文摘
Keishibukuryogan (KBG)是一个传统的草药配方广泛管理患者血液停滞,改善血液循环;目前,它在日本是最常见处方的药。KBG报道提高连结的微循环。本研究的目的是评估KBG和芍药苷的作用,KBG生物活性化合物,抑制炎性细胞因子的生产使用人类皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)。作者观察到,脂多糖(LPS;1μg / mL)在HDMECs刺激促炎细胞因子的分泌。KBG治疗(10毫克/毫升)显著抑制的mRNA水平移动抑制因子(MIF)、白介素6 (IL),引发,肿瘤坏死因子(TNF)α在LPS-stimulated培养HDMECs。同样,芍药甙显著抑制这些细胞因子的mRNA水平LPS-stimulated培养HDMECs。ELISA表明KBG和芍药苷抑制生产MIF、il - 6,引发,TNF -α在LPS-stimulated HDMECs。此外,KBG和芍药苷降低cyclooxygenase-2的表达和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)在这些细胞。这些结果表明,KBG可能有助于改善微血管炎症皮肤病患者。
1。介绍
Keishibukuryogan (KBG Gui-zhi-fu-ling-wan中文)是邮政寿险局药品之一,并被广泛用于患者血液停滞,改善血液循环。KBG现在在日本最常用的药物之一。KBG临床已用于治疗各种疾病,包括皮肤疾病。据报道,KBG改善连结的微循环脑脊髓血管疾病患者(1),从而表明它可能有益影响血液参数如血液粘度和红细胞可变形性(2- - - - - -4]。此外,松本等人研究的蛋白质组学方法诊断类风湿性关节炎患者的血瘀KBG [5]。此外,KBG用于治疗周围缺血的症状如冰冷的四肢(6]。此外,我们最近报道,KBG慢性色素紫癜患者是有效的,一群皮肤血管疾病病因不明的7]。
KBG由五个药用植物,肉桂布卢姆(肉桂的皮层),芍药帕拉斯(Paeoniae基数),牡丹安德鲁斯(牡丹皮层),碧桃等(Persicae精液)和茯苓狼(Hoelen)(表1)[8]。Paeoniae基数和牡丹皮层有许多已知的活性成分的共同点,包括芍药苷、芍药醇,oxypaeoniflorin, benzoylpaeoniflorin, palbinone [9]。芍药苷是主要特点Paeoniae基数的主要生物活性成分,其中包括大约5.57% (w / w)芍药苷、和牡丹皮层,其中包括大约3.96% (w / w)芍药苷(10]。芍药苷已报道有很多药理作用,如抗炎和抗过敏药效果(11]。最近,郑和魏报道,总糖甙存在于牡丹皮层,含有芍药苷为原则生物活性成分,抑制主要和次要胶原诱导关节炎和炎症adjuvant-induced关节炎(12]。
直到现在,外用和口服糖皮质激素口服生物黄酮素,抗坏血酸,灰黄霉素、环孢霉素被认为是治疗慢性色素紫癜(13,14]。然而,这些治疗方法已被证明是令人满意的。人类皮肤微血管内皮细胞(HDMECs)是著名的细胞在皮肤真皮。HDMECs产生炎性细胞因子,如白介素(IL) 6和引发当他们暴露在脂多糖(LPS)。因此我们认为考试的影响KBG和芍药苷HDMECs对慢性色素紫癜的治疗的研究很重要在体外。
在这项研究中,我们旨在评估KBG和芍药苷的作用,使用HDMECs ininhibiting炎性细胞因子的产生。
2。材料和方法
2.1。材料
KBG (TJ-25)获得Tsumura &有限公司(日本东京)。KBG是悬浮在CS-C完全培养基含有10%的胎牛血清和1%的青霉素和CSC生长因子(细胞系统公司,佤邦)和旋转在一夜之间4°C (11]。然后,暂停离心机,上层清液过滤是0.45μm-pore膜。以下材料来自商业来源:等基因RNA提取设备从日本获得基因(日本东京);M-MLV逆转录酶是从GIBCO(大岛,纽约);Taq DNA聚合酶是从优秀(诺沃克有限公司);有限合伙人购买从σ(圣路易斯);尼龙膜来自Schleicher & Schuell(基恩,NH);anticyclooxygenase-2 (cox - 2)多克隆抗体(帕布)从细胞信号技术,购买Inc .(波士顿);antiinducible NOS(间接宾语)帕布从恩佐购买生命科学国际有限公司(纽约);反β肌动蛋白Ab是购自圣克鲁斯生物技术有限公司(CA);芍药甙从LKT实验室有限公司;MIF、il - 6和引发ELISA试剂盒获得从研发系统(明尼阿波利斯);和免疫印迹检测系统获得的细胞信号技术(贝弗利,MA)。其他试剂均为分析纯。
2.2。细胞刺激
主要人类真皮血管内皮细胞(HDMECs)从细胞获得系统公司(WA)。HDMECs在条件内皮细胞培养基培养(CS-C完全培养基)含10%胎牛血清和1%青霉素和CSC生长因子在37°C公司5%2的气氛。细胞生存能力评估的治疗之前总是超过95%台盼蓝染料排除测试。当天实验,收集细胞和悬浮在新鲜培养基的浓度1×106细胞/毫升。细胞被分为4组:对照组,一组接受10毫克/毫升的KBG或100年μ克/毫升的芍药苷(如前所述9,15),一组治疗1μ有限合伙人的g / mL,另一组接受的组合。细胞治疗与各种代理,针对每个过程描述和分析。
2.3。MTT试验
细胞的数量是衡量一个MTT试验。简单地说,媒体被移除的愿望,然后细胞dimethylthiazol-2-yl-2服用0.5毫克/毫升、5-diphenyltetrazolium溴化(MTT,σ)的培养基为4小时37°C。用PBS洗净后,异丙醇/ 0.04 M盐酸补充道,和OD570测量,空白的价值减去。
2.4。一结论分析
总RNA提取每个老鼠皮肤标本。RNA逆转录M-MLV逆转录酶使用随机执行六聚物引物,使用Taq DNA聚合酶和随后的放大了。PCR进行30周期在94°C与变性为30秒,退火从52到64°C 1分钟在72°C和扩展30秒使用一个热循环(PE应用生物系统公司Amp基因PCR系统9700)。人类的MIF引物是5”-ATGCCGATGTTCATCGTAAAC-3”(向前)和5”-GGCGAAGGTGGAGTTGTTCCA-3”(反向)。被使用的il - 6引物5”-GATGCAATAACCACCCCTGACCC-3”(向前)和5”-CAATCTGAGGTGCCCATGCTAC-3”(反向)。5使用的引发引物”-CATGACTTCCAAGCTGGCCGTG-3”(向前),5”-CCACTCTCAATCACTCTCAGTTC-3”(反向)16]。肿瘤坏死因子-α引物是5”-ACACCGTCAGCCGATTTGC-3”(向前)和5”-CCCTGAGCCATAATCCCCTT-3”(反向)。GAPDH是用作积极控制。使用的引物是5”-ACCCAGAAGACTGTGGAT-3”(向前)和5”-TCGTTGAGGGCAATGCCA-3”(反向)。PCR后,放大产品用2%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.5。细胞因子释放测量
上层清液收集后24 h的孵化有限合伙人(1μg / mL)和/或KBG(10毫克/毫升)和芍药苷(100μg / mL)。MIF、il - 6和引发被ELISA化验,根据制造商的指示。吸光度测量的标(Labsystems Multiskan Bichromatic)。
2.6。免疫印迹分析
收集细胞和洗冷PBS。细胞在细胞溶解1×10的密度6细胞/ 50μL•瑞帕缓冲区(1 M Tris-HCA 5 M氯化钠,1%诺乃清洁剂p 40 (v / v), 1%钠脱氧胆酸盐,0.05% SDS, 1毫米phenylmethyl磺酰氟)20分钟。短暂的声波降解法后,溶解产物在12000转离心10分钟在4°C,和上层清液中的蛋白质含量测定用bio-rad蛋白质分析工具包(bio-rad Hercles, CA)。蛋白质的溶解产物变性在96°C混合后5分钟与5μL钠dodecylsulfate (SDS)加载缓冲区,应用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移到硝化纤维膜。免疫印迹分析进行了检测cox - 2的表达水平和伊诺使用特定抗体(17]。带信号可视化在x射线胶片使用化学发光发射极耦合逻辑检测试剂(Amersham生物科学,白金汉郡,英国)。与特定的抗体相关的蛋白质的相对量是根据强度的归一化β肌动蛋白。
2.7。统计分析
的值表示为±SD方法各自的测试或对照组。统计上显著的差异与LPS刺激治疗组与KBG或非参数Mann-Whitney芍药苷进行评估U测试。P值<。05年被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。的影响在HDMECs KBG LPS-Stimulated诱导的细胞因子
有限合伙人中起着重要的作用在许多炎性疾病的发病机制诱导炎性细胞因子释放的一种独特的模式。我们使用有限合伙人在HDMECs产生炎症条件。这些细胞被孵化有或没有1μ克/毫升的有限合伙人或10毫克/毫升的KBG 6、24 h,和细胞生存能力评估。没有治疗引起细胞毒细胞的检测浓度和培养时间(图1(一))。我们检查了KBG的抗炎效应诱导的炎性细胞因子在LPS刺激。LPS-induced MIF蛋白水平,il - 6,引发,TNF -α显著地抑制了KBG(图1 (b))。治疗的细胞1μ克/毫升的有限合伙人的mRNA水平增加这些细胞因子刺激后6 h,但这些mRNA水平下降了KBG(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。芍药苷对LPS-Stimulated HDMECs诱导细胞因子
这些细胞被孵化有或没有1μ有限合伙人或100 g / mLμ克/毫升的芍药苷6、24 h,和细胞生存能力评估。图2(一个)表明芍药苷的孵化并没有引起的细胞毒性测试集中在培养时间。LPS-induced MIF蛋白水平,il - 6,引发,TNF -α芍药苷有显著抑制,抑制效应强于KBG(图2 (b))。此外,研究芍药苷的影响在mRNA水平的炎性细胞因子,细胞处理有限合伙人6 h 100年的存在μ芍药苷的g / mL。LPS-induced MIF, il - 6、引发和TNF -α信使rna水平下降了芍药苷(图2 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。芍药苷抑制cox - 2和伊诺蛋白表达
接下来,我们检查了芍药苷是否能抑制cox - 2的生产和进气阀打开。免疫印迹分析表明cox - 2的表达和伊诺在HDMECs而增加了LPS刺激芍药苷治疗导致降低cox - 2和伊诺表达式(图3)。
(一)
(b)
4所示。讨论
在日本传统药用化合物,邮政寿险局公式起源于中国古代医学,目前在日本由卫生部认可和补偿治疗各种各样的条件。邮政寿险局公式KBG经常用于日本和中国传统医学治疗一些症状,包括皮肤疾病。制备了抗炎和自由基清除效果。
在目前的研究中,我们证明了KBG治疗显著抑制蛋白质和mRNA水平的MIF, il - 6,引发,TNF -α在LPS-stimulated培养HDMECs。慢性色素紫癜疾病复杂的特点是毛细管炎和淋巴细胞真皮毛细血管损伤。一些证据显示的参与体液或细胞免疫,以及止血,在这种疾病的发病机制18]。这些病人有时对标准治疗,如局部皮质激素治疗。实际上,我们之前的数据支持KBG的有效性,导致显著改善慢性色素紫癜患者(7]。据报道,KBG可以防止动脉粥样硬化的进展(19,保护血管内皮功能在cholesterol-fed兔子19)在高血压大鼠(20.]。此外,在糖尿病大鼠,它是证明对血管损伤有保护作用[21),和延缓糖尿病肾病的发展22,23]。此外,KBG有利影响2型糖尿病的葡萄糖代谢改善葡萄糖耐受不良,,有人建议,这种效应来源于降低TNF -α内容在骨骼肌24]。因此,KBG可能起到有益的作用,导致在HDMECs抑制炎性细胞因子。最近报道,引发MIF诱发内皮表达,从而导致白细胞招募(25]。由于MIF等促炎细胞因子il - 6的引发剂,引发,TNF -α和调节这些细胞因子的诱导26,27),我们假设KBG可能抑制MIF-regulated炎症介质。
我们也表明芍药苷,KBG中包含的一种生物活性化合物,抑制这些炎性细胞因子的mRNA水平LPS-stimulated培养HDMECs,类似于KBG的影响。众所周知,芍药苷有抗炎和抗过敏药活动(28,29日]。此外,据报道,芍药苷展出(免疫调节作用30.,31日],镇痛作用[32),神经肌肉阻断(33,34,提高认知能力35),和类固醇抑制蛋白结合36]。我们的研究表明芍药苷降低cox - 2的表达和HDMECs伊诺。许多研究已经证明,生产过剩的一氧化氮和PGE2等炎症前列腺素,主要通过伊诺和cox - 2,分别在炎症的发展起着重要的病理生理作用[37]。金姆和Ha报道,芍药苷治疗显著减毒LPS-induced没有和产生PGE238]。此外,提取KBG曾显示cox - 2和诱导伊诺抑制活性(39]。在这种情况下,我们建议KBG和芍药苷诱导抗炎作用通过抑制促炎细胞因子和抑制cox - 2的级联的生产过剩,HDMECs伊诺。
5。结论
所有,这些发现表明,KBG可能有用改善微血管炎症患者的皮肤疾病,如慢性色素紫癜。
非标准缩写:
| ELISA: | 酶联免疫吸附试验 |
| HDMECs: | 人类皮肤微血管内皮细胞 |
| KBG: | Keishibukuryogan |
| IL: | 白介素 |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| MIF: | 迁移抑制因子 |
| 肿瘤坏死因子: | 肿瘤坏死因子。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
承认
这项研究是由科学研究补助金(不支持。20591337)从日本促进社会科学。