文摘

背景。NGAL参与炎症反应的调制,尿毒症患者的血清中发现的。我们调查是否过(HDF)可能影响的能力多形核粒细胞释放NGAL(体)。白介素- 1 (IL)的参与β和肿瘤坏死因子(TNF)α对NGAL发布评估。方法。我们研究终末期肾病(ESRD)患者在透析(Pre-HDF)的开始和结束时的治疗(Post-HDF)和18名健康受试者(HSs)。外周静脉血液来自HDF病人在透析结束时治疗。结果。体从ESRD患者获得hyporesponsive有限合伙人治疗,从海关对体。il - 1β和肿瘤坏死因子-α由体从post-HDF患者高于从pre-HDF体获得的。中和的il - 1β,但不是TNF -α确定一个明确的生产NGAL的体健康的捐赠者。相反,具体感应体NGAL的尿毒症患者依赖于在上层清液il - 1β和肿瘤坏死因子-α。结论。我们的数据表明,在健康受试者的体,NGAL生产完全由il - 1的支持β,而在体从HDF病人,NGAL生产了il - 1的支持β肿瘤坏死因子-α。

1。介绍

中性粒细胞白明胶酶相关lipocalin (NGAL)是一个25-kDa糖蛋白首先发现,基质蛋白,在特定人类中性粒细胞的颗粒(1]。NGAL参与多种细胞过程,包括先天免疫反应,2- - - - - -4]。NGAL表达在上皮细胞中也发现,强烈诱导的炎症(5,6]。此外,蛋白质与几种肿瘤类型有关,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌(7- - - - - -10]。

NGAL表达式快速诱导的肾元反应肾上皮损伤(11,12),这是最近报道,NGAL水平预测的13,14)后出现急性肾损伤的治疗对肾脏有害和不稳定的肾病的严重恶化。此外,最近报道的发现还表明,NGAL可能参与支撑慢性肾脏疾病的病理生理过程如多囊肾疾病(15和肾小球肾炎16]。NGAL的水平,显然与肾功能损害的严重程度相关,可能表达的活跃程度损害的慢性疾病。几个概念中关于急性肾损伤的炎症的作用,最近出现了改变肾脏内皮和上皮细胞肾细胞的促炎介质的后果。天然免疫与适应性免疫之间的相互作用导致了炎症,从而导致肾实质细胞死亡和急性肾损伤。这个过程的早期阶段,一个关键的角色是由中性粒细胞,先天免疫的重要介质。自多形核粒细胞(体)是主要的浸润细胞类型出现在急性炎症反应,他们作为对入侵微生物的第一道防线,以及炎症状态,与肾血管内皮损伤发生在慢性肾脏疾病患者。此外,它已经表明,NGAL发挥其抗菌效果通过绑定iron-transporting分子,因此它可以发挥重要作用在尿毒症患者的抗菌防御17]。中介组织炎症反应的细胞因子网络,免疫反应的主要控制因素。在这些细胞因子、白介素(IL) 1β和肿瘤坏死因子(TNF)α有深远的影响的炎性过程特有的急性肾损伤。

先前的报道还暗示NGAL调节炎症反应。特别是,Cowland等人已经证明NGAL选择性地调节人类上皮细胞的il - 1β但不是TNF -α在NF -κB-dependent方式(18]。

此外,其他作者也表明,il - 1β等离子体在长期水平增加过患者(19,几组还发现增加循环TNF -α水平的患者接受过(20.),尽管其他人没有这个发现(21]。

因此,本研究的主要目的是调查是否间歇HDF终末期肾病患者(erd)可以影响NGAL的释放多形核粒细胞(体)获得pre和postHDF患者。另一个端点是评估il - 1β和肿瘤坏死因子-α生产,并评估NGAL调制的任何他们可能扮演的角色。

在这个在体外研究提出,首次证明这先天免疫防御的具体感应蛋白,在HDF病人,主要取决于il - 1的存在β和肿瘤坏死因子-α在体浮层。

2。材料和方法

三十慢性HDF纳入本研究的患者;所有千基稳定了至少2个月在研究开始之前,已经达到了一种血压正常的edema-free状态。排除标准:存在,或最近的历史,出血、恶性肿瘤、肝脏、甲状腺或传染性疾病,病变在最近的白细胞计数或公式和/或治疗类固醇或免疫抑制。

病人被治疗过(HDF)相同的处方6个月:每周3次3.5 - 4小时,血流量300毫升/分钟;碳酸氢盐注入2000毫升/小时;平均体重2.5公斤。HDF是使用Integra机(Hospal、博洛尼亚、意大利)。

外周静脉血液来自HDF病人在透析(PreHDF)和最后的治疗(Post-HDF)和一小群18名健康受试者(HSs)与HDF患者年龄和性别。这项研究是由当地伦理委员会批准,并从所有参与者充分知情同意了。

2.1。隔离人多形核粒细胞(体)

体从采集的新鲜静脉血分离。PMGss外周血中分离的实际上在肝素,使用Mono-Poly解决介质(M-PRM)后,制造商的指示(MP生物医学,Illkirch、法国)。短暂,M-PRM解决方案组成的多糖(400年聚蔗糖)和不透射线的对比剂(Hypaque)在一个特定的比例产生的密度。血离心机在300 g×30分钟。离心分离后,得到了分数:单核白细胞乐队,体乐队和血红细胞颗粒。体乐队是收获,洗了三次RPMI 1640培养基,培养在24-well盘子的浓度细胞/毫升每在RPMI 1640中补充了50μg / mL庆大霉素和5%胎牛血清(FCS), 37°C的5%的股份有限公司₂的气氛。所有试剂都是由西格玛奥德里奇(意大利米兰)。

2.2。治疗

脂多糖(LPS) E。杆菌菌株055:B5作为积极的控制。有限合伙人的浓度为1μg / mL或不是在重组蛋白或单克隆抗体的存在。

18、24和48小时后处理,上层的收获,和合适的整除储存在−80°C到细胞因子分析。

2.3。细胞毒性测试

决定细胞生存18 h, 24小时,48 h后文化比色测定被用作描述Mosmann [22]。分析是基于四唑盐3 - (4、5 dimethylthiazol-2-yl) 2、5 diphenyltetrazoliumbromide (MTT),一个淡黄色衬底所裂解活性线粒体产生一个深蓝色甲瓒产品。简单,细胞被播种到96孔文化板块的10⁴每口井。板然后孵化在37°C的氛围中5%的股份有限公司₂18 h、24小时和48 h。中被丢弃,MTT试剂补充道。板是在37°C reincubated额外3 h允许甲瓒发展。板块与microelisa阅读器阅读使用的波长570 nm。细胞毒性的百分比计算如下:

2.4。鲎试验

培养基和试剂检测内毒素的存在使用E-Toxate工具包(σ,米兰)被发现包含< 10内毒素的pg / mL。

2.5。细胞因子的评价

上层清液从体在不同的实验条件,是收获,离心机和保持在−80°C到滴定TNF -的存在α和il - 1β由一个immunoenzymatic方法(ELISA);使用的工具由研发系统(意大利米兰)和NGAL (BioPorto诊断、维罗纳、意大利),分别。肿瘤坏死因子-的最小检测量α小于1.6 pg / mL, il - 1β小于1 pg / mL, NGAL小于1 pg / mL。

2.6。细胞因子和单克隆抗体

使用的浓度是1 ng / mL重组人类(rh) il - 1β和10 ng / mL重组人类(rh) TNF -α。

单克隆反人类的肿瘤坏死因子-α(mAbvsTNF -α)(ND50是0.015 - -0.06μg / mL的人类肿瘤坏死因子- 0.25 ng / mL的重组α)和单克隆反人类的il - 1β(mAbvsIL-1β)(这个ND50反人类的il - 1β抗体是决定大约0.05 - -0.1μ50 g / mL的pg / mL rhIL-1β在使用D10.G4.1细胞增殖试验)被添加到人类体LPS处理的时间。所有试剂都是由研发系统(意大利米兰)。

所需的抗体中和il - 1的浓度β和肿瘤坏死因子-α活动依赖于细胞因子浓度。

2.7。统计评估

结果表示为三个实验的手段±标准差(美国)。数据分析使用单向方差分析(方差分析)和Student-Newman-Keuls测试。被认为是在统计上显著的差异< . 05的价值。

3所示。结果

这项队列研究患者的主要特征归纳在表格1。

表2显示了动力学(18、24和48小时)il - 1β和肿瘤坏死因子-α从不同的捐赠者释放体。没有基底il - 1的生产β和肿瘤坏死因子-α被发现在任何组织的检查。有限合伙人触发体从不同的供体组织高水平的il - 1明显释放β和肿瘤坏死因子-α。特别是,两体的上层清液中细胞因子的水平从商品明显高于前和postHDF ()。此外,il - 1的水平β和肿瘤坏死因子-α从postHDF体体获得的高于从preHD ()。il - 1的动力学β和肿瘤坏死因子-α在24小时后显示生产高峰LPS-stimulation所有的实验条件。孵化时间(18、24和48小时)没有显著影响细胞的生存能力(数据未显示)。

图1报告结果对il - 1的作用β对NGAL生产。没有发现基底NGAL的生产从preHDF体和postHDF病人或商品。

体诱导显著upregulation NGAL LPS-stimulation,尿毒症患者和HS对如果体()。当重组摘要意思β被添加到如果体,upregulation NGAL生产获得了所有组对与有限合伙人获得的治疗()。此外,添加rhIL-1β对体LPS-stimulated诱导NGAL水平获得类似于体rhIL-1对待β在pre和postdialysis病人,而在体与有限合伙人和rhIL-1 HS联合治疗β确定生产NGAL大于只与rhIL-1治疗的患者β()。

的尝试,由于上述发现,获得进一步了解il - 1的作用β对NGAL调制发现il - 1的中和β单克隆抗体在LPS-stimulated体确定predialysis患者(NGAL生产减少50%),并减少60% postdialysis患者()。然而,il - 1的中和β确定清楚生产体从健康受试者对LPS处理体()。有趣的是地址,在所有的实验条件,从preHDF患者体产生少量NGAL相比与postHDF病人;水平更低体从海关。NGAL动力学显示峰值在24小时生产所有的实验条件。

根据上面的数据,我们调查是否TNF的含量α上层清液中发现研究(表体的所有组1)可能参与调节NGAL生产。

报告的数据图2显示,肿瘤坏死因子-α对NGAL释放的影响从不同的供体组织体。

添加rhTNF -α,如果体决定的upregulation NGAL生产只有在体从pre和postHDF ()。相反,细胞从HS的rhTNF -α未能触发NGAL的生产。

此外,添加rhTNF -α对LPS-stimulated体诱导高水平的NGAL pre和postHDF相比,观察体rhTNF对待α独自一人()。体的健康的捐赠者,联合治疗(有限合伙人/ rhTNF -α)确定的出现明显的NGAL rhTNF——后对大量观测α治疗()。

此外,TNF的中和α单克隆抗体在LPSstimulated体决定的下调NGAL生产细胞前后透析患者()。相反,从商品的中和体TNF -α对NGAL生产没有任何影响。NGAL动力学显示峰值在24小时生产所有的实验条件。

为了证实假设NGAL释放体从HDF患者il - 1的支持β和肿瘤坏死因子-α在另一个一系列的实验,我们中和这两种细胞因子。获得的结果在图所示3。出乎意料,中和后il - 1β和肿瘤坏死因子-α仍然,尿毒症患者的腭黏膜产生数额可观的NGAL,虽然量小于由有限合伙人()。相反,il - 1的中和β和肿瘤坏死因子-α体的健康的捐赠者决定清理出生产NGAL ()。

4所示。讨论

除了代谢和内分泌功能,肾小管细胞似乎可能发挥重要作用的系统性炎症平衡,参与白细胞行动的复杂动态网络和pro和抗炎细胞因子。失去这个函数可能会导致一个倾向发展全身炎症反应综合征,并可能与慢性炎症状态在终末期肾病(23,24]。

通常,众所周知,补充大量的细胞因子和趋化因子明显参与放大肾损伤的免疫反应25,26]。在文学方面的证据表明,先天和适应性免疫都参与了尿毒症病人。先天免疫系统,激活早期在感染性或炎性州non-antigen-specific的方式,由中性粒细胞,单核细胞/巨噬细胞、树突细胞(DC)和自然杀伤(NK)细胞。相比之下,适应性免疫系统,这就对特定抗原的好几天,包括直流、T和B淋巴细胞。众所周知,不同的免疫细胞之间的相互作用是由一个复杂的网络细胞因子和趋化因子的多效性的影响,协调免疫反应(27]。因此,感应、延续和崩溃的一个特定的细胞因子网络,它控制的细胞事件深受pro和抗炎细胞因子之间的动态关系,以及他们的生产(28]。

中性粒细胞会在尿毒症患者早期和关键的作用。事实上,许多细胞因子可能引起各种炎症介质的合成,其中大部分是中性粒细胞趋化现象的,,然后招募和激活炎症焦点,这可能在诱导组织损伤的原因之一。的因素之一,参与了这一过程,一个关键的角色似乎是由一个先天免疫防御蛋白,NGAL。

在本文中,我们评估HDF终末期肾病患者是否能影响在体外培养在生产NGAL体。此外,我们分析了il - 1的作用β和肿瘤坏死因子-α为了确定是否参与NGAL生产。数据报告表明体获得ESRD患者血液透析hyporesponsive有限合伙人治疗;他们受损的免疫反应的特点是降低il - 1β和肿瘤坏死因子-α对体生产健康的主题。这些研究结果似乎不认同Cowland报道的数据等。18]。证明,有限合伙人不能够诱导NGAL表达式。然而,这种行为可以归因于不同的细胞系统。事实上,这些实验在腭黏膜上皮细胞系,我们从外周血中获得。此外,我们的研究结果表明,il - 1的水平β和肿瘤坏死因子-α由体从postHDF患者高于从preHDF体获得的。我们相信,这取决于血液透析恢复受损的免疫体状态。事实上,体收集病人透析会话结束时明显表现出更大的反应能力在体外期间收集的比体LPS-stimulation preHDF会话。

有趣的是,在所有的实验条件,产生的大量NGAL LPS-stimulated体从preHDF患者低于由体从postHDF病人和小得多比体产生的海关。此外,没有发现显著差异之间的动力学NGAL生产LPS-stimulated体获得preHDF病人在不同测定时间。相反,在LPS-stimulated体从postHDF获得病人和HS,峰值NGAL动力学生产发生在24小时后il - 1的趋势β和肿瘤坏死因子-α生产。这些结果促使我们进一步调查il - 1的作用β和肿瘤坏死因子-α在NGAL调制。

我们的研究结果表明,添加rhIL-1β在体移植NGAL生产在尿毒症患者和HS而添加rhTNF -α体可以增加NGAL生产只有在尿毒症患者。这些数据表明,NGAL生产由海关支持体完全由il - 1的存在β在细胞上清液。另一方面,尿毒症患者的腭黏膜,NGAL生产似乎主要是通过il - 1的支持β和肿瘤坏死因子-α了。为了验证这一点,我们进行了一系列的实验,il - 1中和β和肿瘤坏死因子-α单克隆抗体。il - 1的中和β和肿瘤坏死因子-α在体从海关确定清楚NGAL的生产。然而,出乎意料的il - 1的中和β和肿瘤坏死因子-α没有完全消除NGAL生产从HDF-patients体;事实上,数额可观的NGAL仍在生产。

总的来说,我们的研究结果表明,在体从HS NGAL生产完全由il - 1的支持β,而在体从HDF病人,NGAL生产得到了il - 1的支持β肿瘤坏死因子-α和其他生物中介(年代)。

最近,Karlsen et al。29日)表明,NGAL与TNF -强烈刺激引起的α促炎细胞因子在IL-17面前。我们可以假设肿瘤坏死因子的影响,相关的结果α对NGAL生产由尿毒症患者体可能与th)和th17响应之间的动态关系。还需要进一步的研究来理解这个有趣的生物介质和随之而来的网络细胞他们控制的事件。

悬而未决的问题是,其他生物介质可能发挥作用在体尿毒症患者在决定细胞因子网络的性质,因此在决定的质量和数量微环境信号参与NGAL释放。