文摘

的purinergic P2X7受体(P2X7R)在免疫反应起着重要的作用,参与一些活动如细胞因子释放,细胞凋亡和坏死。细菌内毒素脂多糖(LPS)是最强的一个刺激的免疫反应,这已被证明P2X7R激活可以调节LPS-induced反应。此外,提出了有限合伙人的c端结合位点。为了评估如果有限合伙人可以直接调节P2X7R的活动,我们测试了数个与P2X7R相关信号通路激活在HEK293细胞中不表达地受体。我们发现,有限责任合伙人就无法产生任何P2X7R-related活动,这表明P2X7R不是直接由内毒素激活。另一方面,preapplication LPS抑制ATP-induced电流,增加细胞内钙离子,溴化乙锭吸收没有影响在HEK293细胞ERK激活。在splenocytes-derived t调节细胞,ATP-induced凋亡是由P2X7R, LPS抑制ATP-induced细胞凋亡。完全,这些结果表明,有限合伙人调节P2X7R的活动,表明这一效应可能是生理上的相关性。

1。介绍

P2X7受体(P2X7R)是一个家庭成员的非选择性阳离子通道封闭的细胞外ATP,称为P2X受体。这种受体对其他P2X成员具有独特的属性,如低亲和力ATP及其在小鼠细胞被激活的能力通过ADP-ribosylation ADP-ribosyltransferase(艺术)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) [1,2]。与其他P2XRs, P2X7R形成大孔隙暴露在ATP的连续或高级应用,允许通过900 - da分子(如路西法黄色)通常诱发细胞死亡(综述[3,4])。这个过程似乎涉及两个通道的扩张毛孔开放更多的渠道,如pannexin-1 [5]。尽管P2X7R表达式被发现在不同的组织,包括神经元、神经胶质细胞、成纤维细胞、平滑肌和血管内皮和上皮细胞(了4]),在免疫细胞,如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和T细胞,P2X7R功能更广泛研究[6]。这种受体诱导的炎症反应是一个关键的球员在活的有机体内。例如,P2X7R拮抗剂的使用消除炎症反应的发展,有限合伙人。P2X7R淘汰赛老鼠显示低死亡率和促炎细胞因子的生产在系统性有限合伙人的挑战比野生动物(7]。相关的分子机制与炎症有关的P2X7R inflammasome活动包括感应作用,il - 1的成熟和交付β(综述[8,9])。在一些病理生理学的条件下,如细胞坏死,在活的有机体内炎症反应,在组织创伤,河畔,ATP,代谢产物是细胞外释放,达到浓度,可以激活P2X7Rs和促进细胞死亡(2]。因此,在炎症免疫细胞表达P2X7R回应事件。在这种背景下,分子可以调节P2X7R活动,如有限合伙人,也可以在这些活动过程中关键的监管角色。类似的效果提出了二价阳离子等P2X7R调节器(10,11)、内源性脂类和疏水性化合物。例如,lysophosphatidylcholine强化Ca^{2 +}涌入、细胞凋亡和ERK活化在老鼠的小胶质细胞(12];皮普₂诱发积极调制P2X7R电流(13];(BSA 11) - (5-dimethylaminonaphthalene-1-sulphonyl)氨基十一酸(DAUDA)和花生四烯酸(AA)显著增加BzATP效力和刺激ethidium积累(14]。AA也引发强劲增加ERK1/2磷酸化coapplied BzATP时,而没有观察到其他MAPKs差异(15]。多粘菌素B和明确其疏水尾积极调节P2X7R-mediated ethidium吸收(16]。同样的,各种各样的脂质增加受体激动剂效力在功能和绑定P2X7R研究[17]。独自P2X7R受体激动剂能刺激PLA2-mediated花生四烯酸的释放,和对手OATP抑制这种效应(18]。在P388D1小鼠巨噬细胞,抑制P2X7R变弱LPS-stimulated前列腺素生产,这是与减少可溶性PLA2 (sPLA2)活动和减少转录upregulation cyclooxygenase-2 [19]。,这些发现表明,P2X7R监管由脂质可以在炎症相关。有限合伙人的想法调节P2X7R活动是由Denlinger et al。20.),他发现了一个守恒LPS-binding P2X7R的网站在c端域。合成肽来自此域名可以绑定有限合伙人在体外,导致抑制LPS-induced 264.7原始细胞ERK激活(20.]。

我们的目的是确定是否有限合伙人可能调节P2X7R激活,如果生理过程有关。我们评估是否有限合伙人可以影响ATP-gated电流,细胞内钙、ERK激活,细胞凋亡在P2X7R-expressing HEK293细胞。这不同的系统并不表达地,它的主要功能是识别革兰氏阴性细菌细胞壁的有限合伙人和激活先天免疫系统21]。我们发现,有限合伙人不同调节ATP-induced活动,抑制ATP-gated电流,细胞内钙的增加,和溴化乙锭吸收,而没有影响ATP-dependent ERK激活。有限合伙人治疗还能抑制ATP-induced CD4 + CD25 +调节性T细胞凋亡,保护他们免受细胞死亡。基于这些结果,我们建议有限合伙人也可以作为监管者P2X7R活动期间炎症。

2。实验程序

2.1。动物细胞,转染的P2X7受体在HEK293细胞中

男性和女性6-8-week-old C57BL / 6小鼠从USACH获得研究设施,使用经伦理委员会批准。动物安乐死颈椎脱位,脾脏被移除在无菌条件下,和脾细胞获得丢弃红细胞通过治疗ACK缓冲溶解。脾细胞培养在RPMI 1640介质(美国加州英杰公司公司,卡尔斯巴德)补充10%的边后卫(25115年生物产业有限公司,基布兹Haemek,以色列),50 penicillin-streptomycin U /毫升,2.5μg / mL两性霉素B (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。使用的所有盐的分析程度。CD4和CD25抗体购自圣克鲁斯生物技术(克隆RM-4 PC61, resp)。BD Pharmingen生物科技公司获得了抗体CD8(加州圣地亚哥)。调节t细胞设备检测试验是获得eBioscience(加州圣地亚哥)。膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备从BD生物科学Pharmingen购买。

HEK293 U937细胞在DMEM培养基培养(美国加州英杰公司公司,卡尔斯巴德)补充10%的边后卫(25115年生物产业有限公司,基布兹Haemek,以色列),50 penicillin-streptomycin U /毫升,2.5μg / mL两性霉素B (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。老鼠P2X7R克隆到pIRES2-eGFP请捐赠的美国博士Stojilkovic (NIH,贝塞斯达,医学博士,美国)。细胞转染与lipofectamine(美国加州英杰公司公司,卡尔斯巴德)后,制造商的指示。稳定的克隆被G418孤立(EMD生物科学公司,加州圣地亚哥,美国)选择标准程序下,定期评估和表达。

2.2。电生理学

b ATP-gated电流测量AXOPATCH 200放大器在整个单元配置(美国加州分子设备),使用标准的膜片箝技术。吸管的组成的解决方案是(毫米):140氯化钾、氯化钠5 1 MgCl₂10 EGTA 10玫瑰,pH值7.2。浴的解决方案包含(毫米):140氯化钠,氯化钾,1 MgCl₂1 CaCl₂,10葡萄糖,和10个玫瑰,pH值7.4。记录吸量管有4 MΩ的阻力。命令电压控制的协议,收购pCLAMP 10.2(美国加州分子设备)通过实验室接口(Digidata 1322、分子器件、美国)。除非另有显示,膜的潜力−80 mV。坡道的协议,持有可能是0 mV,之后从120−1 s电压斜坡+ 120 mV。电流在过滤1 kHz的eight-pole贝塞尔低通滤波器(频率设备)和数字化5 kHz。内部和外部解决方案之间的液体接界电势估计为3.7 mV,减去从所有的记录。所有的实验在室温下进行;ATP是由重力灌流系统应用于细胞。数据分析与Clampfit 10.2软件(美国加州分子设备)。

2.3。细胞内钙的测定

细胞内钙测定使用cell-permeable Indo-1点或Fura-2点钙指标。Indo-transfected或控制HEK293细胞被播种在10⁵细胞在35毫米盖玻片。第二天,细胞被孵化的5μM挪作他用浴溶液中1点为1.5 h在黑暗中。细胞被洗两次与PBS和孵化与血清DMEM 1 h在黑暗中。选择单个细胞和兴奋在360 nm,和荧光检测光电倍增管在405和488海里(尼康)。每个盖玻片是只有一个细胞用于实验,和浴缸的解决方案是相同的电生理学。钙信号得到的荧光比405/488 nm。

2.4。西方的屁股,rt - pcr、溴化乙锭吸收和细胞凋亡

免疫印迹分析,P2X7R-HEK293细胞被播种在6-well盘子或22毫米collagenized盖玻片。板块与600年刺激μM ATP (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),除非另一个浓度表示。有限合伙人的挑战是使用0.1μg / mL有限合伙人大肠杆菌血清型055:B5 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)不同时期的孵化。治疗手段、方法和抗体(anti-P2X7除外)使用,和数据采集是如前所述22]。RNA PCR产物的提取和rt - PCR和可视化是如前所述[23]。放大的16 s使用特定的引物(意义:5′-GGGGTTTACGACCTCGATGTT-3′反义:5′-GCTTTAAGTATGGGCCCCCCT-3′);PCR条件94°C 4分钟紧随其后的是29日周期40年代的94°C, 50°C 40年代,20年代72°C。地放大了使用特定引物(CAACAAAGGTGGGAATGCTT 317,反义TGCCATTGAAAGCAACTCTG) PCR条件94°C 4分钟紧随其后30 98°C的周期10年代,60 2分钟,74 15 s。

确定ethidium吸收,semiconfluent P2X7R-expressing HEK293细胞孵化在PBS 37°C名义上二阶cation-free缓冲补充1%的的边后卫。10分钟后孵化,20μg / mL溴化乙锭(Amresco Inc .,梭伦,俄亥俄州)补充说,1分钟后,细胞治疗与ATP或有限合伙人。结果分析了共焦显微镜(LSM 510)使用Plan-Neofluar客观(20 x;0.5 NA;卡尔蔡司,Inc .)每15 s 30分钟,与HeNe激光激发560 nm长传球发射滤波器溴化乙锭。图片收集利用LSM 510软件(卡尔蔡司,Inc .)。

监控诱导细胞死亡,脾细胞preincubated 30分钟有或没有有限合伙人,艳蓝G (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),或A740003 (Tocris美国生物科学、Ellis-ville、钼)和60的挑战μM ATP (Sigma-Aldrich)或,除非规定的其他条件,与10%的边后卫,RPMI 1640补充50 penicillin-streptomycin U /毫升,2.5μg / mL两性霉素B,和细胞进行评估后24 h的文化。CD4 + CD25 + foxp3 +总数量进行评估在24 h后的挑战如前所述24]。在平行,细胞恢复3 h后处理和彩色识别CD4 +及CD4 + + CD25 +细胞的膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(BD生物科学)。染色细胞在流式细胞仪检测到第二章(美国,正欲新泽西)。

2.5。数据采集和分析

所有协议在两个克隆进行至少三次。ATP-induced激活并行计算与其他协议。点对点分析利用克鲁斯卡尔沃利斯测试中,邓恩期末测验。所有的数据进行了分析使用GraphPad软件(GraphPad软件公司,加州拉霍亚,美国),显示为平均值±标准错误(S.E.M)。被认为有统计学差异。

3所示。结果

3.1。Preapplied LPS抑制ATP-Evoked电流存在的边后卫

确定是否LPS诱导直接影响或调节P2X7R的活动,我们使用HEK293细胞表达系统。这些细胞不表达检测水平的信使水平通过PCR和蛋白质表面的流式细胞术规范LPS受体地(参见图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2011/152625)。ATP唤起内在的阳离子存在剂量依赖的相关性电流稳定P2X7R-transfected HEK293细胞(P2X7R-HEK293),电子商务₅₀150±58μM和最大电流密度为18.4±4.1 pA / pF。如图1,有限责任合伙人就无法触发电流(图1(一))。同样,有限合伙人coapplication(图1(一))或preapplications只要30分钟(没有显示)对ATP-induced电流没有影响。作为第一筛选LPS-potential影响,300年的浓度μ使用M ATP,接近EC₅₀,让我们来确定或正面或负面的影响。自LPS-related影响已被证明是相关的血清蛋白质LPS-binding (LBP)等因素的25),在后续的实验中,我们评估有限合伙人ATP-induced电流的影响,在1%的边后卫在细胞外记录解决方案。添加的边后卫ATP-induced电流的振幅增加但没有影响ATP亲和(EC₅₀= 169±9μM;= 60±6.1 pA / pF,)。如图1 (b),有限合伙人可逆地抑制ATP-induced电流时间的方式。ATP-evoked电流的抑制后10分钟连续有限合伙人的应用程序(图57±9%1 (c))。然后我们测试有限合伙人在整个ATP浓度响应曲线的影响。有限合伙人流离失所的曲线向右,增加ATP EC₅₀从169±9到375±17μ米(,;图1 (d))。LPS抑制ATP-induced响应测试浓度,减少55%的最大电流密度,从60±6.1±3.9 pA / pF (26,;图1 (d))。接下来,我们评估如果LPS抑制和逆转的变化相关潜在执行电压斜坡(图2(一个))。为了减少在坡道受体脱敏,我们使用300年μM ATP(我们使用相同的细胞进行坡道有限合伙人的缺失和存在)。有限合伙人ATP-induced电流的电压下降,没有潜力(逆转的变化和6.5±0.2 mV控制和LPS-treated细胞,分别地。,图2(一个)插图)。这表明,有限合伙人治疗不修改通道的渗透率。决定Ca的潜在作用^{2 +},它的浓度增加到10毫米(图2 (b))。在这种情况下,我们没有观察到的变化在细胞治疗逆转潜力有限合伙人(mV;图2 (b)插图)。总之,这些结果表明,有限合伙人调节ATP-dependent当前preapplied时无需修改P2X7R离子渗透率。

3.2。P2X7R-Mediated钙流入由LPS抑制治疗

我们的下一个目标是确定的影响有限合伙人在P2X7R-mediated电流也观察到P2X7R-mediated钙流入。ATP诱导的胞内钙浓度增加P2X7R-HEK293细胞(图3(一个));这种效应被模仿特定P2X7R-agonist BzATP(图3(一个))。LPS-mediated效果进行评估的浓度引起最大反应(600μ米),主要由P2Y逐渐脱敏的潜在反应,腺苷受体。观察到当前的录音,有限合伙人没有影响ATP-evoked反应的边后卫不存在时(图3 (b))。在1%的边后卫,LPS抑制钙增加诱发到600年μM ATP(图3 (b)时间的方式),以类似的方式观察全细胞电流(与图1 (b))。的抑制ATP-evoked瞬变7分钟后达到有限合伙人应用43±9% (,;图3 (d))。为了进一步抛弃内生P2Y和腺苷受体的贡献,我们使用了特定P2X7R-agonist Benzoyl-ATP (BzATP)。一个7-min应用LPS-inhibited BzATP-induced钙增加30%(图3 (e),)。最后,记录执行缺乏细胞外钙证实,有限合伙人影响我们观察到特定于P2X7R;内生反应最小的相比高钙增加HEK293-P2X7R细胞(图中观察到3 (f)和5。图2)。

3.3。LPS抑制ATP-Induced大孔隙和细胞凋亡

我们下一个评估如果有限合伙人可能影响大孔隙的形成。1毫米ATP诱导的溴化乙锭(EtBr)在1%的边后卫。ATP浓度被选中,是因为它被认为是诱导最大吸收。EtBr吸收时间,导致在25 - 30分钟(图最大的公司4 (b))。相比之下,没有染色观察控制(图4(一))或仅在细胞治疗有限合伙人(没有显示)。然而,有限合伙人(30分钟preapplied)显著地抑制ATP诱导EtBt吸收(,数据4(一)和4 (b))。我们下一个测试的效果有限合伙人在不同ATP浓度;图4 (c)表明,有限合伙人不断减少EtBr吸收10,60岁,100年和1000年μM ATP(化验在30分钟后ATP的挑战)。

因为这些结果间接表明LPS抑制P2X7R-mediated凋亡,我们下一个使用膜联蛋白V(一种细胞凋亡测定)证实了这一点。我们决定从内部评估凋亡细胞表达P2X7R。为此,我们使用CD4 + CD25 + Treg淋巴细胞,监管机构来自脾细胞的免疫反应。这种细胞已被证明是更敏感和显示更高的亲和力ATP与其他细胞相比,包括传统的CD4和CD8细胞。ATP-mediated影响已经证明是依赖P2X7R和浓度低至60岁μ米(24]。我们首先确定的影响ATP脾细胞总数和有限合伙人。Treg细胞死亡是评估从总脾细胞文化Treg枯竭,24小时后治疗60岁μM ATP,存在的边后卫。ATP诱导Treg细胞(图45±5%损耗5(一个))。有限合伙人仅没有诱导变化(图中未显示);然而,有限合伙人preapplied浓度测试废除ATP-induced损耗(图5(一个))。脾细胞包括多种细胞类型,包括一些LPS-sensitive,所以我们的结果不能相关专门P2X7R抑制(如T-CD4 +的多效性的增加,如图5(一个):比较第一和最后一列)。为了抛弃非特异性效应,我们评估的影响急性有限合伙人应用膜联蛋白V (AV)接触的测量P2X7R-mediated早期细胞凋亡。脾细胞与有限合伙人和挑战:经过30分钟ATP 3 h (FBS-containing介质)。之后,对CD4 +细胞被染色,propidium碘(PI)和AV通过流式细胞术和评估。ATP诱导AV + PI-population 47±10%的增长,表明凋亡细胞的数量增加(图5 (b))。没有观察到变化double-positive人口,表明这一效应在CD4 +细胞凋亡有关。有限合伙人仅没有引起任何变化;然而,它废除了AV + PI-population ATP-induced增加(图5 (b))。进一步证实P2X7R的角色,我们使用了特定的拮抗剂艳蓝G(广播)和A740003。这些对手表现类似于有限合伙人,抑制ATP-induced增加AV + PI-population(图5 (b))。这种模式也被观察到的CD4 + CD25 +人口(图5 (c))。总之,这些结果表明,有限合伙人可以保护Treg细胞从P2X7R-mediated ATP-induced细胞凋亡。

3.4。有限合伙人不修改ATP-Induced ERK激活

几个信号通路被激活后P2X7R刺激(26- - - - - -30.),包括ERK通路。我们的下一个目标是确定LPS-induced变化P2X7R-mediated ERK激活,因为它已经证明了这种效应是独立的频道活动(31日]。这些作者描述的在HEK293细胞中,ATP诱发P2X7R表达式而不是模拟细胞ERK激活(31日]。在我们的例子中,我们没有发现ATP-induced ERK激活nontransfected HEK293细胞(数据未显示),同意Amstrup和诺瓦克。在P2X7R-expressing细胞ATP诱导时间激活ERK通路(数字6(一)和6 (b))的边后卫,最大2 - 5分钟afterstimulation活化,减少后,然后保持稳定在其余的实验(图6 (b))。在类似的情况下,有限责任合伙人就无法触发这种效果(图1 (b)和增刊。图3),这表明它不能够直接激活ERK通路在细胞系统,进一步支持缺乏内生地在HEK293细胞受体。作为有限合伙人控制和测试活动地受体,我们观察到LPS激活巨噬细胞ERK通路的细胞系生264.7(增刊。图3)。更高的LPS浓度(10μg / mL)也未能诱导ERK激活(数据未显示)。接下来,我们preapplied有限合伙人为30分钟前5分钟P2X7R-HEK293细胞ATP刺激。在这种情况下,有限合伙人无法修改ATP-induced ERK激活(数据的变化6 (c)和6 (d))。同样地,我们没有观察到的差异当ATP申请15分钟(图6 (d))。总之,这些结果说明在我们的电池系统,有限合伙人不作为受体激动剂的ERK通路或调制器ATP-induced ERK通路。

4所示。讨论

在这项研究中,我们确定pre-application LPS抑制ATP-evoked电流,钙流入和延迟大孔隙形成P2X7R-HEK293无需修改ERK活化细胞。在缺乏ATP,有限合伙人不能引起任何反应P2X7R激活有关,表明LPS作为受体调制器。另外,我们观察到抑制ATP-induced调节性T细胞凋亡的有限合伙人治疗,效果被P2X7R拮抗剂逆转,表明这一现象可能的生理意义。

使用不同的实验方法,我们不断发现,有限合伙人调节过程相关的频道活动P2X7R但不是ERK激活,这一过程提出了P2X7R渠道活动的独立。Ampstrup和诺瓦克在P2X7R-expressing描述而不是控制HEK293, ATP能诱导ERK激活(31日]。此外,这种效果是保存在细胞表达突变受体不表现出通道活动,表明P2X7R可以通过多种信号通路(31日]。因此,Garcia-Marcos等人描述2受体的存在池独立参与P2X7R通道或信号活动(32,33]。这些作者认为脂质相互作用与质膜筏P2X7R域定义其下游反应很重要。看来受体出现在木筏的独家信号转导(如ERK的磷酸化),而nonraft P2X7Rs行为主要是离子通道(综述(33])。在这种情况下,有限合伙人可能诱发的relocalization P2X7R,减少池受体能够被激活的通道。

LPS-induced抑制P2X7R渠道活动的具体机制还不清楚;然而,一些看似合理的解释认为,假定的c端LPS-binding网站(残留物,573 - 590年),最初被Denlinger et al。20.,34]。这个领域似乎是高度功能性鉴于肽来源于这个序列可以绑定有限合伙人在体外264.7原始细胞和抑制LPS-induced ERK激活(20.,34]。有人建议,这种表型与受体的改变交易,损害P2X7R表达式在质膜。在这种情况下,它是合理的假设在我们的实验条件下,有限合伙人是绑定在P2X7R其假定的网站,干扰正常的交易和组合在细胞表面受体。这种机制可以解释逐渐减少电流和钙瞬变以及抑制BrEt吸收后,我们观察到有限合伙人申请P2X7R-HEK293细胞。我们实验室正在进行的实验将在以后的工作中解决这个问题的可能性。

虽然有限合伙人的直接互动与P2X7R似乎最合理的机制,也有可能有限合伙人的影响是间接的,除了通常由蛋白质(35]。这些假定的目标包括协同依赖性的激活inflammasome (P2Xs和通常的激活36),可能与P2X7R-pannexin-1复杂,半胱天冬酶的激活和炎症介质的生产37,38]。Ectonucleotidase抑制由有限合伙人(39- - - - - -41]似乎并没有包括在我们的实验条件;它已经表明,ATP退化似乎越来越不显著(14]。不能排除这个可能性,有限合伙人可以直接与ATP交互,减少其免费的浓度。然而,有大量的证据表明,脂质可以调节P2X7R,无论是积极的还是消极的(别构增效剂或抑制剂),这表明这些分子与受体地区可以直接交互,从而发挥他们的调节效应13- - - - - -16]。这将是有趣的,以确定在脂质结构影响P2X7R细微的修改。未来的调查将有助于澄清和确定结构活性关系,包括与其他有限合伙人可能研究血清型。

在我们的手中,LPS抑制P2X7R活动当细胞与LPS预处理。在小胶质细胞中,有限合伙人没有显著影响P2X7R-mediated电流虽然Raouf等人观察到电流下降的趋势(42]。本研究之间的明显差异,我们的工作可以解释的事实Raouf等人进行的电生理记录缺乏血清(42]。有限合伙人如何发挥其对细胞的影响还不清楚。有限合伙人有复杂的模式来诱导细胞的激活,包括几个进入细胞的途径。它的内化,是依赖资源43),包括clathrin-coated囊泡(44- - - - - -48],macropinocytosis [49),noncoated质膜内陷(43),并通过特异性的内吞作用也会发生。一旦细胞内,有限合伙人已经检测到核内体,时间,溶酶体、高尔基氏复合体44- - - - - -48),和细胞质50,51]。然而,有限合伙人的机制通过细胞的质膜是未知的。

在我们的研究中,我们不断发现的边后卫ATP-induced电流的振幅增加。虽然我们没有详细研究这一点,我们可以推断血清组件,如细胞因子、生长因子和其他蛋白质负责这一效应。之前,米歇尔等人报道,血清,特别是白蛋白,可能影响的亲和力P2X7R BzATP,衡量吸溴化乙锭(14]。最近2免疫复合物被确认为P2X7R活化剂。血清淀粉样蛋白(SAA)可以诱导pro-IL-1的表达β和激活的NLRP3 inflammasome通过P2X7R [52]。同样人类cathelicidin-derived肽LL37诱发成熟和释放il - 1β通过P2X7R LPS-primed单核细胞(53]。这些化合物可能存在于血清和修改P2X7R活动。另一种可能性是螯合二价阳离子的血清的能力,来抑制P2X7R。是高度相关的标识(s)血清组件负责影响P2X7R机制,并确定影响受体的活动。

P2X7R监管机制的作用与炎症相关。法拉利等人首先表明,ATP强化翻译后加工和il - 1的释放β从有限合伙人启动细胞,P2X7R扮演重要的角色在这个过程54]。这进一步支持了P2X7R KO小鼠显示亏损ATP-dependent免疫功能(7,55]。此外,P2X7R KO小鼠Foxp3-expressing CD4 + CD25 +细胞的数量增加的血液循环和淋巴器官,表明P2X7Rs可能在t细胞内稳态中发挥作用6,56]。在这方面,它已被证明,P2X7R激活导致快速细胞死亡的一大部分CD4 + CD25 +人口,没有显著影响其他T细胞的数量(24]。在他们的研究中,Perregaux Gabel认为这些戏剧性的敏感性的差异似乎T细胞相关的存在P2X7R [57与我们的结果),在协议。基因序列分析表明高表达P2X7Rs Treg细胞相比传统t效应细胞(58)细胞内和细胞的敏感性,和鼠标与P2X7R表面应变显示相关表达式(59]。在这种情况下,大量的ATP可以是非常有害的,导致细胞凋亡的诱导,损害炎症和免疫反应。鉴于P2X7R LPS-stimulated IL -配体也可以影响β释放,离子通量,磷脂酶和转录因子的激活,蛋白激酶级联,和细胞凋亡,调节这些活动应该调整。

总之,我们的研究结果提供的证据有限合伙人的生理相关性的调制器P2X7R通过其假定的胞内结合位点。这个过程可能是相关的炎症或感染过程期间,在细胞外ATP可用性高和/或维护。有限合伙人的存在在这些条件下可以对信号转导通道活化和细胞凋亡,导致一个更高效的响应对病原体。

确认

作者感谢博士Stanko Stojilkovic和安德烈斯博士Stutzin对本文的评论,半径标注Marcela Hermoso地抗体,博士Jaime Eugenin A74003,曼吉梅内斯,费利佩•雷耶斯贝尔基卡号Villegas, Yohana外唇,卡罗莱纳Beltran),基诺Nardocci技术援助。这项工作是由FONDECYT 11070117, DICYT USACH,和提高。一个。廓羽和e·莱。Salcedo是由细胞的分子研究中心,FONDAP 15010006。C。Coddou由校内研究项目,美国国立卫生研究院的国家儿童健康和人类发展研究所。j.p. Huidobro-Toro得到了j . v . Luco细胞中心监管和病理学;年基本和应用生物学研究所(MIFAB)也导致了中心的资金。这项工作在阿方索萨利纳斯的记忆,里卡多·卡斯蒂略和露丝一。特别要感谢乔治·蒙哥马利先生校对。 E. Leiva-Salcedo, C. Coddou, and F. E. Rodríguez contributed equally to this work.

补充材料