文摘

目的。凝血酶不仅在血栓形成和血小板活化过程中扮演着重要的角色,而且在诱导的炎症过程。激活因子X(——)通常被认为是一个重要的球员负责凝血酶的凝血级联的一代。我们评估假设rivaroxaban,直接FXa抑制剂,变弱斑块进展,促进稳定的先进的动脉粥样硬化病变在活的有机体内模型。方法和结果。Rivaroxaban(1或5毫克/公斤体重/天)或标准食物饮食管理为26周载脂蛋白E-deficient老鼠(每组)已经建立了动脉粥样硬化病变。有一个无意义的减少高浓度组病变进展,而控制老鼠。FXa抑制Rivaroxaban 5毫克/公斤/天导致增加防护纤维帽的厚度( 米和 m;),以及在内侧侵蚀和侧黄色瘤越来越少,说明斑块稳定特性。真正的time-PCR从胸主动脉显示rivaroxaban(5毫克/公斤/天)治疗减少炎症介质的mRNA表达,这样的il - 6、TNF -α、MCP-1 Egr-1 ()。结论。慢性rivaroxaban并不影响病变进展,但会使炎症介质的表达,促进病变稳定载脂蛋白E-deficient老鼠。

1。介绍

Rivaroxaban(拜耳公司、德国)是一种新型口服直接因素Xa(——)抑制剂——不仅免费,而且prothrombinase复杂、凝块绑定FXa活动。它显示在各种强有力的抗血栓形成的影响在活的有机体内静脉和动脉血栓模型(1]。

2008年,rivaroxaban获得批准在欧盟和加拿大成人患者的静脉血栓栓塞的预防择期全髋关节或膝关节置换手术。两个主要的临床研究评估rivaroxaban房颤患者(2和治疗静脉血栓栓塞3]。除了其经典角色血栓栓塞的预防或治疗疾病,rivaroxaban也在二期临床试验评估患者在急性冠状动脉综合征(ACS)之后就稳定下来了。临床上显著的出血的风险增加剂量依赖性的方式,与安慰剂相比。Xa抑制因素是降低趋势的主要功效端点的死亡,心肌梗死,中风或严重的复发性缺血需要血管形成。关于主要次要疗效端点,rivaroxaban显著降低的速度死亡,心肌梗死或中风(4]。第三阶段研究Atlas-ACS-TIMI 51在ACS患者正在进行。

动脉粥样硬化是一种进步,炎性疾病的特点是动脉中脂类的积累和纤维元素。尽管先进的病变可以增长足够大阻止血液流动,最重要的临床并发症由于血栓形成是一种急性闭塞,导致心肌梗塞或中风。通常,血栓的形成与破裂或侵蚀不稳定的动脉粥样硬化病变,随着坏死核心的凝血内容暴露于循环thrombocytes [5,6]。

内在和外在途径激活的凝血级联的收敛因子X Xa。Xa水解和激活凝血酶原凝血酶活跃的因素。越来越多的证据表明,凝固因素,如凝血酶参与动脉粥样硬化性心脏病,不直接涉及血栓形成等信号通过protease-activated受体(7]。之前我们实验室实验表明ximelagatran,直接凝血酶抑制剂,减少损伤发展和促进斑块稳定载脂蛋白E-deficient老鼠(8]。数据——新一代的血管效应直接抑制剂是非常有限的。

这促使我们调查政府的直接因素是否Xa抑制剂rivaroxaban变弱和促进稳定先进的动脉粥样硬化病变进展hyperlipidemic载脂蛋白E-deficient老鼠。

2。材料和方法

2.1。动物和药物治疗

六十26-week-old女性apoliprotein E-deficient老鼠(美国特拉华州威尔明顿的查尔斯河实验室、应变B6.129P2Apoe名称^tm1Unc/ Crl)已经建立了先进的无名动脉粥样硬化病变的维持在海德堡大学的动物保健设施。六十小鼠随机分为3组(每组20老鼠):一组标准食物饮食(对照组),另一组接受食物的饮食补充rivaroxaban 1毫克/公斤体重/天(低浓度组),和一组食物的饮食,补充rivaroxaban 5毫克/公斤体重/天(高浓度组)26周。住房和照顾动物和所有程序完成这项研究进行按照当地动物保护委员会的指导方针和法规海德堡大学的。调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生院(NIH没有出版。85 - 23,1996年修订)。

2.2。动物的牺牲和制备血浆和组织

在52周小鼠安乐死没有麻醉前禁食。老鼠昏沉(Xylazin和Ketamin),血液被收集在柠檬酸盐(每组5老鼠)或肝素(每组5老鼠)从下腔静脉注射器并保存在柠檬酸盐或肝素瓶。血液样本在3000转离心10分钟大约在4°C获得等离子体,这是存储在−20°C到分析。老鼠然后用10毫升磷酸盐缓冲盐水灌注生理压力通过左心室和胸主动脉结扎左锁骨下动脉的远端和删除,以备后续分析rt - pcr的候选基因或转录因子的分析化验凝胶转变。然后,与4%的缓冲福尔马林灌注小鼠生理压力通过左心室。最后,无名动脉是嵌入在石蜡和连续切割(5μ米)。第五部分都沾Movat染色。

2.3。测定血浆脂质水平和Rivaroxaban浓度

等离子体浓度的总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇,甘油三酯测定酶在肝素化血浆自动分析仪ADVIA 2400化学系统(德国拜耳公司)。总胆固醇和甘油三酯测定使用COD-PAP和GPO-PAP方法(胆固醇氧化酶/甘油磷酸氧化酶与苯酚和4-aminophenazone)和高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇测定使用商业可用工具(德国拜耳公司)。Rivaroxaban浓度测定在柠檬酸盐等离子体由拜耳公司,德国。

2.4。评价斑块成分和病变的大小

两个独立的调查人员也不清楚研究协议评估每个部分斑块不稳定性的特征。包括厚度的纤维帽(薄纤维帽被定义为3或更少的细胞层),坏死核心的大小(大量坏死核心定义为占据总数的1/3以上病变区域),intraplaque出血(定义为血红细胞的存在独立于微血管),钙化(定义的基础上积极与范Kossa染色剂染色),胆固醇晶体,内侧侵蚀(定义为斑块组织渗透到媒体),和侧面黄色瘤(定义为骨料的存在macrophage-derived泡沫细胞位于外侧边缘的斑块)。这些记录为每一组二进制结果和频率决定。

每个每个斑块的横截面积进行了分析使用计算机辅助形态测量学(专业形象、媒体控制论、银泉,美国)。最大损伤面积、最大病灶厚度、最大狭窄百分比,最大的坏死区域核心和最小厚度的纤维帽和媒体的动物被用于后续统计对比组。

2.5。免疫组织化学

组织部分无名动脉的毗邻网站最大损伤面积是脱蜡和水化。内源性过氧化物酶活性抑制通过孵化peroxoblock(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国)。检测巨噬细胞是由使用老鼠anti-mouse单克隆抗体(anti-Mac-2,伯灵顿,加拿大),平滑肌α肌动蛋白的表达使用特定兔抗体(Dianova GmbH,汉堡,德国)根据制造商的协议。Anti-Mac-2和肌动蛋白在室温下孵化一小时。部分被孵化与生物素化的二次抗体,冲洗3 x PBS和孵化与链霉亲和素在室温下10分钟。AEC-chromogen衬底(Zytomed系统GmbH,柏林,德国)是用于可视化。阳性染色的程度内的病变是标准化的最大损伤面积使用计算机辅助形态测量学(尼康GmbH,杜塞尔多夫,德国)。

2.6。实时聚合酶链反应分析

胸主动脉的总RNA提取,由吸光度在260海里。RNA是反向转录与恢复援助的第一链合成装备(Fermentas,圣Leon-Rot,德国)。实时PCR进行每个基因在光周期计使用杂交探针和引物设计的通用探测器图书馆(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。所有程序都是根据制造商的协议执行。相关的基因表达水平计算如前所报道(9]。

2.7。统计分析

所有数据都表示为均值±S.E.M.显著差异意味着血浆脂质水平,血清rivaroxaban水平测定和单因素方差分析。斑块形态测量学的分析和地区积极的免疫组织化学染色法测定使用单因素方差分析。比较评价斑块形态,被试者使用χ²测试。值≤。05年被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。身体体重、血脂水平和Rivaroxaban血浆浓度

一个鼠标的对照组在研究过程中就去世了。所有其他老鼠仍然健康。特别是,没有观察到明显的出血。牺牲的时候,老鼠rivaroxaban显示略高剂量的治疗,但显著降低身体重量与对照组相比(表1)。

没有明显差异的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白胆固醇,甘油三酯和总水平组(表中1)。因此,本研究中观察到的影响无关任何lipid-modifying rivaroxaban的影响。等离子体水平的rivaroxaban分别为24.2±9.3 ng / mL(平均±SD)高浓度组和6.2±1.5 ng / mL(平均值±SD)在低浓度组(在每组)(表1)。

3.2。病变进展和斑块组成

头臂动脉动脉的形态学分析显示,慢性管理rivaroxaban chow饮食在26周不会大幅改变的动脉粥样硬化斑块进展载脂蛋白E-deficient老鼠(图1)。然而,政府的高浓度rivaroxaban防护纤维帽厚度增加(μ米和μ米的对照组;)。此外,在内侧的存在有显著减少侵蚀和侧黄色瘤rivaroxaban老鼠(5毫克/公斤/天),与对照组相比(表2)。有趣的是,内侧侵蚀的频率也减少了我们之前实验的直接凝血酶抑制剂melagatran [8]。

分析斑块成分的免疫组织化学显示无意义的减少染色对平滑肌α肌动蛋白(高剂量组rivaroxaban(图)2)。染色对平滑肌α肌动蛋白主要位于纤维帽。没有统计显著差异在染色Mac-2三组之间(图2)。代表病变形态如图4。

3.3。在主动脉组织中炎性细胞因子的表达

两rivaroxaban浓度显著降低慢性政府mRNA的表达il - 6、TNF -α、MCP-1 Egr-1治疗小鼠主动脉组织,与对照组相比(图3)。数据在图3表明mRNA表达的褶皱增加主动脉组织与控制的老鼠。令人惊讶的是,只有老鼠接受低,但不是高剂量的rivaroxaban,显示显著减少的mRNA的表达干扰素-γ。没有明显差异的三组(图之间的组织因子的表达3)。

4所示。讨论

目前的研究表明长期口服直接管理因素Xa抑制剂rivaroxaban减少促炎介质的表达,如il - 6、TNF -α、MCP-1 Egr-1主动脉组织中载脂蛋白E-deficient老鼠。此外,rivaroxaban增强防护纤维帽和厚度减少内侧侵蚀和侧黄色瘤,因此促进病变稳定在这个模型中先进的动脉粥样硬化性疾病。然而,减少损伤的发展规模没有达到统计学意义。

因素Xa凝血级联过程中扮演着重要的角色,连接的外在和内在途径催化转化的凝血酶原凝血酶对血管细胞表面(10]。Xa抒发各种因素和复杂的信号事件在一个广泛的细胞类型,通过激活protease-activated receptors-1 (PAR-1)和杆。因素Xa和PAR-1凝血酶份额,主要为凝血酶受体下游细胞受体(11]。杆表达式是增强人类冠状动脉粥样硬化病变(12]。——通过杆调节,作为一个强大的化学引诱物为成纤维细胞和有助于纤维母细胞分化成myofibroblasts [13]。兴趣因素Xa信号被点燃后杆的实现,而不是PAR-1,充当一个关键球员在广泛的发展模式fibroproliferative病态的接口(13- - - - - -16]。

动脉粥样硬化相关的不仅是动脉粥样硬化斑块的形成和发展,但也被认为是一个系统性炎性疾病,这是由遗传和环境危险因素的调节。持续的炎症会导致斑块破裂和血栓形成与后续缺血和心肌梗死(5,6]。在最近的研究中,因子Xa已经发现引发急性炎症反应在活的有机体内(17- - - - - -19),在体外(20.- - - - - -22]。在内皮细胞因子Xa导致核转录因子的激活κB (NF -κB), il - 6的释放,引发,和单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1),导致白细胞招募(20.- - - - - -22]。这些反应是通过PAR2介导激活虽然有些研究显示小的参与PAR1 [21,23]。

凝固是紧密团结和炎症信号通路(24,25]。多项研究表明,抗凝治疗不仅减少了激活凝血,还能抑制炎症,表明广泛的这些过程之间的相互作用。然而,rivaroxaban对损伤的影响成分,至少部分与抗血栓形成的活动无关。组织因子的表达,一个外在的有力激活凝血级联,没有不同的胸主动脉rivaroxaban治疗与控制老鼠。明显的血栓形成既不是观察到在目前的研究中,也在我们先前的研究先进的动脉粥样硬化病变在同一模型中,可能由于高纤溶活性在老鼠26]。

Rivaroxaban合成小分子能够抑制自由因子Xa clot-bound和Xa prothrombinase-bound因素。Xa抑制剂,与间接因素的影响rivaroxaban不需要抗凝血酶的存在(27]。

因素Xa也是促进有丝分裂发生几个细胞系,包括血管平滑肌细胞(VSMC) [28- - - - - -30.]。几项研究表明,抑制因子Xa减少VSMC增殖(31日气囊血管成形术后再狭窄),(31日- - - - - -35]。在分子水平上,伤口愈合和纤维化相似机制,包括成纤维细胞的迁移、增殖和随后的分化成myofibroblasts通常表达αsm肌动蛋白(36]。在肾间质纤维化,有相关性αsm肌动蛋白和杆表达(37]。在目前的研究中,也有减少的趋势染色α光滑的肌肉损伤的肌动蛋白rivaroxaban治疗小鼠,暗示潜在rivaroxaban减少气球血管成形术后再狭窄的影响,通过其抗增殖特性。

有趣的是,与我们的以前的观测与辛伐他汀(38),频率intraplaque出血并不减少rivaroxaban管理。可能在斑块出血方面,plaque-stabilizing Xa抑制因素的影响被抵消anticoagulatory属性,导致红细胞的对比模式沉积在其他更稳定的病变。

等离子体rivaroxaban相当低水平在我们的研究中。生物利用度rivaroxaban可怜的老鼠,老鼠和其他物种相比。因此,更高剂量的药物管理局通过食物的饮食并不会必然导致明显高于血浆浓度。似乎可能更高的血浆浓度的rivaroxaban翻译不仅抗炎和病变稳定效果,在目前的研究中,观察到病变进展的也显著减少。使用目前的动物模型的基本原理是,长期接触毒品的转基因小鼠hyperlipidemic使不仅评估病变进展,但同时,更相关的斑块组成。它还允许一个,至少间接比较,Xa和直接抑制凝血酶抑制之间的直接因素,评估我们在先前的研究8]。

在我们的研究中,长期管理rivaroxaban(5毫克/公斤/天)显著降低mRNA的表达Egr-1, il - 6、TNF -αMCP-1在小鼠主动脉组织中,清楚地显示抗炎Xa抑制性能的因素。老鼠,缺乏MCP-1或其受体CCR2,显著降低动脉粥样硬化病变,这表明MCP-1 / CCR2交互作用在动脉粥样硬化(单核细胞招聘39,40]。虽然单核细胞动脉粥样化形成的招聘是一个重要的促炎的事件,数量的巨噬细胞,免疫组织化学评估,没有减少rivaroxaban治疗在目前的研究中。还需要进一步的研究来评估因素是否Xa抑制减少巨噬细胞的活动,而不是实际的先进的动脉粥样硬化病变的炎症细胞数量。

5。结论

总之,我们的研究表明,慢性rivaroxaban管理可以起到抗炎作用,稳定病变晚期动脉粥样硬化疾病的模型。直接因素Xa抑制剂可能成为潜在的治疗工具建立了动脉粥样硬化疾病患者。

确认

这项研究是由拜耳公司的科研补助金,德国。问:周由中国奖学金委员会。作者要感谢安妮特男管家的专家技术援助。