文摘

信封(env)某些内源性逆转录病毒的蛋白质(erv)参与各种病理生理过程。在这项研究中,我们的病理生理的特征属性两个小鼠白血病病毒类型ERV (MuLV-ERV)env基因克隆的C57BL / 6 j小鼠的卵巢。这两个env基因(命名 和 )、1926 \ bp编码区,源于两个MuLV-ERV位点8 - 18号染色体上,分别。 和 ~ 75 kDa,主要表达在细胞膜上。他们有能力生产pseudotype小鼠白血病病毒病毒粒子。向性特征和传染性 类似于多变吗env;然而, 很低水平的传染性。过度的 ,但不 ,产生细胞毒性作用和诱导的cox - 2的表达,il - 1β、il - 6和进气阀打开。这些发现表明, 和 有能力担任一个吗env病毒粒子的组装的蛋白质,他们施加不同的细胞毒性和炎症介质的调制。

1。介绍

古老的生殖系感染细胞与外生逆转录病毒建立了一个全基因组的随机嵌入前病毒,被称为内源性逆转录病毒(erv)和孟德尔遗传学控制他们对后代的遗传(1]。erv据报道,存在于所有脊椎动物的基因组,是大约8%的人类基因组和10%的老鼠基因组(2- - - - - -4]。大多数erv确认到目前为止据报道缺陷主要基于他们无法编码完整的多肽呕吐(组织特异性抗原),波尔(逆转录酶)env(信封)基因,它是必不可少的逆转录病毒的生命周期(5]。然而,最近的研究发现许多erv,保留完整的编码潜力呕吐,波尔和/或env基因,据报道,其中一些被关联到一个正常生理范围(例如,胎盘形态发生)以及致病过程(如多发性硬化症、精神分裂症、损伤、慢性疲劳综合症)(6- - - - - -10]。另一方面,猪erv生物学(一种致癌病毒)已经被广泛的研究,因为对人类的潜在传播一种致癌的副作用异种移植(11]。

的env糖蛋白的某些人类erv (HERVs)与不同的疾病过程(12- - - - - -16]。例如,env糖蛋白的HERV-K、HERV-E ERV-3被认为是肿瘤相关抗原在不同类型的癌症15- - - - - -18]。的HERV-Wenv叫做syncytin-1糖蛋白,是中枢神经系统内神经胶质细胞中高度表达的多发性硬化症,一种自身免疫性疾病,患者(13]。提出有效的促炎属性的syncytin-1有助于神经炎症和合成寡树突胶质细胞损伤在多发性硬化症的进展(12]。另一方面,syncytin-1 HERV-FRDenv糖蛋白,称为syncytin-2,据报道,在胚胎发育起着关键作用通过控制胎盘的形成合胞体滋养层主要通过其高度fusogenic属性(19- - - - - -22]。额外的env糖蛋白已确定和特点从小鼠erv生活的绵羊肺腺(syncytin-A和syncytin-B)和内源性逆转录病毒(enJSRV),和他们的角色在胎盘形态发生类似于syncytin-1和syncytin-27,23,24]。最近的研究的结果提供证据表明env某些erv的糖蛋白生物过程中发挥重要作用的正常生理疾病。

在调查的表达谱MuLV-ERV subgenomicenv记录在各种正常组织的C57BL / 6 j小鼠,两个假定的长篇env成绩单是卵巢中标识。在这项研究中,这两个MuLV-ERV的生物学特性env基因,名叫ENVOV1和ENVOV2,研究了通过检查一组选择性的病理生理的参数。

2。材料和方法

2.1。动物

女性C57BL / 6 j小鼠(大约12周大)从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)和安置根据美国国立卫生研究院的指导方针。动物使用和护理管理咨询委员会加州大学戴维斯,批准了实验性的协议。三个老鼠牺牲颈椎脱位的组织收集没有任何预处理,snap-frozen组织样本。

2.2。rt - pcr分析

RNA进行了隔离和互补脱氧核糖核酸的合成主要是根据有关协议提供的设备制造商。短暂,总RNA提取使用RNeasy工具包(试剂盒,瓦伦西亚,加州)和互补dna合成使用100 ng的总RNA从每个样本(组织或细胞)和Sensiscript逆转录酶(试剂盒)。引物能够放大整个长度以及subgenomic MuLV-ERV记录设计基于女仆(小鼠获得性免疫缺陷病毒)病毒相关病毒(基因库。S80082) [25]:向前,5′猫TTG GAG GTC CCA 20 AGA-3′(MV1K)和反向,5′ctc AGT CTG TCG GAG广汽TG-3′(MV2D)。以下是底漆集用于炎症介质:cox - 2(向前,5′ACA CAG TGC行动ACA TGA c - 3′和反向移行细胞癌,5′ATC ATC TCT ACC TGA GTG TC-3′), ICAM-1(向前,5′AGC TGT TTG AGC TGA GCG AGA-3′和反向,5′ctg TCG AAC苑柠檬酸GTC a - 3′), il - 1 (向前,5′广汽AGT手枪GAG AAT广汽CTG-3′和反向,5′棉酚CTC TGC AGA CTC AAA CTC CA-3′), il - 6(向前,5′gcc TTC有条件现金援助法案柠檬酸CAA GTC CG-3′和反向,5′cac标签GTT TGC CGA侠盗猎车手手枪CTC-3′) (26),伊诺(向前,5′aca AGC TGC ATG TGA猫CGA-3′和反向,5′cag AGC CTG亚美大陆煤层气有限公司柠檬酸TGT TTG颈- 3′),和TNF - (向前,5′gca TGA太极拳GCG ACG TGG AA-3′和反向,5′aga太极拳ATG 20 TTG GCC AG-3′) (27]。此外, 肌动蛋白(向前,5′cca行动GGG ACG ACA TGG AG-3′和反向,5′gta手枪GGG CAC AGT GTG GG-3′)被用来作为一个内部表达式控制(28]。放大产品的密度(仅适用于对炎症介质)测量使用柯达分子成像软件版本。4.5 (Carestream健康,罗彻斯特,纽约),它是标准化的 肌动蛋白控制。

2.3。克隆和测序的env成绩单

的rt - pcr产品MuLV-ERV subgenomic成绩单(~ 2.9 Kb)被克隆到pGEM-T简单向量(威斯康星州麦迪逊Promega)其次是质粒DNA从试剂盒制备使用工具,和测序分析戴维斯分校测序公司(加州戴维斯)或分子克隆实验室(位于加州旧金山市的非赢利)。使用向量NTI-ver DNA序列进行了分析。10(表达载体,加州卡尔斯巴德)或Editseq MegAlign项目DNASTAR版本。8.0.2(威斯康星州麦迪逊DNASTAR)。

2.4。ENV建设OV1和ENVOV2表达载体

ENV的编码区域OV1和ENVOV2放大了PCR从各自的原始cDNA克隆使用一组引物嵌入与限制性内切酶网站克隆到pcDNA4 / HisMax(表达载体):推进不我5′公司治理文化GGC GGC公司治理文化ATG棉酚GGT CCA GCG TTC TC-3′, ENVOV1相反,Xho我5′ggc TCG AGT答柠檬酸CGT手枪太极拳法TTT TCT GG-3′,和ENVOV2相反,Xho我5′ggc TCG AGT答柠檬酸CGT手枪太极拳法TCT TCT GG-3′。10 PCR循环后放大的编码序列克隆到pGEMT-Easy向量(Promega)其次是消化不我和Xho我随后克隆pcDNA4 / HisMax(表达载体)。

2.5。细胞系

gp2 - 293包装细胞(从Clontech购买,加州山景城),tsA201细胞(HEK293细胞)的衍生物,COS-7细胞,和COS-1细胞维持在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM,英杰公司)补充10%胎牛血清,链霉素,青霉素g .其他五个细胞系(海拉、Neuro-2a MDCK, HCT 116和NIH3T3)是培养根据美国建议的协议类型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。

2.6。分析生产、取向和传染性的Pseudotype LacZ-MuLV病毒粒子

gp2 - 293细胞,被播种到6-well板5×10的浓度5每口井的细胞,与pQCLIN cotransfected (Clontech,加州山景城)和pcDNA4 / HisMax-ENVOV1或pcDNA4 / HisMax-ENVOV2质粒使用Lipofectamine 2000(表达载体)。以下env被用于蛋白质取向和传染性控制:同向性(pEco), 4070年amphotropic (pAmpho), 10 a1 amphotropic (p10A1)比4070年更广泛的宿主范围,和G水泡性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G) (Clontech)。文化包含pseudotype浮在表面的病毒颗粒是通过一个0.45 M过滤器(费舍尔科学、匹兹堡、Pa)。染色细胞转染效率估计通过计算半乳糖苷染色后在显微镜下。

为每个细胞株(共8细胞系)用于取向和感染分析,5×104细胞/被播种到24-well板和孵化在制备病毒转导。随后,媒介取代0.5毫升的连续稀释的文化上层清液含pseudotype LacZ-MuLV病毒粒子,其中聚凝胺(σ,密尔沃基,威斯康星州)添加(8 g / mL),其次是洗后4小时和0.5毫升的孵化新媒体2天。受感染的细胞治疗与修复解决方案(2%甲醛和戊二醛0.2% PBS)和沾半乳糖苷的解决方案。在显微镜下细胞染色蓝被数感染。

2.7。免疫印迹分析

确认pcDNA4 / HisMax-ENV的表情OV1或pcDNA4 / HisMax-ENVOV2构造,免疫印迹分析转染后成tsA201细胞使用Fugene 6试剂(罗氏,曼海姆,德国)。在转染后2天,细胞被收获,免疫印迹分析。简单,膜,阻止5%脱脂奶粉(NFDM),孵化了一只山羊抗体特定的gp69/71 Rauscher亲(1:2000稀释5% NFDM TBST [Tris-buffered盐水渐变20])获得ViroMed生物安全实验室(卡姆登,NJ)紧随其后的是一个anti-goat-HRP抗体(1:5000年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯加州)。蛋白质信号可视化使用ECL试剂(通用电气医疗集团,匹兹堡,Pa)。类似的协议是用于检测env浮在表面的糖蛋白的gp2 - 293细胞生产pseudotype LacZ-MuLV病毒粒子。

2.8。免疫细胞化学

海拉细胞,转染pcDNA4 / HisMax-ENVOV1或pcDNA4 / HisMax-ENVOV2构造,收获和转移到0.1% poly-L-Lysine涂盖玻片和孵化1天。细胞然后用山羊抗体应用特定于gp69/71(1: 200稀释培养基,ViroMed生物安全实验室)和固定与4%多聚甲醛。固定细胞孵化Texas-Red-conjugated antigoat免疫球蛋白二次抗体(1:200稀释在PBS,向量实验室,伯林盖姆,加州)和染色细胞被蔡司显微镜使用AxioVison可视化软件4.5版本(卡尔蔡司,耶拿,德国)。

2.9。细胞毒性和细胞增殖化验

海拉细胞,转染pcDNA4 / HisMax-ENVOV1或pcDNA4 / HisMax-ENVOV2构造,受到使用细胞毒性细胞毒性试验检测设备(罗氏,加州旧金山南部)根据制造商建议的协议。吸光度测量在600 nm 490海里的引用使用读者从分子设备(加州森尼维尔市)。细胞增殖率从这些细胞使用比色测定MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)(σ,密尔沃基,威斯康星州)测定如前所述[29日]。吸光度是阅读在560海里的引用使用读者(分子设备)600海里。所有实验进行至少一式三份,和4个独立重复实验。

2.10。炎症介质的分析

RAW264.7细胞,转染pcDNA4 / HisMax-ENVOV1或pcDNA4 / HisMax-ENVOV2构造,收获在转染后1天,他们调查了一组炎症介质的表达在mRNA水平,rt - pcr和部分中描述的相关协议和试剂2。2以上。

2.11。统计分析

使用双尾学生的统计分析t以及和统计学意义被确定为* 和* * 。

3所示。结果

3.1。识别和两个MuLV-ERV的初步鉴定envSubgenomic转录表达C57BL / 6 j小鼠的卵巢

MuLV-ERV的表达谱env基因在各种正常组织(肝脏、肺、唾液腺、肾上腺、大脑、皮肤、卵巢、子宫)C57BL / 6 j小鼠的影响。大小不一的假定的subgenomic成绩单,从~ ~ 5 Kb 1 Kb,这可能是由拼接和/或删除,在每个组织差异表达。其中有~ 2.9 Kb乐队从长篇MuLV-ERV推测被放大env成绩单,他们的表情很明显的卵巢和子宫以及其他组织(图1(一))。测序分析显示两个2892个基点成绩单envmrna,由单一的拼接使用良好的供体和受体信号(30.]。随后的开放阅读框分析显示,两个长篇MuLV-ERVenv基因,名叫ENVOV1和ENVOV2,保留完整的编码潜力env641个氨基酸的糖蛋白。而ENV的核苷酸和多肽序列OV2是相同的一个env多变的基因小鼠白血病病毒(亲)-相关从NFS / N小鼠逆转录病毒序列,ENVOV1尚未报道(31日]。

(一)
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(c)
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图1
识别的长篇env记录从C57BL / 6 j小鼠的卵巢。(a)的MuLV-ERV subgenomic成绩单在正常组织表达(肝、肺、唾液腺、肾上腺,大脑和皮肤)C57BL / 6 j小鼠。示意图表示的位置引物用于放大subgenomic成绩单。(b)两个完整的氨基酸序列env基因,名叫ENVOV1和ENVOV2从卵巢,孤立的(与箭头显示面板(a)),是相对于参考env多肽与已知的取向特征(资源库加入号码:AAG39911 (Eco),ACY30460(韩国帝王),AAO37283(聚),AAA88318 (m.Poly))。(c)的假定的MuLV-ERV前病毒窝藏ENVOV1和ENVOV2基因映射到染色体8和18的C57BL / 6 j基因组,分别。苏(面域),TM(跨膜域),VRA(变量地区),VRB(变量地区B), PRR(脯氨酸丰富的地区),LTR(长末端重复)、R(重复),U(独特的区域)。

之前的功能描述ENVOV1和ENVOV2,他们与四个不同的参考env多肽显示不同的主机取向:嗜嗜异性,多变,多变(图修改1 (b))。原来ENVOV1和ENVOV2有一个更高层次的序列相似性多变/修改多变env多肽比别人。无论是ENVOV1和ENVOV2共享相同的序列变量地区和脯氨酸丰富的地区,当一个氨基酸残基不同变量地区B和R肽,分别。确定假定MuLV-ERVs ENV编码OV1和ENVOV2分别C57BL / 6 j基因组序列(37.1构建)的国家生物技术信息中心(NCBI)与相应的调查env核苷酸序列使用爆炸程序(32]。公认的前病毒认为编码ENVOV1和ENVOV2数据映射到意符染色体8和表意文字数据的染色体18日分别。两个MuLV-ERVs保留了编码潜力env多肽,ENVOV2也有潜力的编码波尔多肽(图1 (c))。

检查是否ENVOV1和ENVOV2能够制造完整的吗env多肽,他们在人类细胞系免疫印迹检测使用一个anti-gp69/71(紧随其后env)抗体。一种蛋白质群~ 75 kDa, MuLV-ERV大小的env多肽,检测(图2(一个))。此外,这些的亚细胞分布env多肽是由瞬时转染检查之后,使用相同的抗体免疫细胞化学用于免疫印迹分析。无论是ENVOV1和ENVOV2蛋白质显然是细胞膜上表达预期的逆转录病毒env多肽(图2 (b))。

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图2
编码ENV的潜在和膜定位OV1和ENVOV2多肽。(一)编码ENV的潜力OV1和ENVOV2证实了多肽超表达之后,使用抗体免疫印迹分析Rauscher亲gp69/71env多肽。(b)的细胞分布中ENVOV1和ENVOV2多肽是由免疫细胞化学检测使用抗体Rauscher亲gp69/71多肽,及其膜染色模式是显而易见的。细胞转染带有空白质粒作为负控制(模拟)。DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole)。
3.2。ENV的传染性和取向特征OV1和ENVOV2多肽

两个相关的特征,取向和传染性,ENVOV1和ENVOV2多肽测定相比,使用逆转录病毒包装系统和参考env蛋白质与已知主机取向:同向性,amphotropic,泛嗜性。分析前的传染性和取向特征,包装ENV的潜力OV1和ENVOV2多肽和释放pseudotype LacZ-MuLV病毒粒子经检测~ 75 kDa乐队在转染后上层清液收集文化(图3)。有趣的是,一个明显更高级别的env蛋白质的上层清液中检测出含有ENVOV2打包pseudotype病毒粒子ENV相比OV1样本。这一发现可能表明ENVOV2多肽是更有效地生产和/或包装过程中病毒粒子组装ENV相比OV1。ENV的传染性和取向特征OV1和ENVOV2多肽然后检查各种细胞类型的感染来自人类,非人类的灵长类动物,老鼠和狗。它表明pseudotype LacZ-MuLV病毒粒子与ENV包装OV1或ENVOV2能够感染小鼠和nonmouse细胞表明其多变取向特征,这是符合对齐数据呈现在图1(表1)。虽然pseudotype ENVOV2-LacZ-MuLV病毒传染性证明非常类似于amphotropic和泛嗜性控制,ENVOV1-LacZ-MuLV病毒感染显著低浓度与对照组相比,可能由于低表达水平和/或低效率的包装可能在病毒粒子的组装。

表1
向性特征和ENV的传染性OV1和ENVOV2多肽。感染效价单位(U /毫升):LacZ阳性细胞的数量每毫升含有病毒颗粒的上层清液。ND:不检测。

图3
生产pseudotype LacZ-MuLV病毒粒子。文化存在pseudotype LacZ-MuLV病毒颗粒浮在表面的确诊的gp2 - 293包装细胞的检测env多肽对拉舍尔亲使用抗体gp69/71。箭头表示env多肽。上层清液收集与空白质粒转染细胞作为负控制(模拟)。
3.3。ENV的细胞病理特征OV1和ENVOV2多肽

在这个实验中,ENV的细胞病变效应OV1和ENVOV2多肽是由过度检查之后,测量细胞毒性和细胞增殖的抑制作用。细胞毒性ENV的财产OV2多肽显然证明了这两种比色定量分析和显微镜检查的形态特征,包括坚持培养板(数字4(一)和4 (b))。相比之下,没有观察到显著的细胞毒性效应与ENV细胞中过表达OV1多肽与消极的控制。另一方面,过度的ENVOV2多肽,但不是ENVOV1多肽,明显抑制细胞增殖,细胞生长(图的比色定量测量4 (c))。很可能由ENV抑制细胞增殖OV2多肽与细胞毒性作用,目前尚不清楚如何高效价与感染细胞病变特征。

(一)
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(b)
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(c)
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图4
ENV的细胞病变效应OV1和ENVOV2多肽。(a)和(b)的细胞毒性性质ENVOV2多肽,但不是ENVOV1多肽,观察在细胞毒性试验的测量乳酸脱氢酶释放和细胞形态学检查(200 x放大)。细胞毒性是规范化的程度没有DNA(面板(a))。(c) ENVOV2多肽对细胞增殖的抑制作用证明了MTT分析,衡量细胞生存能力,超表达。所有实验进行了一式三份。(* *和* *显示统计意义 ;* * )。
3.4。调制ENV的炎症介质OV1和ENVOV2多肽

调查是否ENVOV1和ENVOV2在炎症中发挥作用,改变在mRNA的表达一组炎症介质对RAW264.7过度后肺泡巨噬细胞的细胞。一组包括cox - 2 (cyclooxygenase-2)的促炎介质,ICAM-1(细胞间粘附分子1),伊诺(诱导一氧化氮合酶),il - 1 、il - 6和TNF -α。四促炎介质的表达cox - 2,进气阀打开,il - 1βil - 6,被过度ENV的显著增加OV2多肽但不是ENVOV1(数据5(一个)和5 (b))。相比之下,在ICAM-1和TNF -没有显著变化α水平之后发现的超表达ENVOV1或ENVOV2多肽。来自本研究的发现表明,ENVOV1和ENVOV2多肽不同参与某些信号事件控制炎症介质的产生。

(一)
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图5
ENV的影响OV1和ENVOV2多肽在炎症介质的表达。(a)和(b) ENV的影响OV1或ENVOV2多肽在RAW264.7各种炎症介质的表达。微分调节炎症介质潜力ENV之间的观察OV1和ENVOV2多肽。每个炎性介质的光密度值归一化 肌动蛋白和制定一个图表。三种不同形式的负控制被包含在这个实验:没有DNA, pcDNA4(空白pcDNA4 / HisMax质粒),和GR11 ENV(类似插入大小OV1和ENVOV2:糖皮质激素受体在pcDNA4 / HisMax鼠标)。试验进行了一式三份。(* *和* *显示统计意义 ;* * )。

4所示。讨论

两个MuLV-ERVenv与完整的编码基因潜力,名叫ENVOV1和ENVOV2被孤立于卵巢的正常C57BL / 6 j小鼠和他们的生物属性特征。尽管序列之一(ENVOV2)的两个env基因已经被报道之前,其生物功能没有特征(31日]。这项研究的结果表明,ENVOV1和ENVOV2多肽,决定授予多变取向,参与一系列生物过程,如逆转录病毒包装、细胞死亡,增殖和炎症。

这项研究的结果表明,假定的MuLV-ERVs,或身份不明的外生逆转录病毒,这与要么ENV打包OV1或ENVOV2多肽,能够感染细胞的老鼠以及其他的物种,比如人类,非人类的灵长类动物,和狗。新创以及与压力相关的激活MuLV-ERVs,打包env多肽,其次是感染的局部以及远处的特定细胞。除了潜在的细胞病变效应研究在这项研究中,基因随机整合前病毒的dna可能直接与各种致病性感染后结果。进一步在活的有机体内的研究需要确定传染性MuLV-ERVs打包这些env多肽对小鼠以及其他物种。

erv与一系列疾病相关,如脓毒症、多发性硬化和损伤的病理学包括炎症条件(12,33- - - - - -37]。一些报道提供某些ERV的证据env基因产物,但不相关的病毒颗粒,扮演一个角色在各种病理表型相关的炎症过程38,39]。的HERV-W syncytin-1施加其炎症影响诱导的促炎介质,如il - 1β、il - 6、il - 12、伊诺和TNF -α多发性硬化患者的炎症,导致神经元(12,40]。来自本研究的发现,ENVOV2多肽能够调节炎症介质显示其潜在角色在各种疾病免疫内稳态以及涉及炎症条件,如脓毒症(41,42]。

明显更高层次的包装和随后释放pseudotype LacZ-MuLV病毒粒子与ENV预测OV2ENV相比OV1基于丰富的检测env多肽在文化ENV的上层清液OV2样本。它与ENV的发现是一致的OV2包装病毒粒子(pseudotype ENVOV2-LacZ-MuLVs)有更高的感染滴度ENV相比OV1包装病毒粒子(pseudotype ENVOV1-LacZ-MuLVs)。有可能与ENV假定的包装率高OV2多肽是直接关系到其高效转录和/或翻译以及稳定性。另一方面,丰富的ENV面前OV2多肽在细胞质中或许可以解释,至少在某种程度上,细胞毒性的特点和抑制增殖ENV相比OV1。在整个编码序列,9个氨基酸残基(V22I、R24G R158G, Q161R, R362G, G518R, G528R, D608,和K640E) ENV之间是不同的OV1和ENVOV2多肽。可能需要进一步调查来学习这些多态残留的角色在稳定性和致病特点,包括传染性,ENVOV1和ENVOV2多肽。

5。结论

这项研究的结果表明,某些MuLV-ERVenv多肽,比如ENVOV2,可能参与一系列的病理生理的过程作为一个信封MuLV-ERV病毒粒子和/或独立。

确认

本研究支持由后来的北美(没有。86800 k .秋也没有。84308 - Y.-K。李[博士后奖学金])和美国国立卫生研究院(k .赵R01 GM071360)。