文摘
创伤性脑损伤(TBI)能引起肠道炎症反应和粘膜损伤。抗氧化剂转录因子核转录因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)已被证明在我们先前的研究,防止氧化应激和炎症反应在脑外伤后肠道。本研究的目的是测试是否tert-butylhydroquinone(特丁基对苯二酚),Nrf2诱导物,可以防止TBI-induced肠道炎症反应和小鼠黏膜损伤。成年雄性ICR小鼠随机分为三组:(1)假+汽车集团(2)创伤性脑损伤+汽车集团,和(3)创伤性脑损伤+特丁基对苯二酚集团(每组)。封闭的头部受伤使用大厅weight-dropping的方法被采用。肠粘膜细胞凋亡和inflammatory-related因素,如核转录因子(NF -κBκB),肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)、白细胞介素- 6 (il - 6)和细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1),研究了在创伤性脑损伤后24小时。结果,我们发现,口服治疗创伤性脑损伤的前1%特丁基对苯二酚一周明显减少NF -κB激活、炎性细胞因子的生产和ICAM-1表达式在肠道。特丁基对苯二酚管理局也显著减毒TBI-induced肠道粘膜细胞凋亡。本研究的结果表明,特丁基对苯二酚政府会抑制肠道炎症,减少创伤性脑损伤后的粘膜损伤。
1。介绍
创伤性脑损伤(TBI)会导致一些副作用,导致周边器官功能障碍。脑损伤之间的密切关系和随后的肠道粘膜损伤一直是公认的(1,2]。这个病理过程可能不仅影响肠粘膜本身,而且影响远程器官,导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(插件)3]。我们实验室的先前的研究表明,创伤性脑损伤可能导致肠道炎症反应由增加核转录因子(NF -κBκB)和促炎细胞因子,发挥了至关重要的作用在创伤性脑损伤后的急性肠道粘膜损伤的发病机理(4,5]。之后,使用核转录因子2 (Nrf2)基因敲除小鼠红细胞两个相关因素,我们发现Nrf2,即关键转录因子介导的诱导细胞抗氧化防御机制,发挥了重要保护作用限制TBI-induced肠道炎症反应和肠道粘膜损伤(6,7]。然而,尚不清楚是否激活因子Nrf2有保护作用的肠道炎症和创伤性脑损伤有关。
广泛的天然和合成小分子与不同的化学背景已显示诱导Nrf2活性;tert-butylhydroquione(特丁基对苯二酚)是主要的施加强大的抗氧化潜力(8- - - - - -10]。记录,特丁基对苯二酚保护动物和细胞系对急性毒性和氧化的侮辱,可能通过诱导许多cytoprotective和解毒酶,如环氧化物水解酶(11],glutathione-S-transferase [12],glucoronyltransferase [13]。的激活依赖于易位Nrf2从细胞质细胞核通过诱导物与Keap1交互,细胞质阻遏Nrf2 [14]。然而到目前为止,没有发现研究文献中解决Nrf2的激活的疗效特丁基对苯二酚TBI-induced肠道炎症反应。因此,当前的研究的目的是确定在肠道NF -特丁基对苯二酚政府的影响κB活性、促炎细胞因子的表达和创伤性脑损伤后细胞凋亡。
2。材料和方法
2.1。动物
机构批准的所有程序都是动物保护委员会的指导方针,按照美国国立卫生研究院的动物保健和使用。年龄和weight-matched成年雄性ICR小鼠(6 - 8周,28-32 g)购买从中国科学院动物中心,上海,中国。老鼠被安置在23±1°C,湿度动物季度12小时光/暗周期。
2.2。试验协议
实验小组由假+汽车集团,创伤性脑损伤+汽车集团和创伤性脑损伤+特丁基对苯二酚集团(每组)。小鼠创伤性脑损伤+特丁基对苯二酚集团tBHQ-supplemented饮食喂养一周之前受伤,但老鼠假+汽车集团和创伤性脑损伤+车辆组被给予控制食物。特丁基对苯二酚喂养、食物颗粒在咖啡研磨机和干拌粉1%特丁基对苯二酚(w / w)。蒸馏水是添加到粉(等于v / w),彻底混合,并重塑为食物颗粒。球被烤60°C 3 h。控制食物以同样的方式处理,而无需添加特丁基对苯二酚(15]。特丁基对苯二酚的剂量和药物管理已经广泛应用于类似的动物模型(其它地方描述的15,16]。
创伤性脑损伤的小鼠模型是采用描述(17]在我们实验室之前开发的18]。小鼠麻醉与戊巴比妥钠腹腔内注射(50毫克/公斤)。一个圆形,平,6毫米直径聚四氟乙烯扣押是集中在耳朵和眼睛之间。创伤性脑损伤是引起100克体重下降从12厘米高度沿不锈钢字符串,翻译成1200克/厘米。这种模式通常是与20%的死亡率在受伤后的第一个5分钟,之后观察和没有延迟器死亡率(18]。虚假的老鼠受到相同的治疗除了没有受伤。
动物被斩首后24 h虚假或损伤样本集合。每组6只老鼠牺牲了电泳迁移率改变分析(EMSA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),其他的是免疫组织化学和终端原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)研究。EMSA和ELISA分析,老鼠通过心脏穿刺抽血,3厘米段空肠8厘米远的Treitz韧带迅速立即删除并储存在液氮。免疫组织化学和TUNEL研究中,老鼠通过左心室穿刺灌注冷盐水(4°C),其次是4%中性缓冲福尔马林。3厘米的部分空肠拍摄、存储在一夜之间在4%中性缓冲福尔马林,然后嵌入石蜡。
2.3。核内蛋白提取和EMSA
NF - DNA结合活性κB在小肠被EMSA决定。肠道组织的核内蛋白提取和量化如前所述在[6]。EMSA执行使用商业套装(凝胶转变分析系统;Promega,麦迪逊,WI)的方法在我们的实验室。寡核苷酸探针NF -达成共识κB (5′agt TGA GGG广汽TTT CCC gg颈- 3′)和[end-labeledγ- - - - - -32P] atp(免费的生物技术。,Beijing, China) with T4-polynucleotide kinase. EMSA was performed according to our previous study [6]。NF -κ活动是由计算机辅助光密度分析量化。
2.4。ELISA分析
肠道炎性细胞因子的水平,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)和白细胞介素- 6 (il - 6)量化使用ELISA试剂盒特定的鼠标根据制造商的指示(TNF -α从Diaclone研究、法国;il - 1β比利时,il - 6从欧洲Biosource SA)和我们之前的研究6]。肠道组织中的细胞因子的内容表示为pg /毫克的蛋白质。
2.5。免疫组织化学染色
石蜡包埋的部分(4μ米)被用于免疫组织化学分析,执行和一只山羊antimouse细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)抗体(稀释1:200年,研发系统,Inc .,明尼苏达州,美国),根据我们之前的研究6]。显微镜的免疫组织化学染色组织部分是由一个有经验的病理学家蒙蔽的实验条件。是评价部分的评估染色强度(5年级)。“0”表示没有检测到阳性细胞;“1”表示阳性细胞密度很低,“2”表示中度阳性细胞密度,“3”表示更高,但不是最大的阳性细胞密度,“4”表示阳性细胞的密度最高。
2.6。TUNEL研究
石蜡包埋的部分也由TUNEL方法检测到凋亡细胞。程序是根据指令的工具包(ISCDD,勃林格曼海姆,德国)和我们实验室的方法(7]。十绒毛和每个部分的隐窝在光学显微镜下观察,并在100年TUNEL-positive细胞的平均数量计算细胞凋亡指数被分配。独特的细胞凋亡的形态学特征被用来识别凋亡细胞。小群的死细胞碎片被评估为来自一个细胞和给定一个计数,和任何可疑细胞被忽视。
2.7。统计分析
用于统计分析软件SPSS 13.0。所有数据都表示为±SEM。测量受到单向方差分析。实验组之间的差异决定了费雪的LSD期末测验。意义被分配在。
3所示。结果
3.1。EMSA NF -κB
如图1、低肠道NF -κB绑定活动(弱EMSA放射自显影法)中检测出虚假的+汽车集团。与假+车辆组相比,NF -κB结合肠道组织的活动是在创伤性脑损伤的显著增加+汽车集团。在创伤性脑损伤+特丁基对苯二酚,肠道Nrf2绑定活动明显创伤性脑损伤后表达下调。结果表明,特丁基对苯二酚治疗可以显著抑制NF -的激活κB在创伤性脑损伤后的肠道。
(一)
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3.2。ELISA对炎性细胞因子
浓度的炎性细胞因子,包括TNF -α,il - 1β,il - 6在小鼠肠道的虚假的低+汽车组,如图2。与假+车辆组相比,肠道肿瘤坏死因子水平α,il - 1β,il - 6在很大程度上引起的创伤性脑损伤+汽车集团。特丁基对苯二酚政府后创伤性脑损伤可能导致显著降低TNF -α,il - 1β,在小鼠肠道组织中il - 6浓度。
(一)
(b)
(c)
3.3。免疫组织化学的ICAM-1
免疫组织化学分析显示低ICAM-1免疫反应性在虚假的绒毛间质和固有层+车辆集团;参见图3。假+车辆组相比,ICAM-1在创伤性脑损伤的肠道组织显著调节+汽车集团。在创伤性脑损伤+特丁基对苯二酚,ICAM-1水平的免疫反应性明显降低。结果表明,特丁基对苯二酚管理可以显著抑制ICAM-1表达式在创伤性脑损伤后小鼠的肠道。
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(b)
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(d)
3.4。TUNEL肠粘膜细胞凋亡
低凋亡指数被发现虚假+车辆组小鼠肠组织,如图4。在创伤性脑损伤+汽车集团的凋亡指数研究小鼠肠道被发现的价格相比显著增加假+汽车组的动物。在创伤性脑损伤+特丁基对苯二酚,肠道组织中的凋亡指数明显下降。结果表明,特丁基对苯二酚治疗可以抑制肠内凋亡细胞死亡,可能减少创伤性脑损伤后的粘膜损伤。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
本研究显示,包括NF - inflammatory-related因素κB、促炎细胞因子和ICAM-1在创伤性脑损伤后的肠道明显调节时,可以抑制处理特丁基对苯二酚。同时,特丁基对苯二酚治疗显著降低TBI-induced凋亡细胞死亡在小肠。这些发现报道在这里首次表明,特丁基对苯二酚政府可以抑制肠道炎症,减少创伤性脑损伤后的粘膜损伤。
以抵御外源性毒素和损伤,细胞拥有大量cytoprotective和解毒酶的表达正迅速增加响应的侮辱。很多常见的基因包含子元素称为抗氧化反应(是)。一些转录因子可以绑定;然而,Nrf2是主要的结合并激活这些所介导基因产物的表达19- - - - - -21]。最近研究,Nrf2核心作用的细胞生存已经好方能在体外和体内22,23]。重要的是,近年来许多线证据生成隐含的抗炎效果Nrf2多种实验模型(24- - - - - -27]。我们以前的研究表明,创伤性脑损伤,老鼠缺乏Nrf2展出增加肠道炎症反应和粘膜损伤6,7]。这些提供了证据表明,Nrf2在创伤性脑损伤后肠道损伤中起着重要的作用。Upregulation Nrf2可能带来巨大好处TBI-induced肠道炎症损伤。
合成酚类防老剂特丁基对苯二酚作为食品添加剂广泛应用抗氧化剂对人类一直感兴趣的有效诱导物Nrf2 [14,28,29日]。有充分的证据,特丁基对苯二酚治疗增加Nrf2激活和授予保护(14,30.]。体外研究表明,由于Nrf2行动,特丁基对苯二酚是有效的在培养astrogytes诱导相关基因的表达和保护神经元免受氧化损伤31日]。其他体内的神经保护作用研究表明,特丁基对苯二酚氧化应激和缺血性损伤丢失Nrf2-deficient老鼠(14,15]。此外,大多数tBHQ-induced基因在神经胶质神经元和已被证明是依赖Nrf2微阵列分析(29日]。根据上述研究结果,我们假设激活Nrf2特丁基对苯二酚可能代表一个有吸引力的目标打击TBI-induced肠道炎症反应和粘膜损伤。
创伤后的肠道炎症反应的特点是肠道招聘通过激活中性粒细胞和单核细胞的NF -κB,许多炎性细胞因子释放,upregulation粘附分子,已涉及TBI-induced胃肠功能障碍的发病机制4]。NF -κB是其中最重要的促炎的调节器,可激活lesion-induced氧化应激、细菌内毒素、细胞因子,随后transactivate许多细胞因子和粘附分子的表达32]。促炎细胞因子,包括白细胞介素(ILs)和肿瘤坏死因子-α发布后早期炎症刺激,可以启动炎性细胞的浸润到小肠通过激活ICAM-1和其他粘附分子(33]。NF -κB提高了促炎细胞因子的转录激活,反过来激活已知细胞因子NF -κB (34]。积极的反馈被认为用来放大炎症信号和加重组织损伤。我们的研究表明,在创伤性脑损伤后24小时,upregulation NF -κB,肿瘤坏死因子-α,il - 1β在肠中,il - 6是明显可以抑制处理时特丁基对苯二酚。这些结果说明,特丁基对苯二酚政府会抑制肠道炎症后创伤性脑损伤。
创伤性脑损伤后胃肠功能的重大变化可以概括为四个方面:胃肠道粘膜缺血,肠道蠕动功能障碍,肠道屏障的破坏,肠道粘膜吸收功能的改变。细胞凋亡是细胞更新胃肠生理的一个重要因素,它可以引发的有害刺激如创伤、缺血(35,36]。肯定之前我们实验室的研究表明,标志着肠上皮细胞凋亡的发生创伤性脑损伤后,它应该发挥重要作用在肠道屏障损伤和肠道上皮细胞的渗透性增加,导致可能的管腔内的微生物和细菌易位毒素(5,6]。然而,仍然没有有效治疗肠道粘膜损伤造成的创伤性脑损伤。在目前的研究中,我们发现,在创伤性脑损伤后24小时,肠粘膜细胞凋亡明显增加,可能是由特丁基对苯二酚政府镇压。这些结果表明,特丁基对苯二酚可以保护TBI-induced肠道粘膜损伤。
虽然特丁基对苯二酚的确切机制对于抗炎能力仍然是难以捉摸的,一些证据表明,Nrf2和NF -κB信号通路导致病理生理过程。流行的理论是,Nrf2干扰炎症信号通路通过抑制NF -κ通过激活细胞氧化还原状态的维护。氧化应激与活性氧(ROS)被认为是参与胃肠功能障碍继发于创伤性脑损伤的发展(37]。激活的NF -κB信号通路已被证明是对过量的活性氧,是重要的炎症的一代26]。抗氧化剂转录因子Nrf2已被证明限制ROS水平发挥重要作用,从而影响redox-sensitive NF -κB信号通路参与了炎症(19,38]。因此暗示特丁基对苯二酚可能发挥重要作用在抗炎机制的增强细胞抗氧化系统通过upregulation Nrf2信号通路导致减少生产促炎细胞因子和粘附分子表达通过失活的NF -κB信号通路。放心,需要进一步的研究,并将在我们实验室进行的。
总之,结果表明,口服治疗创伤性脑损伤明显减少NF -前特丁基对苯二酚κB激活、炎性细胞因子的生产和ICAM-1表达式在肠道。此外,特丁基对苯二酚政府明显减毒TBI-induced肠道粘膜细胞凋亡。这些结果表明,特丁基对苯二酚也许TBI-induced的有效治疗药物治疗肠道损伤的潜在机制upregulation Nrf2信号通路。
确认
这项工作是支持由鼓楼医院。作者感谢徐李志博士和Geng-bao冯博士的技术援助。w·金、h .倪和y戴了同样的工作。