文摘

自然杀伤细胞(NK) eosinophilotactic分泌细胞因子,然而,是否有助于分泌引发嗜酸性粒细胞趋化作用的不清楚。我们调查的能力CD56 + CD3-ve (NK细胞)引起的外周血嗜酸性粒细胞趋化性过敏性鼻炎(AR)的病人,通过引发分泌,和IL-15的影响,NK细胞proactivating细胞因子,与骨化三醇:1α,25-dihydroxy维生素D₃(维生素D₃),免疫调制剂代理,在这个场景中。,结果表明,上层清液从如果NK细胞表现出对嗜酸性粒细胞趋化现象的活动。这种效应被IL-15显著增强(1 ng / mL)治疗,导致增加趋化指数大约3折叠和废除了中和抗体(Ab)引发剂量依赖性的方式。引发的数量由NK细胞分泌被IL-15治疗水平的提高来Pg / mL,显著降低了10⁻⁶维生素D M₃水平的Pg / mL。我们的研究结果表明小说炎症相声NK细胞和嗜酸性粒细胞之间通过IL-15 /引发轴可以调制的维生素D₃。

1。介绍

引发是一个有力的活化剂,嗜酸性粒细胞趋化作用在体外和体内1]。引发也拥有一个明确的角色在过敏性呼吸道疾病的嗜酸性粒细胞趋化作用[2,3]。另一方面,对人类嗜酸性粒细胞IL-15影响是通过抑制自发通过自分泌细胞凋亡gm - csf的生产,因此可能使过敏炎症长期嗜酸性粒细胞生存(4]。然而,IL-15在过敏性气道疾病的病理生理学中的作用仍处于初级阶段,仍然是一个有争议的问题5- - - - - -9]。

NK细胞活化在病毒和肿瘤溶解[有着至关重要的作用10];然而,他们也产生细胞因子,因此被认为发挥促炎作用[11]。NK细胞的促分泌素活动包括干扰素-γil - 10, TNF -α、MIP-1 MIP-1β和gm - csf。这些细胞因子由IL-15增强,激活单核细胞/巨噬细胞产生的细胞因子(12,13]。有些研究人员展示了NK细胞的分化能力的il - 4为NK细胞分泌的细胞因子子集模式类似于T_H2配置文件如IL-5和IL-13 [14,15]。最近的一项研究表明2型cytokine-secreting NK细胞的存在在AR和显示增加和增强NK细胞的细胞毒性16]。这凸显了小说的角色NK细胞在过敏性疾病。尽管如此,NK细胞是否能够吸引通过引发嗜酸性粒细胞分泌尚不清楚。

越来越多的证据支持一个新颖的免疫调节作用在过敏性疾病,如哮喘和维生素D AR (17,18]。维生素D的能力,减少炎症细胞的细胞因子也承认。因此,治疗潜在的维生素D作为抗炎剂过敏疾病仍然是一个感兴趣的主题。

这里,我们将展示一种小说之间的串扰人NK细胞和嗜酸性粒细胞招聘通过IL-15 /引发轴。结果讨论与维生素D的小说可能的治疗效果在表达下调炎症活动,和可能的作用对NK细胞病理生理学的基于“增大化现实”技术。

2。材料和方法

2.1。细胞的准备

嗜酸性粒细胞和NK细胞被Percoll孤立(66%)的解决方案。NK细胞分离得到淡黄色的外套为文化的目的,获得大量的细胞和嗜酸性粒细胞是刚从16 AR患者的外周血分离不同气源性致敏原,经皮肤敏感测试和/或radioallergosorbent测试(拉斯特)。嗜酸性粒细胞和NK细胞进一步纯化负选择immunomagnetic细胞分离(mac;Miltenyi研究、Bergisch格拉德巴赫、德国),嗜酸性粒细胞净化使用anti-CD16磁珠,鸡尾酒biotin-conjugated lineage-specific抗原和抗体的微磁(NK细胞隔离Kit-human Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)对NK细胞(CD56 + ve CD3-ve)净化。细胞类型的细胞纯度> 96%。根据细胞生存能力总是> 98%台盼蓝。

2.2。细胞培养

NK细胞(细胞)的存在与否是孵化1 ng / mL IL-15(研发系统;明尼阿波利斯,MN) 10⁻⁶维生素D的浓度₃(开曼化学),10⁻⁵M h - 89的浓度盐酸盐(VWR-CALBIOCHEM), PKA抑制剂,10⁻⁵M Bisindolylmaleimide浓度(VWR-CALBIOCHEM), PKC抑制剂,10⁻⁵M SB203580浓度(VWR-CALBIOCHEM), P38 map激酶抑制剂,或1μ米高金雀花碱的浓度(σ),酪氨酸激酶抑制剂,在37°c - 5%的股份有限公司₂1毫升rpmi - 1640与100 U青霉素补充/毫升和100年μg链霉素/毫升(Lonza, Verviers,比利时),10%的灭活胎牛血清(Lonza) 24井板(BD生物科学)。72 h潜伏期后,上层清液被小心地收集和分析eosinophilotactic活动引发的内容。

引发的测量内容引起的外周血NK细胞AR患者鼻挑战,前后外周血NK细胞纯化从额外的四个AR患者屋尘螨(HDM)。取得患者同意后,30毫升外周血中获得前6小时后鼻挑战HDM过敏原。纯化NK细胞的浓度细胞/毫升培养基中培养72小时。上层清液收集和引发被ELISA测定。

2.3。趋化性分析

趋化性分析进行了一式三份的48-well microchemotaxis Boyden钱伯斯在5%孵化有限公司₂在37°C的90分钟。整除29μL NK的上层清液被放置在较低的井和50μ嗜酸性粒细胞悬挂(10 L⁶细胞/毫升)被放置在上井。5.0两室隔开μ米孔聚碳酸酯膜(英国米德尔塞克斯图像比对,绘画纸)。细胞粘附迁移到较低的表面被数5选择大功率领域/光学显微镜下(5高通滤波器;X400)。至于阻断实验中,NK上层清液被preincubated 1 h和趋化性试验期间,用不同剂量(10⁻⁸-10年⁻⁶g / mL)的单克隆anti-IL-8Ab中和引发的生物活性(研发系统;明尼阿波利斯。MN)。

2.4。酶联Immunosorbant试验(ELISA)

的内容引发的上层清液测定NK细胞使用人类引发cytoset工具包(美国英杰公司公司)根据制造商的建议。

2.5。统计分析

统计学意义是由成对的以及。的值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。NK细胞Supernatants-Induced嗜酸性粒细胞趋化性

NK细胞上清液诱导的嗜酸性粒细胞趋化性AR患者(图1)。NK细胞治疗的最佳剂量1 ng / mL IL-15文化时期导致显著增强NK细胞supernatant-induced嗜酸性粒细胞趋化性从AR患者几乎三倍趋化性指数。这些结果表明小说中NK细胞自分泌活动招募嗜酸性粒细胞和突出小说角色IL-15在调控的效果。

3.2。阻塞Anti-IL8 Ab的活动

图2显示,嗜酸性粒细胞趋化作用的基于“增大化现实”技术对NK细胞的上清液治疗的病人IL-15明显被anti-IL-8 Ab。阻塞活动是剂量依赖性的方式,但并不是完全阻塞控制水平。这些结果表明,NK细胞刺激IL-15 eosinophilotactic分泌趋化因子,包括至少部分引发。为了证实这一点,我们接下来用ELISA引发自发分泌NK细胞的数量,和IL-15和维生素D的调节效应₃引发分泌。

3.3。调制的分泌引发NK细胞上清液由IL-15和维生素D₃

我们测试了引发的数量由72 h后NK细胞分泌文化时期的存在和缺乏IL-15或维生素D的最佳剂量₃。我们可以看到在桌子上1,培养NK细胞分泌引发72 h。恢复引发的数量增加来Pg / mL,显著减少了维生素D₃来Pg / mL。这些结果表明IL-15移植的能力引发促分泌素NK细胞活性,和维生素D的能力₃显著抑制引发促分泌素NK细胞的活性。此外,它证实了引发的贡献eosinophilotactic NK细胞分泌的细胞因子。

然而,了解可能的信号通路参与NK细胞induced-IL-8调制IL-15和维生素D₃,我们对NK细胞具有不同的激酶抑制剂文化时期。h - 89盐酸盐、Bisindo-lylmaleimide或染料木黄酮没有调整引发的数量由NK细胞分泌(数据没有显示)。然而,我们可以看到在桌子上1,引发对SB203580 NK细胞分泌的敏感,导致减少引发的Pg / mL。同样,引发分泌的增加IL-15降低了SB203580。这些结果可能表明的参与P38 map激酶的信号转导通路引发NK细胞分泌。

3.4。调制的分泌引发NK细胞上清液后AR患者鼻腔的挑战

最后进一步联系我们的结果AR的病理生理学,我们挑战AR患者HDM HDM过敏原。NK细胞净化前后6 h postchallenge培养了72 h。收集上清液被ELISA检测的引发恢复。作为显示在图3后,鼻挑战引发的NK细胞分泌量显著提高。这个结果表明NK细胞的重要性作为引发源AR的病理生理学。

4所示。讨论

在当前通信,我们演示了一个新颖的相声NK细胞和嗜酸性粒细胞之间通过IL-15 /引发轴。这可能表明一个角色IL-15病理生理学的过敏性鼻炎晚期反应和促进嗜酸性炎症。

复杂的体内环境的基于“增大化现实”技术的疾病,T_H2细胞因子特别是诱导接触过敏原后'嗜酸性粒细胞。这使得它们表现出不同的表型和夸张的趋化因子,如引发反应19]。在这里,我们表明,AR患者鼻过敏原的挑战也质数NK细胞分泌更多的引发。此外,NK细胞分泌的能力引发他们的上层清液导致AR患者嗜酸性粒细胞的吸引力可能会提供一个进一步的解释在AR嗜酸性粒细胞招募。

IL-15延长嗜曙红细胞生存,因此作为proeosinophilic炎性介质(4]。在最近的研究中,IL-15进一步演示了一个新颖的间接作用,帮助嗜酸性粒细胞招募,至少部分从休息NK细胞通过分泌引发。

维生素D与核受体结合后,维生素D受体(VDR)通过它在其靶细胞信号。我们演示了显著抑制NK细胞引发的维生素D的存在₃。这与早期的研究一致表明,维生素D₃肿瘤坏死因子-压抑引发诱导启动子活动α在人类黑色素瘤细胞系50%比30%地塞米松抑制,以及肿瘤坏死因子-α全身引发释放和引发mRNA水平(20.]。

事实上,引发P38 map激酶抑制NK细胞分泌的敏感可能表明IL-15和维生素D₃调制引发NK细胞自分泌活动通过同样的途径。然后合理假设IL-15可能诱导引发NK细胞通过分泌刺激P38 map激酶活性和维生素D₃减少引发NK细胞分泌物通过对P38 map激酶通路阻塞的影响。尽管如此,还需要进一步的研究来证明或驳斥这一假设。总之,我们的结果可能表明如下:(1)小说角色NK细胞病理生理学的基于“增大化现实”技术通过招聘嗜酸性粒细胞,(2)小说IL-15调节作用的诱导嗜酸性粒细胞趋化性从AR患者NK细胞促分泌素的活动,(3)识别引发作为一种重要的细胞因子,导致eosinophilotactic代理NK细胞分泌,(4)表明维生素D₃可能是一种有效的治疗方法。

我们的研究结果为其他研究人员打开渠道进一步详细说明确切的机制(s)参与NK-induced引发调制IL-15和维生素D₃和P38 map激酶抑制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突与当前的工作。

确认

这项工作是由德列日大学医疗中心授予4717号。作者的感谢是由于肺学实验室的帮助anti-IL-8抗体的ElISA实验和礼物。