文摘
短效支气管扩张剂b2-adrenergic受体受体激动剂通常用于在哮喘患者症状缓解。本研究的目的是为了测试是否遗传变异PDE4D基因的关键调节器b2-adrenoceptor-induced营地营业额在气道平滑肌细胞,对短效b2-agonists影响反应。支气管扩张剂反应是在133年评估哮喘儿童基线变化百分比在一秒用力呼气量(FEV1沙丁胺醇)管理工作。分析患者进行气道阻塞(FEV1/ FVC比率低于90%,)。FEV1变化百分比调整基线FEV1值明显不同基因型之间rs1544791 G / A多态性()和−1345 C / T (rs1504982)启动子变化()。协会仍然重要,包括年龄、性别、药物特异反应性和控制器在多变量模型(和、职责)。我们的工作确定新的基因变异与哮喘治疗的调制,其中一个(rs1544791)之前与哮喘表型有关。
1。介绍
哮喘(MIM 600807)是一种常见的慢性呼吸道疾病产生复杂的相互作用的遗传和环境因素(1]。短效支气管扩张剂b2-adrenergic受体受体激动剂通常用于在哮喘患者症状缓解。激活b2-adrenergic受体(ADRB2)刺激腺苷酸环化酶导致增加环腺苷酸(营)水平。营的主要功能是激活蛋白激酶A (PKA),进而激活肌球蛋白轻链磷酸酶,减少磷酸化和生成放松2]。cAMP-activated PKA也激活和磷酸化磷酸二酯酶4 (PDE4)亚型然后降低营提供这样一个关键的急性反馈机制(2- - - - - -4]。
PDE酶,无所不在地分布在哺乳动物组织,控制许多生理过程至关重要。pde是由11个基因家族编码,每个不同的基因(包括1到4亚科5,6]。PDE4家族获得了兴趣视图的参与过程,如炎症的规定和认知3,7]。四个基因(4模拟)编码大量PDE4亚型通过激活不同的启动子或可变剪接(3,7]。气道平滑肌细胞表达的显性PDE4类型PDE4D(8- - - - - -10]。PDE4D编码的各种长期和短期亚型在图进行了概括1。长PDE4D5同种型的被证实是一个关键调节器b2-adrenoceptor-induced营地营业额在人类气管平滑肌细胞(11]。启动子的PDE4D5同种型包含一个营地响应元件(8]。慢性海拔营地因此可能导致受体的脱敏b2-agonists长期接触。这不同于急性瞬态造成的受体脱敏PKA磷酸化和激活或agonist-triggered b-arrestin-mediated招聘b2-adrenoreceptor [12,13]。实验使用基因敲除小鼠PDE4D基因进一步支持PDE4D作用调节气道平滑肌收缩性的9,14]。
因此毫不奇怪,最近的全基因组关联研究(GWAS)哮喘PDE4D是高度可信的候选基因(18]。PDE4D也与矿产相关骨密度(16),慢性阻塞性肺疾病(COPD)在日本人口(17),和中风15,19]。PDE4D联想不同表型最有可能由于多个与外显子剪接形式分散在1.5 Mb,每个监管组织和细胞特定的方式和参与多个信号流程3,7,20.]。
PDE4酶被发现的作用,控制他们的兴趣活动明显,总结在几位评论2,20.- - - - - -23]。PDE4抑制剂也已被视为一个有前途的治疗炎症的治疗气道疾病(24]。PDE4抑制剂的潜在的有益作用在临床试验中已经成功地翻译为慢性阻塞性肺病治疗(22,25,26),目前正在调查他们的哮喘控制效果(27]。
没有数据可以在这个基因的参与反应药物用于治疗哮喘。本研究的目的是测试PDE4D基因的遗传变异的潜在预测因子的响应的单剂量短效b2-agonist。
2。患者和方法
2.1。病人
患者(n= 133)是从门诊哮喘和肺诊所招募圣贾斯汀医院2007年3月至2010年9月。受试者合格如果他们是白种人,年龄在5到18年,能够执行一个适当的肺量测定的操作技术人员的监督下专门训练儿童的肺功能测试(28),会议哮喘的诊断标准(29日]。受试者合格的招聘无关地维持治疗的类型(ICS吸入型皮质类固醇激素,或白三烯修饰符)和疾病控制和严重程度无关。异位性被定义为被诊断出的湿疹和/或血清food-specific IgE和/或正皮肤测试1或多个高空过敏症或食物抗原(30.]。排除标准如下:使用长效支气管扩张剂的上个月,早产,重要的历史除了哮喘肺病,和已知的免疫缺陷。综述了研究协议和圣贾斯汀医院伦理委员会批准,并签署了知情同意每个病人的父母。
评估支气管扩张剂反应,四地吸入沙丁胺醇通过计量管理剂量吸入器(100μg /吸入)装有阀的控股室和喉舌(Aerochamber;Invacare集团、伊利里亚市美国俄亥俄州)。肺量测定法进行前(前)和15分钟后(post)接受硫酸沙丁胺醇依照美国胸科学会指南(28]。短效支气管扩张剂保留6小时前基线呼吸量测定法。报道了沙丁胺醇的响应性的变化百分比在一秒用力呼气量(FEV1沙丁胺醇后)政府:100×((FEV1(post)−FEV1(前))/ FEV1(前))。波尔加和Promadath提出的方程31日)被选为预测的计算和参考价值。
2.2。基因分型
DNA提取唾液使用Oragen装备根据制造商(DNA Genotek,http://www.dnagenotek.com)。四个snp PDE4D基因被选为分析。两个多态性,位于984年1345 (rs1504982)和−−(rs10940648)相对于第一个核苷酸PDE4D5信使rna同种型(AF12073),唯一可用的snp在NCBI数据库驻留在前2 kb地区PDE4D5转录起始站点。另外两个PDE4D多态性选择基于公布的数据:rs1544791,位于内含子2最长的PDE4D7同种型(NM_001165899.1),是一个一流的SNP GWAS的哮喘(18),另,rs829259位于3′UTR所有PDE4D亚型,在协会与成人慢性阻塞性肺病(17]。
包含多态DNA片段网站都放大了PCR总量的20 ul使用15 ng的基因组DNA, 0.4μ每个引物,140μM核苷酸,10毫米Tris-HCl (pH值8.3),2.3毫米MgCl2、50 mM氯化钾和0.4 U(铂Taq(表达载体)。放大了37个周期由30年代在94°C, 30年代在57°C,和30年代在72°C,初始变性后3分钟在95°C。基因分型是由allele-specific寡核苷酸(麻生太郎)杂交如前所述32]。引物的序列表提供用于PCR和麻生太郎1。
2.3。统计分析
FEV的变化百分比1分析了协方差分析(ANCOVA)。基因型是包括在模型中固定的因素,和基线FEV1%值作为预测连续协变量。分析局限于患者气道阻塞,例如,FEV底线1/ FVC (FVC-forced肺活量)比例低于90%33,34)(见表2对病人特点)。分层多元线性回归是用来评估rs1544791的基因型之间的联系和rs1504982包含额外的协变量(年龄、性别、特异反应性,不使用或ICS和白三烯修饰符)。通过SPSS分析(版本17.0)。
3所示。结果与讨论
病人的特点提供了表的详细信息2。哮喘的严重程度患者招募我们的研究与观察儿童哮喘管理项目(营)和白三烯修饰符或皮质类固醇或皮质类固醇氟替卡松加沙美特罗试验(LOCCS)人口35大量的药理遗传学研究中使用。表3礼物的意思是% FEV1改变根据PDE4D基因的基因型。取得了显著差异PDE4D5启动子−1345 (rs1504982,P= 0.03)和rs1544791多态性(P= 0.006)。平均% FEV1改变±SE rs1504982 C运营商为7.1±0.7和10.3±1.2,非rs1544791 G航空公司,意味着% FEV1改变±SE是7.4±0.7,13.7±2.1相比个人没有这个等位基因。协会仍然重要的单核苷酸多态性与包容的年龄、性别、药物特异反应性和控制器在多变量模型(P= 0.02,P= 0.004,职责)。
最近协会PDE4D哮喘表型(18),以及它的已知函数,使PDE4D协会的优秀候选基因与哮喘治疗的结果。PDE4D是气道平滑肌收缩性的行之有效的监管机构(9,14)和ADRB2-induced阵营监管中扮演着重要角色11]。研究在体外证明了一个单核苷酸替换cAMP-responsive元素之一PDE4D5子由定点诱变,使cAMP-driven upregulationPDE4D5人类气管平滑肌细胞表达和功能活动(8]。基于公开数据,似乎并不存在一个自然发生的基因变异PDE4D5cAMP-responsive元素。在单核苷酸多态性分析,−1345变化的PDE4D5启动子与FEV的变化有关1单剂量短效b2-agonist。FEV的变化1与rs1544791也显著相关,一流SNP在GWAS研究哮喘易感性(18]。相同的G哮喘诱发等位基因与穷人在我们的研究中有关治疗的结果。
基因结构和关系的示意图表示PDE4D PDE4D亚型在图给出1。snp检测在这个研究与各种各样的描述以及相关表型报道由其他人(15- - - - - -17]。每一个相关的表型PDE4D基因(中风、哮喘、BMD和慢性阻塞性肺病)映射到不同的连锁不平衡(LD)块。也是如此的单核苷酸多态性显著相关b2-agonist响应在这个研究。苏格兰民族党rs1544791坐落在181 kb最长的同种型内含子2 (PDE4D7 NM_001165899.1)。这个SNP驻留在75 kb长LD阻止,相隔374 kbPDE4D5转录的开始。尽管其遥远的位置,它可以作为一个远程cis-acting元素。事实上,functional-SNP数据库(F-SNP)集成信息来自16个生物信息学工具(36)预测,这可能是一个转录监管机构。我们进一步评估rs1544791等位基因表达数据集生成人类基因组单体型图lymphoblastoid (CEU)细胞株的欧洲血统37)等位基因差异在个人在哪里重整最近描述(38]。人口uc010iwj等位基因表达的差异。1isoform (also corresponding to the first few exons unique to the longest PDE4D7 isoform NM_001165899.1 [7])显著相关(P= 0.005)rs1544791基因型。SNP−1345也是公认的转录监管机构F-SNP数据库(36)和在UCSC的浏览器(http://genome.ucsc.edu)。
在分析中,我们使用% FEV1变化与基线校正FEV连续变量1%预计值而不是明确的表型反应者和nonresponders基于% FEV1高于或低于给定的预定义值变化。这样做的原因是一个可怜的应对管理之间有很强的正相关关系沙丁胺醇和高基线FEV1%预测值。自大约50%的患者在常规ICS和白三烯修饰符是20%,它是合理的假设之前这些药物治疗改善了肺功能在我们研究对象的比例,因此减少对沙丁胺醇的大小。由于道德的考虑,我们没有撤回抗炎治疗前评估,但我们因此限制我们的分析气道梗阻患者。由于气道阻塞是由降低FEV1 / FVC的比率(34)儿童通常达到值为0.9 (33],我们有限的分析患者FEV1 / FVC的比率低于阈值。另外一个策略是招募新的哮喘病人之前启动控制器的哮喘治疗。然而,早期儿童哮喘发作通常发生在幼儿园的年龄和宝贵的肺量测定的数据无法获得在学龄前儿童。一项多中心研究是必要的为了招募合适的病人的数量。
4所示。结论
此研究表明,第一次尝试探索协会PDE4D基因变异和应对哮喘b2-agonists白人儿童的治疗。结果并不一定适用于其他人群的频率检测多态性和LD结构不同(18]。如果在一个更大的研究证实,这一发现将建立在现有的知识哮喘药物基因学最终协助患者个性化治疗。
资金
这项工作是由加拿大卫生研究院的资助研究(拖把- 81154);m . Krajinvoic是背景的学者de la魁北克桑特精心设计的。支持t Pastinen CIHR和持有CRC(二级)。
确认
作者感谢所有的病人和他们的父母同意参与这项研究。他们感谢Chauhan博士Bhupendrasinh的批判阅读手稿。