文摘
目的。观察toll样的表达receptor-4 (TLR4),骨髓分化因子88 (MyD88),核因子B kappa p65 (NF -在虹膜组织B p65) endotoxin-induced葡萄膜炎(EIU)葡萄膜炎和评估这些因素的重要性。方法.Wistar老鼠被随机分为5组(0 h、12小时、24小时、48 h,和72 h, n = 10 /组)。急性前葡萄膜炎动物模型建立了一个后拦路贼注入200霍乱弧菌有限合伙人。TLR4的表达、MyD88和NF -B p65虹膜睫状体组织通过免疫组织化学染色检测。结果。TLR4的表达并没有发现在正常iris-ciliary身体复杂,TLR4与圆的形态出现在虹膜基质阳性细胞注射后12小时,显著增加注射后48小时,逐步减少72小时后注射。MyD88和NF -的表情B p65与TLR4的变化是一致的。结论。TLR4表达的增加及其下游信号转导moleculesMyD88 NF -B p65表明途径的潜在作用急性前葡萄膜炎的发病机制(AAU)。
1。介绍
toll样受体(通常是一个最近发现家庭的先天免疫识别受体(PRRs)。迅速激活先天免疫系统识别病原微生物和特殊结构的细胞壁,其为病原体是一种高度保守的分子模式(pamp) [1]。至少有13人通常认为到目前为止,在toll样受体4 (TLR4)是最早的发现和研究最多的。TLR4的主要功能是识别脂多糖(LPS)的革兰氏阴性细菌细胞壁和激活先天免疫系统。陈等人最近[2)报道,TLR4在iris-ciliary巨噬细胞表面高表达与葡萄膜炎大鼠拦路贼注入霍乱弧菌引起的脂多糖。它表明TLR4可能参与急性前葡萄膜炎的发病机制(AAU)。在我们的研究中,TLR4的表达的变化,下游转导MyD88分子,和NF -B在iris-ciliary学人研究相同的研究方法。TLR4的作用转导通路AAU发病机制的进一步探索。
2。材料和方法
2.1。材料
2.1.1。动物
成年男性无菌Wistar鼠(8 - 10周大,体重150 - 200克)是获得重要河流实验动物技术有限公司(中国,北京)。五十个动物被用于研究。动物随机分为5组(每组)以下时间点:在有限合伙人注入(0 h;对照组)和6 h, 12 h,有限合伙人注射后24小时、48小时。
2.1.2。试剂
脂多糖(霍乱、古典生物型、血清型Ogawa)请提供了兰州生物制品研究所(兰州,中国)。兔多克隆抗体TLR4和MyD88鼠单克隆抗体NF -B p65购买从圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。Vectastain ABC-peroxidase包买来向量实验室(美国)。亲和纯化正常兔免疫球蛋白是购自博士德生物技术(武汉,中国)。老鼠IgG1从Serotec购买(英国牛津大学),轻拍装备购买从中山Goldbridge生物技术(中国,北京)。
2.1.3。仪器、设备
移除虹膜受到立体显微镜(Leica-M165 C;位于德国徕卡)。幻灯片是光学显微镜下检查(徕卡- dm - 4000 b;位于德国徕卡)。图像捕捉到一个裂隙灯眼前段摄像系统(Topcon SL-D7;Topcon、日本),并使用图像管理软件(Adobe Photoshop CS3分析。10.0;Adobe Systems,山景,CA)。
2.2。方法
2.2.1。动物模型
Endotoxin-induced葡萄膜炎是诱导如前所述3]。老鼠收到一个注入200g (4,5)有限合伙人在100年解散L无菌生理盐水(NS)在一个后方拦路贼。眼睛缝显微镜检查注射,注射后不同时间,而前强度段炎症被裂隙灯评估。
2.2.2。炎症评分
前部分炎症的强度由狭缝显微镜检查前注射,注射后每隔2 h。炎症迹象都详细记录,拍摄照片。葡萄膜炎的严重程度分级,从0到4由调查员盲法研究协议(6)如下:;虹膜和结膜血管的血管舒张;虹膜和结膜血管的扩张与温和的耀斑前房;在前房iridal充血而强烈的闪光;和临床症状与纤维素性渗出液3瞳孔区域。
2.2.3。动物灌注和样品制备
心脏内的灌注大鼠在不同时间点进行为了消除血液免疫组织化学染色的效果。动物深感用17.5%水合氯醛麻醉(2毫升/公斤)腹腔内注射。矢平面上通过一个腹部切口暴露胸壁,河鼠冲通过左心室与250 - 300毫升的磷酸盐(PBS), 1 IU肝素/毫升的PBS直到流出变成无色,4%多聚甲醛(250毫升)是通过心脏刷新的。运动四肢和尾巴(固定达到四肢)表示充分的灌注(7]。在4%多聚甲醛固定后额外的1 - 2 h,眼睛被放入培养皿中充满了PBS。iris-ciliary体复杂温柔地切割成34段立体显微镜下并存储在埃普多夫管与PBS。
2.2.4。组织病理学
老鼠死于过量戊巴比妥(100毫克/公斤)后24小时内接种有限合伙人。老鼠的眼睛是无核的,放置在10%中性缓冲福尔马林溶液24 h。固定液清洗后,组织样本沉浸在50%,75%,80%,90%,和100%酒精1 h,分别脱水。然后,组织投入石蜡对嵌入与二甲苯接受治疗后30分钟。矢状部分(4米厚)附近被削减视神经头和苏木精和伊红染色。
2.2.5。免疫组织化学
准备组织被投入24板。三冲洗后用PBS(5分钟),0.3% triton-X 100用于穿孔细胞膜30分钟。然后,内源性过氧化物酶活性在整个坐骑被0.3%的H2O2在室温下为30分钟。与PBS三漂洗后,组织被封锁山羊血清为30分钟,5%和孵化主要抗体TLR4 MyD88, NF -B p65(稀释,1:50)一夜之间。在PBS几个洗后,组织与生物素化的孵化antirabbit antimouse二级抗体(1:200),在室温下2 h。在PBS进一步洗涤三次,组织孵化与A和B的混合物(1:100)为30分钟。染色是biotin-avidin-peroxidase可视化的方法使用diaminobenzidine作为发色体。消极的控制由取代主要抗体species-matched和isotype-matched抗体浓度的主要抗体。
2.3。定量分析
在我们的研究中使用的方法涉及计算的总数immunopositive虹膜细胞每段(一条0.29毫米或1格宽的瞳孔边缘虹膜基地选择随机周长)。鸢尾科植物的平均长度(base-pupil保证金)本研究大约1毫米(0.97毫米或3.4格长度);因此,一段的平均面积是0.281毫米2。至少2和5段数/从一个眼,虹膜和整体平均密度/毫米2每个动物获得了(8]。细胞被蒙蔽统计调查员(作者之一,谁不知道治疗)。不同层的彩色细胞可以在不同的焦平面的坐骑。所有细胞的不同层在一个领域是在显微镜下计数20或40 x物镜。
2.4。统计分析
定量数据被表示为意味着±标准差(SD)和分析了单向方差分析(方差分析)其次是显著性差异的过程(LSD)测试多个实验组与对照组之间比较。使用SPSS 11.5统计分析(SPSS Inc .,芝加哥,IL)统计软件。P值小于。05was considered statistically significant.
3所示。结果
3.1。经济学人信息部的炎症表现
除了对照组,观察眼部炎症迹象的每个老鼠注射LPS后剩下的四组。结膜水肿、虹膜的纤毛充血,血管扩张开始出现在4有限合伙人注射后6 h。在1216 h,水扩口和纤维蛋白的瞳孔膜被认为,达成最大的2224小时。闭塞的学生甚至发现了狭缝显微镜(图1(一))。一般来说,24小时后炎症逐渐消退,而分泌已经降低了LPS 48 h后注入(图1 (b))。在7276 h,纤维蛋白的瞳孔膜被完全吸收,但只有轻微的纤毛拥堵依然存在。学人的分数纯种老鼠在不同时间中所描述的人物2(一个)和表1。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
3.2。组织学变化
)染色结果符合炎症表现在Wistar鼠LPS疫苗接种后24小时。大量的炎性细胞浸润和纤维蛋白渗出物可以看到在前部和后部室(图3(一个));大量的中性粒细胞粘附在角膜内皮细胞(图3 (b));增厚虹膜基质血管舒张和大多数炎性细胞浸润玻璃观察(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。TLR4的表达
TLR4阳性细胞都是棕色的,是位于细胞膜。TLR4 iris-ciliary体内无法检测到复杂的0 h组(图4(一));在12 h, TLR4阳性细胞在血管(图中被发现4 (b));TLR4阳性细胞数量显著增加虹膜和睫状体的老鼠在24 h(图4 (c)),达到48 h(图的峰值4 (d))。阳性细胞的数量减少了72 h(图4 (e))。其中有统计学意义阳性细胞整体组(,方差分析)。少量的阳性细胞也在睫状体。但是,没有阳性细胞可以检测到负控制核复染色(图4 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。表达MyD88
MyD88阳性细胞主要分布在细胞质中。MyD88表达变化的趋势与TLR4(图是相一致的2 (b))。在0 h MyD88无法检测到,但阳性细胞观察虹膜在12 h(图5(一个)在24日),并达到最大48 h(数据5 (b)和5 (c))。阳性细胞的数量减少了72 h(图5 (d))。在负控制没有阳性细胞可以被探测到。有统计学意义,其中阳性细胞组(,方差分析)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。表达式的NF -B p65
NF -B p65无法找到在0 h组,但NF -B p65阳性细胞位于细胞质或核在其他组织和它的表达逐渐增加至12 h 48 h。Immunopositive细胞主要是round-ovoid主要散射在虹膜基质。阳性细胞的数量减少了72 h。有统计学意义,其中阳性细胞组(,,数据6(一)- - - - - -6 (d)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
葡萄膜炎是一种常见的炎症性疾病,是一个潜在的威胁视力丧失,主要影响虹膜、睫状体、脉络膜(9]。目前,葡萄膜炎的致病机制还不清楚。大多数的葡萄膜炎可能是由于多发地因素,只有一小部分的感染性葡萄膜炎是由于病原体入侵。急性前葡萄膜炎,尤其是HLA-B27-associated AAU是一种常见的非感染性葡萄膜炎,但临床和实验室研究已经证明了克雷伯氏菌等革兰氏阴性菌,沙门氏菌,鼠疫,志贺氏杆菌物种可以触发它(10]。地是一个主要的受体识别脂多糖的革兰氏阴性细菌的细胞壁。在我们的研究中,TLR4表达的不是正常的纯种老鼠虹膜而Chang et al。11和布里托等。12)发现TLR4表达阳性细胞在正常hunman iris-ciliary身体。这可能是由于不同的主题和方法应用自TLR4表达太低在正常纯种老鼠被虹膜检测拉伸制备技术。在我们的研究中,我们发现TLR4表达iris-ciliary体内后有限合伙人管理。炎性反应达到最大值后24 h有限合伙人管理,然后炎症反应的程度逐渐降低,但TLR4阳性细胞继续增加到48 h的虹膜。TLR4表达显著减少72 h与在48 h ()。在我们的研究中,我们观察到的变化TLR4是相对于前段炎症的程度,这表明LPS-related革兰氏阴性细菌可能过度激活TLR4-mediated先天免疫和适应性免疫导致AAU发病率。
LPS识别、TLR4经历寡聚化和招募其下游适配器通过交互TIR (Toll-interleukin-1受体)领域,最终导致炎症反应(13]。TLR4信号分为MyD88-dependent和MyD88-independent (TRIF-dependent)通路。我们的研究发现,许多MyD88阳性细胞表达在虹膜后24 h有限合伙人管理,在48小时达到高峰,然后逐渐下降。MyD88表达式的曲线与TLR4是一致的。它表明TLR4激活下游信号分子通过MyD88-dependent通路传导AAU的发病机理。苏et al。14)报道,MyD88-deficient老鼠完全抗实验性自身免疫性葡萄膜炎(淡)Th1介导的自身免疫反应。总的来说,这些发现表明MyD88-dependent在有限合伙人/ TLR4信号通路中扮演着重要的角色。
MyD88激活后,另一个适配器蛋白质TRAF6 (TNF receptor-associated因子6)对MyD88-dependent途径至关重要。它会导致我的磷酸化这使得NF - B蛋白质B / I -B三聚物复杂的退化。子序列,NF -B被激活并转移到核(13]。在我们的研究中,NF -B p65无法观察到阳性细胞在正常纯种老鼠的虹膜。在有限合伙人免疫后12 h, NF -B p65阳性细胞的细胞质和细胞核中发现虹膜,在48小时达到最大值,然后下降在72 h。TLR4和MyD88相比,NF -B p65减少更明显的从48 h - 72 h,它可以更好地反映衰减直接的炎症。它与气等是一致的。15NF -)报告B p65拦路贼后被激活iris-ciliary体内注射LPS的老鼠。在正常情况下,p65 NF -亚基我结合其抑制剂-表格I - BB-NF -Bp50 / p65三聚物的复杂,nonactivation状态。当我B抑制蛋白质degradates, NF -B抗体识别并激活p65 [16]。此外,Todaro et al。17发现,NF -B是遗传病的外周血T细胞中高度表达,导致apoptosis-related因素的调节和死亡受体导致BD T细胞凋亡抵抗子集。在研究,减少NF -B p65可能诱导外周淋巴细胞凋亡的调节通过这种转导通路,从而导致炎症反应的回归。我们发现更积极比NF - TLR4和MyD88细胞B p65细胞在相同的领域在72 h,这可能是由于反馈通路。需要进一步的研究,包括功能性研究,识别网络中核因子的角色的葡萄膜炎。
5。结论
我们的研究表明TLR4的表达,MyD88, NF -B在虹膜改变p65学人。这些发现表明TLR4及其相关因素的重要作用在葡萄膜炎的发病机制提供了一些深刻的思想葡萄膜炎的机制。
确认
作者感谢教授桂林谢(兰州生物制品研究所)提供有限合伙人,和刘Kegao(首都医科大学)的评论文章。这项研究得到了国家自然科学基金(30872361)和中国国家关键技术研发项目在中国的第11个五年计划(2007 bai18b10)。