。(* 与non-LPS组;# 对12、48、72小时组)。
3.3。LXA的影响4LPS-Induced表达cox - 2蛋白表达和铂族元素2,PGD2主要生产6小时肺成纤维细胞

确定外生LXA4调节cox - 2表达LPS刺激后,我们重新评估cox - 2蛋白与不同浓度的LXA 6小时4在我们孤立肺成纤维细胞治疗。使用LXA4在100、200、或400 nmol /毫升我们观察到剂量依赖性地抑制cox - 2蛋白表达(图3(一个))。此外,细胞与LXA孵化46小时,铂族元素2和PGD2上层清液中蛋白质含量测定ELISA(图3 (b)和3 (c)、职责)。铂族元素2分泌被LXA抑制4剂量依赖性的方式,减少 在0纳米LXA pg / mL4细胞治疗 在100 nM LXA pg / mL4处理过的纤维母细胞,然后进一步 在400 nM LXA pg / mL4对成纤维细胞( )。相比之下虽然PGD2与LXA水平,增加4疗程,这不是观察到剂量依赖。

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图3
LXA的影响4LPS-induced表达cox - 2蛋白表达和铂族元素2和PGD2主要生产6小时肺成纤维细胞。(一)大鼠肺成纤维细胞与LXA治疗4在0、100、200或400海里的有限合伙人(1μg / mL) 6小时。细胞被收获,用和cox - 2蛋白免疫印迹检测。* 相对于对照组,# 与LXA(100、200或400海里)4组织;& 而LXA(200或400海里)4组。(b)上层清液的大鼠肺成纤维细胞LXA对待4在0,100,200,或400海里的有限合伙人(1μg / mL) 6小时收集和铂族元素2蛋白质以ELISA。数据表示为每组均值±SE。* 相对于对照组,# 与LXA(100、200、或400海里)4组织;& 而LXA(200或400海里)4组。从大鼠肺成纤维细胞(c)上层清液LXA对待4在0、100、200或400海里的有限合伙人(1μg / mL) 6小时收集和PGD2蛋白质以ELISA。数据表示为每组均值±SE。* 与对照组。
3.4。LXA的影响4LPS-Induced表达cox - 2蛋白表达和铂族元素2和PGD2主要生产24小时肺成纤维细胞

与外生LXA决定治疗4cox - 2表达的影响二级增加LPS刺激后,我们也重新cox - 2蛋白在不同浓度的lipoxinA4治疗后24小时。使用LXA4在100、200、或400 nmol /毫升,我们观察cox - 2蛋白表达增加剂量依赖性的方式(图4(一))。我们还措施分泌铂族元素2和PGD2有限合伙人和LXA之后4治疗(图4 (b)和4 (c)、职责)。有趣的是,与我们的结果在6人力资源有限合伙人治疗虽然铂族元素的含量2增加与LXA4,不存在剂量依赖的相关性。此外,PGD2这种治疗后分泌物政权被LXA增强4剂量依赖性的方式,增加 在0纳米LXA pg / mL4处理细胞 100海里LXA后pg / mL4对成纤维细胞和 在400 nM LXA pg / mL4对成纤维细胞( )。

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图4
LXA的影响4LPS-induced表达cox - 2蛋白表达和铂族元素2和PGD2主要生产24小时肺成纤维细胞。(一)大鼠肺成纤维细胞与LXA治疗4在0,100,200,或400海里的有限合伙人(1μg / mL)为24小时。细胞被收获,用和cox - 2蛋白免疫印迹检测。* 相对于对照组,# 与non-LXA4组织;& 而LXA(100或200海里)4组。(b)上层清液的大鼠肺成纤维细胞LXA对待4在0,100,200,或400海里的有限合伙人(1μg / mL) 24小时收集和铂族元素2蛋白质以ELISA。数据表达的意思 为每个组。* 与对照组。从大鼠肺成纤维细胞(c)上层清液LXA对待4在0、100、200或400海里的有限合伙人(1μg / mL) 24小时收集和PGD2蛋白质以ELISA。数据表示为每组均值±SE。* 相对于对照组,# 与LXA(0, 100或200海里)4组。
3.5。LipoxinA4在大鼠肺成纤维细胞和调节受体表达有限合伙人

LipoxinA4与其受体相互作用,LXA4R,扮演了一个重要的角色在调节白细胞功能(36]。因此,我们测试了是否LXA4R mRNA表达改变有限合伙人和LXA之后4使用半定量rt - pcr治疗大鼠肺成纤维细胞。一个乐队LXA对应4R mRNA表达(图放大5巷1),当分析微被LPS处理(图明显刺激5巷2)。有趣的是,我们观察到cotreatment有限合伙人和LXA4减少表达LXA4R,在未经处理的控制(图5,莱茵3)。


图5
LipoxinA4在大鼠肺成纤维细胞和调节受体表达有限合伙人。大鼠肺成纤维细胞治疗与有限合伙人(1μg / mL) LXA的存在与否424小时(100海里)。信使rna是孤立和semiquantiative LXA rt - pcr4R和β肌动蛋白进行。放大cDNA被1.6%琼脂糖凝胶电泳分离,可视化与ethidium bromidem凝胶微相对于和分析β肌动蛋白的表达。巷1:未经处理的控制。只巷2:有限合伙人(1μg / mL)。巷3:有限合伙人(1μg / mL)和LXA4(100海里)。* 相对于对照组,# 而LXA(100海里)4组。这些数据代表6个人实验重复。

4所示。讨论

急性肺损伤(ALI) / ARDS是一种炎症性肺部疾病与高死亡率(36- - - - - -39]。今天治疗炎症性疾病在很大程度上是基于中断的合成或操作介质也减少主机的能力成功地处理感染,由于天生的炎症反应是一个有益的防御性事件(40]。最近,解决急性炎症表现的积极,而不是一个被动的过程,而内源性化学介质扮演关键角色的设定分辨率和恢复体内平衡(41]。其中,lipoxins和aspirin-triggered lipoxins唤起bioactions在一系列的生理和病理生理的过程和作为内源性脂质/化学介质停止中性粒细胞浸润和发起的决议17]。发展战略,促进炎症的决议是一种新型的治疗措施,以减弱炎性肺损伤。

在先前的研究中,我们清楚地表明,与lipoxinA后处理4(LXA4老鼠)大大降低LPS -诱导ALI (42]。Lipoxin也促进逐步解决在肺纤维化43]。此外,LXA4压抑的表达和cox - 2的活性在老鼠endotoxin-induced葡萄膜炎(28]。在老鼠carrageenin-induced胸膜炎,cox - 2蛋白表达最初在2小时达到高峰,在48小时内,有一个第二cox - 2表达增加炎症细胞与炎性渗出液分离(44]。从这些数据来看,我们的目的是找出是否刺激肺成纤维细胞cox - 2表达有限合伙人也有两个高峰,如果是这样,如何LXA4影响cox - 2的表达和前列腺素的生产,特别是铂族元素2和PGD2。

我们的数据清楚地表明cox - 2蛋白的表达明显增加,达到最初6个小时在LPS刺激后肺成纤维细胞。这也是最大的铂族元素2合成,然而,24小时LPS刺激后,有第二个cox - 2表达的增加,这一次与最大PGD有关2合成。因此,随着炎症的发展成决议,铂族元素2合成下降,给COX-2-derived PGD的重要性2扮演重要角色,这两个调解解决。这些数据表明,cox - 2可能是促炎(通过铂族元素2表达式)的开发过程中炎症,但抗炎(通过PGD2表达式)决议中肺成纤维细胞。最近的研究也强调了角色COX-2-derived后卫提供抗炎和anti-fibrotic角色在炎症的决议13,45,46]。模型的自发解决阿里,选择性cox - 2抑制导致长期的炎症,在一定程度上,减少生产pro-resolving介质,包括LXA4和15-epimer-LXA4(44,45]。较晚,cox - 2的抗炎效应,而不是更广泛的赞赏,促炎作用,从阿里及时复苏至关重要45]。

我们的研究结果还表明,cox - 2的表达以及铂族元素2生产成纤维细胞被LXA显著抑制4剂量依赖性的方式有限合伙人长达治疗,这表明LXA4具有潜在的抗炎作用肺成纤维细胞在炎症的发病。与我们的研究结果一致,表明LXA相似的结果4也被压抑的表达和cox - 2的活性在老鼠endotoxin-induced葡萄膜炎(28]。有趣的是,成纤维细胞cox - 2的表达的第二次增加(24小时)被LXA显著提升4剂量依赖性的方式。此外,与上面的结果一致,LXA4抑制了铂族元素的生产2同时促进了PGD的生产2在上层清液。因此,我们的研究表明小说中两相的作用的LXA4cox - 2的表达和铂族元素的生产2和PGD2,这表明LXA4有一个潜在的抗炎和proresolving角色LPS-stimulated肺成纤维细胞。

在炎症(内生“制动信号”18- - - - - -20.),lipoxins在当地的肺调节炎症细胞。此外,LXA的特定受体具有高亲和力4(LXA4R)已经从骨髓血统(克隆15,16]。表达LXA4R是需要唤起lipoxins在每个组织的行为因此,受体表达也可以控制lipoxins的生物功能在活的有机体内。LXA4R受体属于g蛋白耦合总科的蛋白质,广泛分布在细胞和组织15]。我们的研究结果首次表明LXA4R mRNA表达在LPS刺激大鼠肺成纤维细胞,调节。此外,可能由于负面的反馈机制,LXA4R信使rna被cotreatment抑制LPS和LXA4。

总之,本研究表明,cox - 2蛋白表达高峰最初在6小时但也在LPS刺激后24小时隔离肺成纤维细胞。此外,LXA4有一个小说中两相的作用cox - 2的表达和铂族元素的生产2和PGD2,LXA4有抗炎和proresolving活动在LPS刺激后肺成纤维细胞。因此,我们的研究可能为未来的治疗提供一种新颖的目标控制LPS-induced阿里。

缩写

有限合伙人: 脂多糖
cox - 2: Cyclooxygenase-2
铂族元素2: ProstaglandinE2
PGD2: ProstaglandinD2
后卫: 前列腺素
LXA4: LipoxinA4
LXA4接待员: LipoxinA4受体。

承认

这项工作是由浙江省高级创新卫生人才的培养和支持的资助来自中国国家自然科学基金(没有。30772088,不。81070061)。