文摘

中性粒细胞活动是长期在新生儿,建议减少暴露和/或免疫抑制反应调节器,如1中,人体内25 -羟维生素D₃(1、25-vit D₃)。我们假设1,25-vit D₃抑制中性粒细胞的激活,这反应在新生儿受损。与此一致的是,1,25-vit D₃巨噬细胞炎性蛋白1的LPS-induced表达下降β和VEGF在成人,但不是新生儿中性粒细胞。表达式的维生素D受体(VDR),人体内25 -羟维生素D₃1α羟化酶在新生儿减少,相对于成人的中性粒细胞。此外,1,25-vit D₃诱导VDR基因表达激活成人,但不是新生儿中性粒细胞。1,25-vit D₃也抑制表达cyclooxygenase-2 5-lipoxygenase LPS-exposed成人中性粒细胞和诱导表达,而新生儿细胞没有影响。1,25-vit D₃没有影响呼吸在成人或新生儿细胞破裂。抗炎活性维生素D在新生儿中性粒细胞受损,这可能是由于VDR和1的表达下降α羟化酶。不敏感,25-vit D₃在新生儿可能导致慢性炎症。

1。介绍

有一个新生儿维生素D不足的发生率高,尤其是那些完全母乳喂养(1]。在肝脏接受25-hydroxylation后,人体内25 -羟维生素D₃是转换,通过人体内25 -羟维生素D₃1α羟化酶(1α羟化酶)的活性形式1,25-vit D₃在许多细胞类型。1的生物效应,25-vit D₃主要是通过核转录因子介导,维生素D受体(VDR),触发维生素D-responsive基因的表达。而维生素D,钙和磷酸盐体内平衡的重要性是众所周知的,最近的研究表明,维生素D“模”效应,包括下调免疫反应的一个重要的角色。VDR和1α羟化酶表达单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞、粒细胞,建议1,25-vit D₃在分化过程中发挥作用,生物合成的活动,和白细胞的功能2,3]。

循环中性粒细胞先天免疫的主要效应细胞,但有助于病理如果他们的活动是延长(4,5]。解决中性粒细胞炎症反应的差别是一个活跃的过程涉及对这些促炎细胞因子,upregulation抗炎类花生酸,减少生成活性氧中间体,和删除的细胞(6]。在这方面,我们曾表明,间隙的中性粒细胞凋亡受损在新生儿与成人相比7]。长期生存能力的新生儿中性粒细胞被认为在慢性炎症疾病中发挥作用,因为这些细胞释放氧自由基,水解酶和炎性细胞因子。这可能导致细胞毒性,导致新生儿neutrophil-mediated炎性疾病的高发病率。

先前的研究表明,维生素D会使中性粒细胞功能(8]。在这些研究中,我们调查了假设1,25-vit D₃减少生产在中性粒细胞炎症介质和活性氧中间体,此活动是新生儿中性粒细胞中受损。我们进一步假设减少反应新生儿可能与VDR和1的表达下降α羟化酶在新生儿中性粒细胞。不良反应为1,25-vit D₃可能导致长期生存和活动的这些细胞,导致慢性炎性疾病的易感性增加。

2。材料和方法

2.1。试剂

核糖核酸纯化试剂盒购自试剂盒(就是,CA)。了rt - pcr引物获得DNA技术集成(珊瑚镇,IA)。试剂的rt - pcr是应用生物系统公司(CA)福斯特城。Amplex红色和辣根过氧化物酶分子探针(CA)卡尔斯巴德,DMEM和右旋糖酐西格玛化工有限公司(密苏里州圣路易斯和Ficoll-paque通用电气医疗集团(皮斯卡塔韦,NJ)。7-actinomycin D (7-AAD)和仪珠阵列flex集来自BD生物科学(CA)圣何塞。1,25-vit D₃是来自恩佐生命科学(普利茅斯会议上,PA)和可溶性股票浓度的乙醇10⁻⁴10 m的最终浓度⁻⁷在细胞培养是基于估计的组织浓度和先前的研究表明生物效应在这个浓度(8]。

2.2。主题和嗜中性粒细胞隔离

研究机构审查委员会批准的罗伯特。伍德。约翰逊医学院和知情同意从主题。学期脐带血液从胎盘获得婴儿(≥怀孕37周,没有劳动)由剖腹产。外周静脉血液收集从健康成人()是用于比较。新生儿和成人样本实际上使用肝素和立即并行处理。受试者的临床证据排除感染、免疫缺陷、糖尿病、妊娠高血压、接触烟草或影响免疫功能的药物。虽然受试者还被排除在外如果有近代历史的维生素D中毒(由于不寻常的膳食补充剂)或不足(次要诊断新生儿低钙血症),满足这些标准没有潜在的话题。同等数量的成人和新生儿同时样本收集和统一在一个单一的,以减少任何潜在的季节性影响。中性粒细胞被葡聚糖沉积和聚蔗糖梯度离心分离,与锥虫染色证实了可行性和纯度> 95%。在初步实验中,1,25-vit D₃并不影响中性粒细胞可行性或凋亡,由流仪测量propidium碘或膜联蛋白V绑定,分别。

2.3。信使rna表达的分析

中性粒细胞是孵化控制介质(胎牛血清的DMEM + 10%),细菌脂多糖(LPS, 1g / mL),和/或1,25-vit D₃(10⁻⁷米)为4小时。有限合伙人作为炎症刺激,因为不同CD14 / TLR4-mediated反应在中性粒细胞。RNA被隔离使用RNeasy Minikit(试剂盒)和互补脱氧核糖核酸合成使用逆转录工具包(应用生物系统公司,培育城市,CA)。实时PCR进行使用SYBR绿色PCR大师混合和放大ABI棱镜7900序列检测系统,利用GAPDH作为标准。全长编码序列的基因进行分析从基因库中获得。使用底漆表达引物设计软件和DNA合成了集成技术(珊瑚镇,IA)。以下引物被使用:VDR: 5′太极拳CTG柠檬酸CCA AGC柠檬酸CA-3′;5′caa CCA ACC有条件现金转移支付标签ACC CAG-3′;1α羟化酶:5′aga猫CCC gg CCC CTC TA-3′;a - 3′5′ttg CAG AAA AGT TCG GCC。5-lipoxygenase (5-LOX): 5′gg GAG亚美大陆煤层气有限公司CTG GAG条t - 3′移行细胞癌;5′gca GAG GCC GTG亚美大陆煤层气有限公司ATC AC-3′;cyclooxygenase-2 (cox - 2): 5′gcc TGA TGA TTG CCC广汽条t - 3′;5′gct GGC有条件现金转移支付公司治理文化TTA TGA TCT-3′。

2.4。炎症的蛋白质

中性粒细胞是孵化控制介质(胎牛血清的DMEM + 10%),有限合伙人(1g / mL),和/或1,25-vit D₃(10⁻⁷米)24小时。文化上层清液与预拌flex孵化组珠子涂上了巨噬细胞炎性蛋白1抗体β(MIP-1β),引发血管内皮生长因子(VEGF)和il - 1β在96 -过滤板。预拌phycoerythrin-labeled检测试剂被添加到井和2小时在黑暗中孵化。分析了bead-protein复合物荧光强度使用BD FACSArray生物分析仪。数据分析使用BD FCAP软件(2.0 v)。

2.5。过氧化氢的测量(H₂O₂)生产

中性粒细胞是镀在96 -菜(5×10⁴细胞/)。反应混合物(50包含Amplex红(25 L)1.07 M)和辣根过氧化物酶(U /毫升)被添加到每个好,其次是炎症刺激,佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA 500海里),1,25-vit D₃(10⁻⁷米),1,25-vit-D₃+ PMA,或媒介控制。荧光产品形成,表明H₂O₂每隔1分钟,测量spectrophotometrically 30分钟在540 nm兴奋和590海里排放珀金埃尔默高温超导7000生物测定的读者9]。

2.6。数据分析

细胞因子水平的比较和mRNA表达在新生儿和成人使用Wald-Wolfowitz运行执行测试。为了治疗在同一对象的值进行比较,分析相关措施计算使用Wilcoxon配对测试。比较多个依赖样本来自重复措施H₂O₂水平随着时间的推移(0、10、20和30分钟),我们进行了弗里德曼方差分析。这些分析为每一个新生儿和成人治疗条件。试比较治疗PMA和PMA + 1, 25-vit D3在指定的时间点进行使用Wilcoxon配对测试。H₂O₂一代新生儿和成人相比中性粒细胞是使用Mann-Whitney U测试。

3所示。结果与讨论

为了模型bacterial-induced组织炎症,我们分析了LPS-treated成人的反应和新生儿中性粒细胞,25-vit D₃。在最初的研究中,我们比较的影响1、25-vit-D₃、有限合伙人和有限合伙人+ 1,25-vit D₃在mRNA维生素D代谢和炎症相关基因的表达。本构的mRNA表达VDR, 1 -α羟化酶、5-LOX和cox - 2在新生儿减少,与成人相比,中性粒细胞(图1)。1,25-vit D₃单独或有限合伙人不明显影响这些基因的表达在成人或新生儿细胞,治疗有限合伙人+ 1,25-vit D₃与显著诱导VDR成年细胞相比单独控制或有限合伙人。1 -α羟化酶表达也增加在成年细胞暴露在有限合伙人+ 1,25-vit D₃。相比之下,有限合伙人+ 1,25-vit D₃不影响表达式的VDR或1 -α羟化酶在新生儿中性粒细胞。此外,1,25-vit D₃诱导5-LOX LPS-treated成年细胞抑制cox - 2基因表达,而新生儿细胞没有影响。

在进一步的研究中,我们比较的影响1、25-vit D₃、有限合伙人和有限合伙人+ 1,25-vit D₃生产的成人和新生儿中性粒细胞炎性细胞因子和蛋白质。本构生产MIP-1β、引发、VEGF、il - 1β类似于成人和新生儿中性粒细胞(图2)。LPS诱导MIP-1的生产β、引发和il - 1β成人细胞,而新生儿细胞没有影响。在成人的中性粒细胞,有限合伙人+ 1,25-vit D₃显著抑制MIP-1的一代β独自和VEGF相比,有限合伙人,有一个下降的趋势引发的生产。相比之下,1,25-vit D₃没有明显影响生产这些炎症蛋白质LPS-treated新生儿中性粒细胞。

我们下一个1的影响相比,25-vit D₃生产的H₂O₂在成人和新生儿中性粒细胞。激活中性粒细胞分泌活性氧中间体对炎症介质的网站感染或组织损伤。在缺乏刺激,新生儿和成人细胞生成的数量可发觉的基底的H₂O₂(图3)。与之前的研究一致,生产的H₂O₂从新生儿中性粒细胞在激活中性粒细胞减少,相比成人(10]。1,25-vit D₃独自一人并不影响H₂O₂生产在成人或新生儿细胞。炎症刺激、PMA诱导呼吸爆发活动在新生儿和成人细胞,但这种反应是那么健壮的新生细胞。1,25-vit D₃没有显著影响PMA-stimulated H₂O₂一代成年或新生儿中性粒细胞。

在这些研究中,我们表明,1,25-vit D₃减少特定在成熟的中性粒细胞炎症反应,这是新生儿中受损的细胞。先前发现的维生素D对中性粒细胞的影响不一致。例如,维生素D的诱导表达人类抗菌肽抗菌肽18 (11),维生素D缺乏降低TLR-induced抗菌肽表达单核细胞(12]。因此,维生素D似乎发挥重要作用在先天免疫反应的完整性。然而,维生素D也降低il - 1的生产β在中性粒细胞(8,越来越多的证据表明,维生素D可以触发炎症反应的分辨率。1,25-vit D₃抑制分化、增殖和T淋巴细胞,诱导合成活动耐受性树突状细胞状态,这表明它抑制适应性免疫13,14]。1,25-vit D₃可能促进单核细胞和巨噬细胞的分化和综合活动15,16),它也减少核扩散和白介素2生产和抑制白介素下调NF -的生产κB激活这些细胞(17,18]。它还会使toll样受体- (TLR) 2和地表达在人类单核细胞(19]。我们发现1,25-vit D₃中性粒细胞减少活动支持维生素D扮演一个生理免疫反应的抑制作用。

新生儿是为开发neutrophil-mediated炎性疾病风险特别高,表明存在发育缺陷信号通路调节中性粒细胞活性和诱导他们由巨噬细胞间隙。符合这个想法,我们实验室曾表明在中性粒细胞凋亡受损新生儿与成人相比(7]。在这些研究中,我们已经表明,响应性维生素D是在新生儿中性粒细胞也受损。这可能导致长期生存和活动的这些细胞,可能导致慢性炎性疾病继发于活性氧和炎性细胞因子的释放。响应性下降可能是由于降低了船舶的表情。我们发现成年中性粒细胞表达VDR 1, 25-vit D₃诱发VDR表达有限合伙人的存在。诱导VDR 1, 25-vit D₃之前和有限合伙人也被观察到在人类单核细胞的细胞系(20.]。相比之下,新生儿表达显著降低水平的船舶,这并不影响维生素D和有限合伙人。我们还发现,表达式1α羟化酶在新生儿中性粒细胞明显减少,与成年人相比。1α羟化酶的生成需要1,25-vit D₃生物活性形式,触发绑定响应元素在维生素D响应基因的启动子区域。减少这种酶的表达表明,维生素D的激活可能受损的新生儿白细胞。此外,1,25-vit D₃诱导5-LOX LPS-treated成人中性粒细胞抑制cox - 2基因表达,而新生儿细胞没有影响。5-LOX催化lipoxins等抗炎类花生酸的生成,而cox - 2产生炎症的影响通过前列腺素的合成21]。从一代的pro -抗炎类花生酸被认为扮演一个关键的角色在信号的分辨率中性粒细胞活性(22]。受损的变化的比率5-LOX / cox - 2基因表达,以应对在新生儿维生素D可能导致长期的炎症。

以前的体外和体内在人类身上的研究表明,维生素D与降低炎性细胞因子的生产(8,23]。据我们所知,这是第一个研究测量细胞因子反应新生儿中性粒细胞的维生素D。我们发现,维生素D抑制LPS-induced MIP-1的生产β和VEGF在成人细胞,这些介质的生产没有影响新生儿的细胞。这是我们发现的表达符合VDR在新生儿中性粒细胞受损。综上所述,这些数据表明,新生儿中性粒细胞减少能力合成1,25-vit D₃和减少响应其免疫抑制作用。

令人惊讶的是,维生素D没有减少基底或PMA-induced代过氧化氢在成人或新生儿中性粒细胞。与此一致的是,先前的调查报告说,维生素D恢复趋化作用和吞噬作用的维生素D缺乏的老鼠24在人类细胞中,能促进细菌杀死25]。其他人也表明,维生素D的诱导表达膜和胞质成分NADPH-oxidase monocyte-like细胞系(26]。维生素D的影响呼吸爆发活动很可能依赖于剂量和端点的细节,这将在进一步的研究调查。

4所示。结论

我们发现1,25-vit D₃巨噬细胞炎性蛋白1的LPS-induced表达下降β和VEGF在成人,但不是新生儿中性粒细胞。我们的研究表明,新生儿可能对维生素D在中性粒细胞炎症的调节作用,这可能是由于VDR和1的表达下降α羟化酶。减少响应在新生儿维生素D可能复合维生素D缺乏的影响,目前被认为是一个重要的公共卫生问题。维生素D状况的调查揭示了高发病率的不足在母亲和婴儿26),美国儿科学会最近发布了建议增加饮食补充维生素D在新生儿(27]。理解的免疫调节作用在细胞水平上新生儿维生素D可能加强努力,充分解决这一公共卫生挑战,使用治疗等策略的补充或合成VDR受体激动剂治疗的水平。

缩写

1α羟化酶:	人体内25 -羟维生素D31α羟化酶
cox - 2:	Cyclooxygenase-2
5-LOX:	5-lipoxygenase
有限合伙人:	细菌脂多糖
MIP-1β:	巨噬细胞炎性蛋白1β
PMA:	佛波醇12-myristate 13-acetate
VEGF:	血管内皮生长因子
论述:	维生素D受体
1,25-vit D3:	1,25-dihydroxycholecalciferol。

金融支持

由美国国立卫生研究院拨款HD058019 ES005022,基础研究资助从新泽西医科和牙科大学的。