文摘

在这项研究中,我们调查了在雌性BALB / c小鼠注射组Crotalus什麽terrificus毒液(Cdt基于肌酐清除率)肾功能,分数的百分比排泄肾组织的细胞因子和组织学检查。Cdt引起肾功能改变引起的蛋白尿在初始时间post-venom和肌酐清除率下降15分钟。2小时post-venom管理。尿液从老鼠注射Cdt诱导il - 4水平下降。更明显的增量IL-5、il - 6和干扰素-γ分别观察后15 - 30分钟。观察TNF和il - 10的最高水平1和4 h,分别。赞成的比率和抗炎细胞因子在动物注射Cdt,这可能是体现在炎症状态下毒。在治疗组动物Cdt观察的降低肌酐清除率及其对肾小球滤过率的影响伴随着部分排泄减少细胞因子和形态学的干扰。这种变化有选择地在表面变质损失可能解释了为什么相对分泌的细胞因子蛋白总量的减少而增加。在结论部分细胞因子的分泌是显著降低小鼠注射Cdt,尽管蛋白尿。

1。介绍

蛇毒生物行为,提出了化学成分、毒性、药物动力学和药效学特征是复杂的混合物毒素,如神经毒素、myotoxins,西江水,肾毒素和坏死毒素。重要的是要理解,实际的混合毒素在毒液不同由个别物种以及年龄和季节(1]。巴西Crotalus什麽terrificus蛇负责许多临床病例的下毒。它的毒液含有多种有毒蛋白质包括crotoxin crotamine, gyroxin, convulsin,类似酶(2,3]。表面变质引起的Crotalus蛇会导致严重的并发症和系统性等改变出血,肝毒性,myotoxicity,低血压,急性肾功能衰竭和休克4- - - - - -7]。已经与肌肉分解、溶血、低血压和/或直接毒液肾毒性(7]。这种毒液myotoxic活动导致横纹肌溶解的发展可以跟着骨骼肌损伤和肌酐磷酸激酶的释放,乳酸脱氢酶和肌红蛋白8]。蛇咬伤后急性肾功能衰竭的发病机制似乎是多因素疾病,如出血、低血压、循环衰竭、血管内溶血,传播血管内凝血,也直接肾毒性的毒液8,9]。这些影响被定义为肾功能恶化通过高程在血尿素氮和血清肌酐,干扰在电解质和酸碱体内平衡,和含氮废物的保留,发生在数小时或数天或周(9]。急性肾功能衰竭是一种常见的并发症观察到受害者的毒蛇咬伤事故。评估肾功能参数粗毒液后政府建议直接影响肾小球滤过率、含氮废物的缓慢而稳定地积累,和一个肾脏无法调节的平衡钠、电解质,酸和水10- - - - - -13]。形坝等。14)表明,静脉注射和腹腔内管理c . vegrandis粗毒液引起损害,包括近端小管的面积和小血管损伤肾小球毛细血管内皮细胞在缺乏血红蛋白作为其行动的目标。

肾脏器官帮助排除毒素,由于其高血流量和其物质集中在尿液的能力。众多在体外和在活的有机体内研究肾发炎都伴随着更好的理解当地的表型变化和多功能势和浸润细胞内的炎症。包括激活、过渡,可塑性,附着力,贩卖住宅细胞,和浸润炎症细胞如中性粒细胞,单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞。这些细胞释放炎症介质,包括不同的粘附分子,蛋白酶降解酶、氧自由基,一氧化氮,趋化因子,生长因子,不同类型的细胞因子。临床和实验动物研究表明,肾可以调节炎症炎症介质(15,16]。

本研究的目的是确定尿组老鼠的细胞因子水平与不同数量的治疗Crotalus什麽terrificus毒液和检查il - 6的作用,il - 10, TNF -α在venom-induced急性肾功能衰竭的发病机制。生产的促炎细胞因子il - 6和TNF -α负责发起对外源性刺激的作用。然而,过度生产的这些介质可能显著导致休克、多器官功能衰竭和死亡(17- - - - - -21]。相比之下,抗炎细胞因子il - 4和il - 10表达下调的关键是增加炎症过程和维持体内平衡的重要器官的正确功能(21,22]。

2。材料和方法

2.1。化学物质、试剂和缓冲区

放线菌素D, orthophenyldiamine(门诊部当),胎牛血清(FCS)和rpmi - 1640中型买来σ(圣路易斯,密苏里州,美国),小鼠anti-IL-4(克隆11 b11和BVD6-24G2)重组il - 4,小鼠anti-IL-5(克隆TRFK5和TRFK4),重组IL-5,小鼠anti-IL-6(克隆MP5-20F3和MP5-32C11),重组il - 6,小鼠anti-IL-10(克隆JES5-16E3和SXC-1),重组il - 10和小鼠anti-IFN -γ(克隆XGM1.2和R4-6A2),重组干扰素-γ买来BD生物科学Pharmingen(美国),和重组TNF购买勃林格曼海姆(德国曼海姆)。

2.2。毒液

冻干的毒液Crotalus什麽terrificus(Cdt从实验室获得的爬虫学,Instituto Butantan SP、巴西和储存在−20°C。毒液是溶解在无菌生理盐水(0.85% (w / v)氯化钠溶液)立即使用前。

2.3。动物

雌性BALB / c小鼠(6 - 8周大,体重13到15 g)在Bioterio-Facultad de药物维持,UAEM(库埃纳瓦卡,墨西哥)。动物被维护和使用严格的伦理条件下根据国际动物福利委员会成员建议国际社会在毒理学23]。

2.4。杀伤力化验

概率单位法用于计算致死剂量50 (LD50)的Cdt毒液。小鼠体重13到15 g腹腔内(i.p)注射0.1毫升的各种浓度的毒液,和老鼠死亡的数量清点后48 h。老鼠的数量在每个剂量使用四(24]。

2.5。血液和尿液生化
2.5.1。血液采集

组雌性BALB / c小鼠13 - 15 g是注入intraperitoneously (i.p)与不同数量的Cdt溶解于0.1毫升的生理盐水。控制老鼠收到0.1毫升的生理盐水。注射后不同时间Cdt,动物被retro-orbital丛流血。血液样本被允许站,直到他们形成凝块,和血清用于生化分析(24]。

2.5.2。尿液收集

老鼠置于代谢笼用充足的水,但没有固体食物。这些动物腹腔注射不同剂量的Cdt毒液,复苏的尿液收集管在冰上。小鼠产生的平均0.05 - -0.100毫升尿液/鼠标在不同的时期。尿液收集后将删除任何固体碎片,储存在−70°C到批ELISA细胞因子进行了测量。

2.5.3。肌酐水平

存在于血清和尿液从控制老鼠或注入了不同数量的Cdt毒液测定使用特定工具(Spinreact诊断、桑特的埃斯特乌德Bas、西班牙),根据生产的协议(24]。

2.5.4。肌酐清除率

肾清除率( )使用标准的计算公式: (μL / min / 100 g) 是尿浓度, 尿量/分钟, 每个点的血清肌酐水平。

2.5.5。分数的百分比排泄物

指示器间隙口粮使用公式计算: ,在那里 细胞因子浓度(TNF、il - 6、il - 10、il - 4和干扰素-γ)。

2.6。蛋白质的测定

总尿蛋白排泄决心如前所述Timoshanko和小费25]。总之,老鼠单独住在笼子里管理之前收集尿液Cdt,自发空心尿收集在不同的时间。尿液样本稀释1% 5-sulfosalicylic酸,蛋白质浓度测定spectrometrically的波长550 nm和与已知的白蛋白标准。

2.7。介质的生产
2.7.1。细胞因子

细胞因子il - 4水平,IL-5, il - 6、il - 10和干扰素-γ存在于从BALB / c小鼠尿液化验由two-site三明治enzyme-like免疫吸附试验(ELISA) [26]。简单地说,ELISA板涂有100人μL (1μg / mL)的单克隆抗体anti-IL-6, anti-IL-10或anti-IFN -γ在0.1 M碳酸钠缓冲区(pH值8.2)和孵化6 h在室温下。然后洗井和磷酸盐(PBS / Tween-20) 0.1%,与100年了μL 10% FCS在PBS在室温下2 h。洗后,重复50尿液样本μL被添加到每个。在4°C 18 h的孵化后,与100年井被清洗和孵化μL (2μg / mL)的生物素化的单克隆抗体anti-IL-4 anti-IL-5 anti-IL-6 anti-IL-10或anti-IFN -γ作为第二抗体在室温下了45分钟。最后一个洗后,反应是由添加门诊部当每个。光密度测量在405纳米微型板块读者。每个样本的细胞因子的内容读取标准曲线建立适当的重组细胞因子(表达毫微克每毫升)。每个细胞因子检测到的最低水平的条件分析是干扰素- 10 pg / mLγ、il - 4和IL-5 il - 10、il - 6和5 pg / mL。

测量肿瘤坏死因子存在于尿液样本的细胞毒性,一个标准的试验用L929细胞,成纤维细胞连续细胞系,使用前面描述的飞边和吉福德(27]。细胞毒性百分比计算如下: 。浓度计算的互惠稀释的样本中,50%的细胞层细胞溶解。TNF活动表示为pg / mL估计的比率50%的细胞毒性剂量测试标准的鼠标重组TNF。

2.8。组织病理学分析

治疗后左、右肾都固定在10%多聚甲醛/ PBS (pH值7.4)。器官是嵌入在石蜡,部分厚度4μ米被旋转切片机切。幻灯片是苏木精和伊红染色(H & E),在光学显微镜下检查使用 或 镜头。捕获的图像耦合装置摄像头和出口到Adobe Photoshop 7.0。

2.9。统计分析

数据表示为平均值±标准偏差。通过学生的统计分析 以及,和水平的意义 。

3所示。结果

不同剂量的影响Crotalus什麽terrificus毒液通过检测分析了死亡率和蛋白质的水平,肌酐,尿中细胞因子雌性BALB / c小鼠13 - 15克的体重。

3.1。Cdt对致命性的影响

我们先前描述,1 LD50雌性BALB / c小鼠体重13 - 15 g对应0.01毫克/公斤(数据没有显示)。组动物接受0.5和1 LD50的Cdt分别,死亡率为0%和50%,(数据没有显示)。相比之下,组的小鼠注射2和2.5 LD50的Cdt分别观察到的死亡率是90%和100%,(数据没有显示)。死亡之前通常是某些信号,或症状观察,观察组死亡率最高百分比的老鼠注射1到2.5 LD50在4 - 6之间hs(数据没有显示)。

3.2。不同的LD的影响50Cdt的尿蛋白、肌酐清除率和细胞因子的生产

为了确定蛋白质的水平,肌酐清除率,和细胞因子存在于尿液,一群老鼠注射不同的LD50的Cdt毒液对不同的时期。如图1水平的蛋白质存在于尿液从老鼠处理Cdt相比明显高与尿液中获得控制老鼠,和这些增量是剂量依赖性(图1)。肌酐清除率中观察到治疗组鼠不同数量的Cdt显著降低与对照组相比(图1)。的能力Cdt诱导细胞因子的生产水平如图2。组间的老鼠接受0.5 LD50的Cdt尿il - 4水平,IL-5, il - 10与对照组相比显著升高( )。尿il - 6水平和干扰素-γ与不同的LD的礼物老鼠ip管理50的Cdt明显低于获得尿液从对照组(图2)。这两种细胞因子的减少观察摄入量有关。TNF的最高水平观察尿液的老鼠注射1和2 LD50(图2)。也有可能观察到的增量毒液浓度il - 4的水平,IL-5, il - 6、il - 10和干扰素-γ明显下降而获得的尿液从对照组( )。

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图1
蛋白质存在于尿液和肌酐清除率。一群雌性BALB / c小鼠注射与不同数量的ipCdt对不同倍以上。尿液中蛋白质的存在是由测量白蛋白。在尿液和血清肌酐水平检测小鼠注射不同数量的Cdt1 h。这个公式来确定肌酐清除率中描述部分2。每个酒吧代表四个实验样本的平均值不同组的五个老鼠。统计差异处理( )。
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图2
细胞因子分泌尿液从雌性BALB / c小鼠。尿液的老鼠获得ip注射后不同数量的Cdt如上所述。IL-5的水平测定15分钟后,il - 4、il - 6、il - 10,和干扰素-γ后1 h。他们被ELISA分析化验使用单克隆抗体作为探针。TNF水平确定后1 h标准与L929细胞试验。每个酒吧代表四个实验样本的平均值不同组的五个老鼠。统计差异处理( )。
3.3。Cdt对肾小球滤过率的影响

这些结果,可以建立炎症的进化和肾损伤小鼠治疗Cdt。因此,下面的一组实验来确定的影响Cdt对肾脏功能组雌性BALB / c小鼠体重的13 - 15 g注射1 LD50的Cdt在不同的时间段,尿液收集。

时间的尿液中蛋白质的存在从小鼠注射1 LD50的Cdt表所示1。蛋白质的含量在15分钟后开始出现组小鼠腹腔注射Cdt。最大数量的蛋白质观察尿液的老鼠注射Cdt1 h,腐烂。在这个时候,大量的蛋白质存在于尿液从老鼠注射Cdt相比明显不同,当我们获得的尿液从对照组( )。然而,48 h后蛋白尿水平有明显恢复。肌酐的水平开始增加15分钟组老鼠注射1 LD50的Cdt。从小鼠注射尿肌酐水平Cdt相比,那些获得毒液显著高于对照组(数据没有显示)。如表所示1肾肌酐清除率下降,进步最大1 - 2商品postvenom注入了48 h后回到基底的水平。

表1
时间的尿液中蛋白质和肌酐清除率。

在图3显示细胞因子存在于尿液的动力学。il - 4的水平存在于尿液从动物治疗组Cdt是与那些来自对照组相比显著降低( )。IL-5 15分钟后达到峰值水平Cdt管理、腐烂之后(图3)。最高水平的il - 6在尿液从小鼠注射1 LD50Cdt30分钟后观察,腐烂之后(图3)。肿瘤坏死因子的水平开始出现在尿液从30分钟后小鼠注射Cdt2 h。肿瘤坏死因子存在于尿液的浓度明显高于从尿液从对照组( )。干扰素的最高水平γ尿液中观察后30分钟Cdt管理、腐烂之后(图3)。尿液中il - 10的水平开始出现后30分钟到4 h,腐烂。细胞因子的水平明显高于获得控制老鼠( )(图3)。

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图3
细胞因子的动力学。一群雌性BALB / c小鼠腹腔注射1 LD50的Cdt对不同倍以上。在尿液和血清细胞因子分泌的水平决定节中描述2。每个酒吧代表四个实验样本的平均值不同组的五个老鼠。统计差异处理( )。

这种不平衡的免疫介质与促炎细胞因子的不适当的增强,甚至减少抗炎介质被公认的肾脏功能障碍的病理生理学中起着重要的作用。赞成/抗炎的比率计算。干扰素-γ/ il - 4,干扰素-γ/ il - 10、il - 6 / il - 10比值逐渐增加,在15 - 30分钟达到最高,分别和腐烂之后(图4)。最高的肿瘤坏死因子/ il - 10比值在1 h后观察Cdt政府(图4)。

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图4
平衡赞成/抗炎。尿液水平的细胞因子测定节中描述2。干扰素的比率,γ/ il - 4,干扰素-γ/ il - 10、il - 6、il - 10和TNF、il - 10代表两个实验样本的值在不同的五组老鼠。

的分数排泄物质代表物质的比例在尿液中排出而肾小球过滤的。计算分数的排泄有助于理解是否增加血清水平的分析是由于增加生产或减少排泄。在这项研究中,细胞因子测量的分数排泄细胞因子在尿液中排出的百分比与细胞因子肾脏重吸收的决心。它是测量血清和尿液细胞因子的终点站。我们先前描述的存在il - 4、IL-5白介素、肿瘤坏死因子、干扰素γ,从女性血清中il - 10 BALB / c小鼠注射Cdt(24]。部分分泌的细胞因子计算是评价急性肾功能衰竭的一部分。分数的百分比的il - 4和干扰素-排泄γ减少动物群体中治疗30分钟(图5)。部分分泌的il - 6在动物群体治疗减少了15分钟Cdt(图5)。分数的百分比的排泄TFN的-α类似于控制1 h后Cdt管理。如图5肿瘤坏死因子-分数的百分比排泄α在组显著降低动物对待Cdt1到2 h。对部分分泌的il - 10的比例,比例高1 h后观察Cdt管理、腐烂之后(图5)。百分比分数排泄的48 h后细胞因子有明显恢复。

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图5
比例的部分细胞因子的分泌。一群雌性BALB / c小鼠腹腔注射1 LD50的Cdt对不同倍以上。分数的百分比排泄决心节中描述2。每个点代表四个实验样本的平均值不同组的五个老鼠。统计差异处理( )。
3.4。Cdt对肾损伤的影响

评价肾损伤的小鼠注射1 LD50的Cdt不同时间间隔的时间都牺牲了,肾脏组织学检查。肾损伤的程度分级半定量的至少30截面/老鼠按照下列特点:肾小球病变、肾小管空泡形成,肾小管扩张,肾小管坏死,白细胞浸润。的肾脏组织学评价组注射的老鼠Cdt如图6。肾脏的组织学评估对照组显示良好的保存(数据没有显示)。Cdt注射导致弥漫性肾变化特点是严重的管状损伤和主要观察管扩张,形成整个皮层,温和的额外的毛细管,肾小球内细胞、系膜扩张,增加肾小球大小(图6)。退行性变化被认为在近端小管4 h后毒液注入。这些变化被认为是近端刷状缘,细胞质空泡形成,在某些小管,变性和坏死细胞的脱屑。

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图6
组织学分析。一群雌性BALB / c小鼠腹腔注射1 LD50的Cdt对不同倍以上。细胞因子的水平测定尿液中节中描述2。每个点代表四个实验样本的平均值不同组的五个老鼠。统计差异处理( )。

4所示。讨论

在巴西,Crotalus什麽terrificus在人类中大多数的事故负责。的病因Crotalusvenom-induced人类和实验动物的急性肾功能衰竭仍然没有完全理解但可能涉及到直接行动的毒液组件在肾小管和肾上皮细胞。引起的急性肾功能衰竭的发病机制Crotalus毒液是多因素疾病。已经关联到与缺乏系统性因素以及直接肾毒性与随后的横纹肌溶解释放从受损的骨骼肌肌红蛋白血清和尿液,其肾毒性可能导致急性肾小管坏死(28- - - - - -31日]。

为了建立最优条件肾inflammation-venom交互,的影响Cdt水平的蛋白质、肌酸酐和尿液中细胞因子进行了研究。这项研究表明,后Cdt注射观察尿液中蛋白质的增加,这些变化和剂量依赖的毒液。急性肾功能衰竭是一种临床实体,其特征是肾小球滤过率的急剧下降,会导致各种各样的肾损伤32]。我们先前描述的存在血清中肌酐(24),血液和尿液肌酐水平的组合可用于计算肌酐清除率。在这项研究中我们证明了肌酐清除率降低组治疗的老鼠Cdt2小时48 h后返回到基础水平。这些结果符合其他作者所描述的,在与蛇从表面变质Crotalus和具窍蝮蛇属属了可逆的肾功能变化(29日,32,33]。

细胞因子在起始和调制扮演关键角色的肾脏炎症反应通过他们的能力调节辅助T 1 / T辅助2 nephritogenic免疫反应的平衡。T细胞积极参与肾脏损伤和Th1表型主要产生TNF -α和干扰素-γ(34- - - - - -36]。的贡献Th1细胞在肾脏病理T-cell-deficient动物中描述,缺乏一个转录因子促进Th1细胞分化[37,38]。肾小球肾炎等肾脏炎症和tubulo-interstitial肾炎可能发生急性炎症反应作为一个孤立的地方或作为一个系统性炎症疾病,通常导致间质纤维化、肾小管萎缩,肾小球如果不及时治疗或自发地修复。炎症介质产生和分泌在最初几个小时可以诱导器官衰竭和损害。在目前的研究中我们观察了急性肾衰竭小鼠腹腔注射1 LD50允许手术和生理测量的毒液幸存者的动物。此外,这个剂量的Cdt,可以评估肾功能。在30分钟,表面变质导致海拔在尿il - 6,干扰素-γ、TNF和il - 10浓度。肾肌酐测定的间隙1 - 2 h后Cdt管理。肾小球失败率明显减少2 h后毒液管理。与其他炎性细胞因子il - 6通常诱导一起可能影响il - 6信号及其生物效应(38]。在协议中,il - 1β肿瘤坏死因子-α,il - 10 il - 6信号干扰和降低其抗炎作用[38]。因此,il - 6的功能作为一个职业——或抗炎细胞因子也与其他炎性细胞因子的存在与否。条件下使用在目前的研究中,我们观察到的注入Cdt可能改变细胞因子的生产。il - 6的水平和干扰素-γ存在于尿液减少剂量依赖性的方式。相比之下,il - 4的最高水平,IL-5, il - 10组老鼠注射0.5中得到LD50的Cdt。观察TNF的最高水平组老鼠注射1 LD50。

研究旨在评估肾脏的作用清除脓患者的炎性细胞因子显示肾脏移除一些来自血浆促炎细胞因子在疾病的发作,只要利尿维护(39]。然而,在先进的败血症,其特征是急性肾功能和少尿,一些炎性细胞因子的分级排泄下降,而且,因此,他们的血浆浓度上升40]。在人类中,肾脏的作用在控制细胞因子体内平衡是良好的40]。肾脏优先过滤器等较小的促炎分子< 20 kDa,少容易过滤器更大的抗炎细胞因子,目前> 20 kDa和可溶性细胞因子受体(41]。在这项研究中,我们表明,细胞因子、肿瘤坏死因子-α和il - 10分泌尿液,在高和低水平。此外,过滤后的促炎细胞因子,不排出尿液中完整但被吸收在近端肾小管变性,细胞内蛋白水解机制(42]。

赞成的比率/抗炎细胞因子表示细胞的炎症状态。这一研究获得的结果显示尿的赞成和抗炎细胞因子之间的平衡,这可能代表炎症状态下毒处理后4小时Cdt管理。基于这些发现抗炎细胞因子水平较低和高水平的促炎细胞因子与死亡率增加有关,似乎明显,赞成和抗炎细胞因子之间的平衡与器官功能有关,由测量评估肾脏功能。因此,在血液和尿液肌酐水平可用于计算肌酐清除率反映肾小球滤过率,是临床上重要的,因为它是肾脏功能的测量。上尿路梗阻对肾脏有害影响,人类是肾功能不全的重要原因。在这项研究中从envenomated小鼠肾脏的组织学分析显示断裂和脱落的肾小管上皮细胞进入小管腔可能导致蛋白尿。改变最初观察到肾脏功能是可逆的;然而,随着持续伤害这些组织学变化转化为一个永久的损失在肾功能43]。的检测b .虫毒液在肾小球和近端和远端肾小管同意造成的形态学和组织学损害毒液在这些解剖区域和显示之间有紧密的相关性毒液的网站本地化和随后的损害(33]。

总之,我们的结果表明,在收集尿液从老鼠注射Cdt细胞因子的水平,与对照组相比降低。毒液的细胞定位及其动力学在肾组织同意各种venom-induced形态和功能变化。

承认

这项工作是支持的Secretaria de Educacion上市(SEP-PROMEP),墨西哥。