文摘
黏膜损伤是一种常见的许多癌症治疗的副作用,尤其是化疗放疗和密集,经常引起骨髓(BM)抑制。我们观察到醋酸——(AA)诱导小鼠的结肠粘膜损害被同时照射治疗或研究者用恶化。然而,辐照前14天AA康复治疗增强粘膜损伤,表明经济复苏从BM抑制粘膜修复一个有利的影响。此外,BM移植还增强AA-induced粘膜损伤的恢复。我们进一步证实移植BM-derived细胞,尤其是F4/80+Gr1一起+“炎症”单核细胞(子集1),粘膜受损地区积累了早期愈合阶段,和两个子集1和F4/80+Gr1一起- - - - - -“居民”单核细胞(2)子集在这个领域积累在以后的阶段。我们的研究结果表明,单核细胞/巨噬细胞为粘膜恢复和再生粘膜抗癌药物治疗的影响。
1。介绍
黏膜损伤是一种常见的许多癌症治疗的副作用,特别是密集化疗和放疗。这种粘膜损害严重影响患者的生活质量严重,有时需求变化或限制治疗(1- - - - - -3]。肠道粘膜炎和口腔粘膜炎是严重的临床问题在接受电离辐射的病人中肠道和口腔粘膜是最对辐射敏感的器官。化疗所致肠道粘膜炎涉及多种机制,包括隐窝细胞诱导凋亡和白细胞郁滞,这意味着可能的参与途径与p53、bcl - 2家族,还存在(3- - - - - -5]。此外,核factor-kappa B (6),环氧酶通路(7),和表观遗传畸变8]的规定涉及放射性粘膜炎。因此,这些发现已经导致进一步的保护和救助的研究使用实验动物的肠粘膜损害。也就是说,lysophosphatidic酸(9),银杏叶提取(10],D-methionine [11)已被证明对辐射诱导器官损伤表现出保护行动在体外和在活的有机体内。最近,组蛋白脱乙酰酶抑制剂(8),洛伐他汀(12,抗坏血酸(13)也被证明能够防止放射性粘膜炎。促炎细胞因子也被卷入化疗所致胃肠道粘膜炎的病理生理学14]。然而,这些细胞因子是否起到关键作用的发展和治疗radiotherapy-induced胃肠道粘膜炎仍是未知的。
在目前的研究中,我们采用醋酸- (AA)诱导粘膜损伤动物模型,建立模型的筛选抗炎药(15,16),研究辐照的影响或研究者用AA-induced粘膜损伤后愈合过程。令人惊讶的是,我们发现辐照前AA-induced粘膜损伤增强粘膜愈合,而同时照射或研究者用治疗与AA同时加剧了粘膜损伤。因为辐照或抗癌药物治疗也诱发严重的白细胞减少,骨髓移植(BMT)的影响粘膜愈合也进行了研究。特别是,我们研究了两个单核细胞/巨噬细胞的子集,“炎症”和“居民”17- - - - - -21),来确定这些单核细胞/巨噬细胞迁移到子集粘膜受损病变和阐明他们的角色在粘膜愈合。
一些报告表明,单核细胞/巨噬细胞有助于伤口引起的血管损伤的愈合(22),脊髓损伤(23),和心肌梗死24]。还有其他研究已经表明,单核细胞/巨噬细胞可以促进伤口愈合后皮肤损伤(25- - - - - -28]。然而,单核细胞/巨噬细胞的作用子集的胃肠粘膜炎尚未阐明。在这里,我们提出一个单核细胞/巨噬细胞在保护肠道黏膜损伤。
2。材料和方法
2.1。老鼠和全身照射(TBI)
雄性C57BL / 6 j小鼠,享年6周,从查尔斯河购买日本公司(横滨)。老鼠保持特定的无菌条件下,提供无菌的食物和水随意。动物被依法处理和治疗指导方针提出的动物使用和保健委员会日本癌症研究基金会,和所有程序符合国家卫生研究院指导的护理和使用实验动物。老鼠完全辐照总剂量的4 Gy /动物使用x射线发生器作为放射治疗和指定为RT老鼠。filter-topped中的辐照小鼠饲养笼,以防止感染。的绝对计数白细胞(白细胞)进行了分析使用一个f - 820半自动血液学分析仪(Sysmex,神户,日本)。
2.2。实验诱导粘膜损伤
和光,20毫升的3% AA (kouichi东京,日本)被注入腔结肠癌和保留的20年代使用round-ended镊子。此后,腔体是用生理盐水洗净和缝合如前所述9,15,16]。之前或之后粘膜损伤,老鼠管理研究者用(100毫克/公斤)(AA +研究者用)通过尾静脉输液或辐射(4 Gy) (AA +放疗(RT))。那天评估、结肠纵向切割和张开,受损区域的大小(长×宽(毫米2使用立体显微镜)决定。
2.3。BMT和细胞标记
bmc从股骨和胫骨刷新RPMI 1640中使用26克1/2针。移除碎片,暂停过滤是35μm细胞过滤器(Falcon)。细胞被洗介质和统计,和细胞被注入到尾静脉每个粘膜受损的老鼠。启用跟踪分析,bmc沾VivoTag 750 (VT750;例:海里,新兴市场:海里,MW: 980 Da)可视化细胞体内的积累。VT750商业从VisEn获得医疗(沃本马;现在PerkinElmer健康科学,Inc .)。细胞培养与30μg / ml VT750为30分钟37°C和标签后洗两次。为进一步分析、bmc沾10μ二乙酸M CFDA-SE (Carboxyfluorescein succinimidyl酯;分子探针;英杰公司)为15分钟37°C。细胞被离心,然后repelleted resuspended新鲜,prewarmed介质,和在室温下培养30分钟,以确保完成公司的调查最后洗前一步。
2.4。准备受损粘膜和注射bmc的识别
解剖粘膜在钙和孵化magnesium-free哈佛商学院(GIBCO)含2.5% heat-inactivated的边后卫和1毫米德勤(Sigma-Aldrich)清除粘液。包含1毫米的粘膜孵化在哈佛商学院EDTA (GIBCO) 45分钟37°C。组织被收集和孵化在哈佛商学院含有1毫克/毫升胶原酶(Nacalai Tesque,东京,日本)和0.1毫克/毫升DNase我60分钟37°C,与抗体和细胞被洗和反应流仪分析。
2.5。流仪结果
下面的单克隆抗体和染色试剂结合使用根据制造商的协议:藻红蛋白- (PE)共轭CD11b (BD Pharmingen) Gr1一起(Ly6C / G;BD Pharmingen), Peridinin叶绿素Protein-Cyanin 5.5 - (PerCP-Cy5.5)共轭anti-CD11b (BD Pharmingen)和allophycocyanin——(APC)共轭anti-CD62L(贝克曼库尔特),anti-Gr1 (Ly6C / G) (BD Pharmingen),或anti-F4/80 (Caltag)。排除不能存活的细胞,7-amino-actinomycin D (7-AAD)使用。细胞被存储在寒冷的条件和受光照;他们分析了添加7-AAD后大约15分钟。之后,分析了细胞在一个FACSCalibur流式细胞分析仪(Becton Dickinson,富兰克林湖,新泽西)使用CellQuest软件(正)。
2.6。共焦显微镜分析
在活的有机体内监测细胞迁移进行了使用AA +研究者用模型。0天,老鼠接受AA和研究者用(100毫克/公斤),24小时之后,VT750-labeled bmc是通过尾静脉注入小鼠。2天,从小鼠结肠切除了,粘膜受损区域的纵向切入,展开对激光扫描显微镜(奥林巴斯IV100)。
2.7。统计分析
数据表示为±SE。使用韦尔奇的数据进行了分析以及两组之间的比较,三组之间图基的方法,差异被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。TBI-Induced白细胞减少和血小板减少症
众所周知,癌症病人创伤性脑损伤引起粘膜损伤。为了模仿类似的情况,我们选择了创伤性脑损伤作为放疗(RT)而不是当地的辐照。4 Gy创伤性脑损伤的剂量诱导小鼠白细胞减少和血小板减少症(数字1(一),1 (b))。创伤性脑损伤的大幅减少1天内白细胞计数;WBC最低点持续了一周,然后逐渐倾向于恢复。同样,血小板减少;然而,减少那么严重,最低点在10天发生。因此,我们认为,创伤性脑损伤后第14天代表一个有利的阶段对白细胞和血小板恢复阶段。
(一)
(b)
3.2。粘膜损伤和辐射之间的关系
实验在结肠粘膜损伤诱导3% AA。评估黏膜损伤,结肠切除,纵向切入,展开。受损区域的面积是衡量使用立体显微镜(图2(一个))。与此同时,我们检查了RT对结肠黏膜损伤的影响。当AA-treated老鼠辐照0天,损失的面积往往是更广泛的比未照射小鼠在7天。这表明,RT延迟粘膜损伤的愈合。尽管BMC的数量没有减少,白细胞计数显著降低(图2 (b))。相反,当老鼠辐照诱导前14天粘膜损伤和AA在第0天(放射线治疗),我们发现受损面积显著减少7天(AA和AA +放射线治疗;图2 (c))。这项观察表明preirradiation青睐粘膜损伤的愈合。在这些时期,在辐照小鼠白细胞计数仍低于未照射小鼠;然而,计数显示复苏,所以我们选择天14放射线治疗。此外,一些monocyte-derived细胞因子和趋化因子是调节期间(数据没有显示)。
(一)
(b)
(c)
3.3。辐照影响单核细胞比例变化的子集
因为放射线治疗在结肠粘膜损伤的愈合有利,我们假设创伤性脑损伤的影响不仅白细胞计数,而且外周血单核细胞的子集。如图3动能的变化,外周血单核细胞沿一个单核细胞引起的子集,子集CD11b+CD62L+子集1,在第0天比CD11b占主导地位+CD62L−子集2(76.4%比23.6%)。RT之后,逐渐改变,比例和CD11b+CD62L−子集2主要在每天10(48.9%比51.1%)14(46.1%比53.9%),并在20天回到观察preirradiation状态比例(72.5%和27.5%)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
总之,单核细胞子集从子集1优势增加瞬态子集2最后回到子集1主导地位。我们推测,放射线治疗粘膜损伤的愈合如图青睐2 (c)变化,这可能与单核细胞子集报道。
3.4。研究者用治疗粘膜损伤的延迟愈合
我们下一个检查管理的一种抗癌药物是否会引起相同的现象观察与rt,研究者用管理(100毫克/公斤)诱导白细胞减少和BM抑制在7天(图4(一))。当研究者用管理AA-treated老鼠0天,受损区域的价格相比显著增加saline-administered控制老鼠在7天(图4 (b));,研究者用治疗延迟愈合的粘膜损伤,如与rt,此外,粘膜损伤的延迟愈合后研究者用治疗是比这更严重的rt,我们下个决心BMT恶化的粘膜损伤的影响,研究者用治疗。
(一)
(b)
3.5。管理的bmc增强粘膜损伤的愈合
自从BMC计数减少研究者用治疗,我们认为BMT会帮助治愈粘膜损伤。小鼠AA-induced粘膜损伤,管理研究者用接受BMT (AA +研究者用),我们发现BMTbmc显示显著增强粘膜损伤的愈合BMT后6天(> 60%;图5(一个))。AA +研究者用管理体重造成重大损失和虚假的操作(saline-treated)组相比,但BMT获救后体重损失明显第三天(与AA +研究者用组)(图5 (b))。沉重的手术后观察大便出血,特别是在AA +研究者用组。
(一)
(b)
3.6。标记的bmc迁移到受损区域的粘膜
我们假设移植的bmc迁移到受损区域的粘膜和增强其愈合。为了验证这个假设,我们将Vivotag750-labeled的bmc注射到AA +研究者用老鼠和确定标记细胞是否可以检测到受损区域使用荧光显微镜。如图6标记的bmc ()明显积累受损区域与未受损区域的粘膜。因此,它是可能的,标记的bmc参与受损粘膜愈合。
3.7。F4/80+Gr1一起+(1)子集细胞受损区域的累积粘膜愈合的早期阶段
进一步确定细胞积累的特点,我们使用CFDA-SE标签流仪分析方法(流式细胞仪)。单个细胞受损组织中积累被流式细胞仪分离和分析。孤立的细胞被确定基于1的3颜色。他们沾7-AAD、F4/80-APC C11b-PE或7-AAD F4/80-APC, Gr1-PE。CFDA-positive分数起源于移植BMC(图7(一)),这显然表示CD11b和F4/80(图7 (b))。然而,应该指出的是,F4/80+分数也表达了Gr1一起(图7 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
因此,这些分析确定了F4/80积累细胞受损区域+Gr1一起+(1)子集单核细胞,表现出典型的单核细胞/巨噬细胞形态(图7 (d))。
3.8。两个F4/80+Gr1一起+(1)子集和F4/80+Gr1一起−(2)子集细胞受损区域的累积粘膜愈合的在以后的阶段
标记的bmc (细胞)移植到AA +研究者用老鼠监控24,72和120 h的流式细胞仪。F4/80+Gr1一起+(子集1)单核细胞受损区域的累积粘膜BMT后24小时。然而,Gr1一起表达BMT后削弱72 h(86.7%),进一步削弱了在120 h BMT后(51.3%)相比,表达在24小时(98.8%)、(图8)。因此,我们假设F4/80+Gr1一起+(1)子集单核细胞迁移到受损区域的粘膜主要治疗的早期阶段,而F4/80+Gr1一起−(2)子集单核细胞积累在该地区在稍后阶段。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
因为RT或抗癌药物管理局也不仅引起白细胞减少,BM抑制,我们假设这些疗法可能会延迟愈合的粘膜损伤。我们惊讶地发现,preirradiation加速粘膜损伤的愈合前辐照小鼠结肠被AA治疗受损。我们还发现BMT显著增强AA +研究者用引起的粘膜损伤的愈合治疗。这些观察强烈建议的bmc或BMC-derived细胞群导致粘膜损伤后再生。我们因此决定细胞类型粘膜损伤积累和研究单核细胞或单核细胞子集起到了重要的作用,在辐照引起的粘膜损伤的愈合或化疗。
如前所述,粘膜损伤是一种常见的许多癌症治疗的副作用,不幸的是没有治疗这种疾病至今(1- - - - - -3]。肠道和口腔粘膜炎是严重的临床问题在接受照射的病人中肠道和口腔粘膜是最对辐射敏感的器官。很难建立粘膜损伤模型使用辐照或抗癌药物。所以,我们结合AA与创伤性脑损伤或研究者用模仿在癌症患者粘膜损伤。我们也尝试了DSS(葡聚糖硫酸钠)模型,但它是更复杂的,因为DSS anticoagulate效应本身和远离癌症病人的临床环境。虽然AA-induced粘膜损伤模型是一个古老的类型,它已经广泛被用于评估药物疗效。
辐射的机制或化疗所致的粘膜炎被广为记载(5- - - - - -7),使得测试各种治疗方法在实验动物8- - - - - -13]。组织损伤的修复是一个互动的过程,包括可溶性介质,细胞外基质成分,居民细胞,浸润白细胞(28,29日]。最初,中性粒细胞积聚在伤口地点,紧随其后的是大量的巨噬细胞和少量的T淋巴细胞。在增殖阶段,发生大规模的血管生成,成纤维细胞迁移到伤口,激增,变成myofibroblasts,肉芽组织的形成中扮演了重要的角色。最近,石田使用科学家等人3(R1) - 1 -科学家趋化因子受体基因敲除小鼠证明科学家的招聘3R1-positive单核细胞/巨噬细胞对皮肤伤口愈合至关重要(28]。
产生的荧光照明氩488海里,离散长561海里,或者HeNe波长633纳米的激光检测期间是困难的在活的有机体内成像自小鼠大肠的正常饮食表现出自发荧光;因此也很难形象的内容结肠癌和粪便。虽然与纯化饮食可以减少自发荧光,它不完全消失(数据没有显示)。因此,我们使用以下2方法检测标记移植的细胞。一个VT750染色,荧光显微镜,另一个是CFDA-SE进行流式细胞仪分析。748海里LD(激光二极管)预防自体荧光由于饮食,在我们的分析,在结肠癌细胞和组织不能通过流式细胞仪检测。我们因此证明F4/80+Gr1一起+(子集1)单核细胞/巨噬细胞被招募到受损区域的粘膜愈合的早期阶段。两个F4/80+Gr1一起+(1)子集和F4/80+Gr1一起- - - - - -(2)子集单核细胞/巨噬细胞积累受损区域的后阶段的愈合过程。石田et al。28)报道,残雪3CR1+CCR2−(1)子集和残雪3CR1+CCR2+(2)子集单核细胞/巨噬细胞堆积在皮肤伤口网站后期治疗的阶段,这些细胞有助于伤口愈合。我们的研究结果表明F4/80+Gr1一起+和F4/80+Gr1一起−单核细胞/巨噬细胞顺序招募的粘膜受损区域2不同的阶段。子集1可以指定为不成熟单核细胞/巨噬细胞和子集2成熟单核细胞/巨噬细胞。因为子集1细胞可能分为子集2 (18)细胞的连续发展,一些子集1单核细胞/巨噬细胞的比例可能会分化成子集2单核细胞/巨噬细胞在治疗的晚期阶段18,30.,31日]。一项研究也表明,单核细胞性质类似于多能干细胞(32),因此一个特定的人口单核细胞也可能分化成粘膜细胞。
辐照诱导upregulation血清细胞因子,包括g - csf和csf(数据未显示)。g - csf已被证明有临床在治疗有益的作用。两个随机临床研究表明,g - csf是有效地降低化疗引起的口腔粘膜炎的发病率(33,34),还有效地帮助减少粘膜炎的严重程度(35]。然而,一些研究g - csf和口腔粘膜炎也报道相互矛盾的结果。一项随机、对照研究使用预防性gm - csf漱口水(36,37)和另一个随机,对照试验使用gm - csf漱口水作为治疗造血干细胞移植患者的口腔粘膜炎没有显示出积极的效果(38]。虽然存在争议,但局部的gm - csf似乎有一些有益的影响口腔粘膜损伤,其持续时间,严重程度(39,40]。
单核细胞,一个复杂的白细胞数量,表达的趋化因子受体,在BM生成,然后释放到循环(17]。小鼠单核细胞进行分类根据其表达CCR2, CD62L (L-selectin) Gr1一起,残雪3CR1 [17,18]。功能区分两个鼠标单核子集,Geissman et al。17)过继转移GFP+单核细胞从残雪3CR1GFP /+老鼠天真和免疫小鼠和研究GFP的挑战+单核细胞命运和功能。他们发现一个单核细胞子集表示CCR2, CD62L, Gr1一起,只有适量的残雪3内,而另一部分没有表达CCR2或CD62L但表达了大量的残雪3内。单核细胞表达CCR2子集+、CD62L+,Gr1一起+,残雪3CR1低被指定为“炎症”子集(子集1)。这个子集的网站迅速招募实验诱导炎症,但是是短暂的过继转移后,变得难以检测的组织天真的接受者(17,19- - - - - -21]。另一方面,CCR2- - - - - -,残雪3CR1高单核细胞数量被发现在老鼠过继转移后,持续时间更长,这人口中发现血,脾、肺、肝脏和大脑的接受者几天后转移。这个群体提出了构成“居民”单核细胞(2)子集招募组织独立于炎症的刺激;这些细胞也认为分化成其他人群。最近,越来越多的证据表明,单核细胞/巨噬细胞可能导致伤口愈合后血管损伤(22),脊髓损伤(23),和心肌梗死24]。还是其他研究提供了支持证据,单核细胞/巨噬细胞可以促进伤口愈合后皮肤损伤(25- - - - - -28]。单核细胞/巨噬细胞子集之间的关系和胃肠道粘膜炎仍然未知。然而,在目前的研究中,我们发现在AA-induced胃肠道粘膜炎积累单核细胞所扮演的角色。总之,使用动物模型,我们表明,BM-derived细胞尤其是单核细胞/巨噬细胞,导致粘膜损伤后再生。
5。结论
(醋酸)- AA -诱导的小鼠结肠粘膜损伤被同时照射治疗或研究者用恶化。然而,辐照前14天AA治疗或BMT增强复苏的粘膜损伤。我们确认F4/80+Gr1一起+“炎症”单核细胞受损区域的累积粘膜愈合的早期阶段。这项研究表明,单核细胞/巨噬细胞有助于恢复和再生粘膜损伤。
6。利益冲突
作者声明没有金融或商业利益冲突。
缩写
| AA: | 醋酸 |
| BMT: | 骨髓移植 |
| 创伤性脑损伤: | 全身辐照 |
| RT: | 放射治疗 |
| bmc: | 骨髓细胞 |
| 体育: | 藻红蛋白 |
| PerCP: | Peridinin叶绿素Protein-Cyanin |
| APC: | allophycocyanin |
| CFDA-SE: | Carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl酯 |
| CXCR: | 科学家趋化因子受体 |
| CCR: | CC趋化因子受体 |
| 白细胞: | 白细胞。 |
确认
作者感谢h .西山贵子博士,研究员合作,美国基本上,n小玉的技术援助。这项工作是由一笔补助金部分资助(21590072)从教育部、科学、文化、体育在日本和部分由大冢制药有限公司,有限公司,日本东京。