文摘

在这里,我们研究了在体外由脾巨噬细胞细胞因子的生产从年轻和老年BALB / c野生型(WT)和il - 6基因敲除小鼠(白介素KO)。相对于巨噬细胞获得年轻WT小鼠脂多糖(LPS),那些来自岁WT小鼠减少促炎细胞因子的生产。相比之下,从年轻的巨噬细胞il - 6 KO小鼠相比,LPS刺激产生更高水平的这些细胞因子il - 6岁KO小鼠的细胞。老化或il - 6缺陷不影响的百分比巨噬细胞,或表面的表达toll样受体4 (TLR4)和白介素受体的组件。总体而言,我们的研究结果表明,il - 6在调节过程中发挥作用的巨噬细胞通过改变与年龄相关的缺陷促炎细胞因子,增加的复杂性IL-6-mediated障碍随着年龄增加免疫细胞的功能。

1。介绍

作为免疫系统的一部分,与年龄有关的恶化的(1- - - - - -3),是一种慢性炎性状态即使没有表现出来的疾病。这种状态定义为“inflamm-aging”的特点是高循环促炎因子(il - 1的水平、il - 6、TNF和前列腺素E₂)和抗炎介质(il - 1受体拮抗剂,可溶性肿瘤坏死因子受体,il - 10,转化生长因子β,急性期蛋白,c反应蛋白和血清淀粉样蛋白A),有助于减少老年人的挂载一个适当的免疫反应能力后传染病挑战[4- - - - - -7]。

最突出的一个方面存在的“inflamm-aging”循环的促炎细胞因子水平升高,白介素(IL) 68,9]。为了更好的定义的角色il - 6岁的系统性炎症反应,我们给年轻人和野生型(WT)和il - 6岁淘汰赛(KO)雌性BALB / c小鼠脂多糖(LPS)。炎症的挑战后,il - 6岁KO小鼠改善生存相比,年龄WT老鼠(10]。此外,我们之前报道,il - 6岁KO小鼠显示出减少急性期反应相比,年龄WT老鼠的10]。此外,肝脏损伤大大降低il - 6岁KO小鼠给有限合伙人与LPS-exposed岁WT老鼠(11]。最近,斯塔尔等人报告了类似的结果在雄性C57BL / 6小鼠IL-6KO使用高剂量的有限合伙人(5毫克/公斤),稍微年长组老鼠(26个月大)12比我们的研究)。综上所述,这些观察结果表明il - 6的一个至关重要的作用的一个组成部分,岁的先天免疫反应异常的系统性炎症后的挑战或受伤,这不是性或应变特定角色。

巨噬细胞吞噬作用的抗原,发挥了关键作用,微生物和细胞碎片;杀死入侵的病原体和肿瘤;和伤口愈合13]。许多巨噬细胞的功能由分泌细胞因子,进而,调节多种免疫功能,尤其是炎症反应(14]。老化的细胞因子生产的影响巨噬细胞显示冲突的结果在体外纯化的刺激巨噬细胞数量与有限合伙人在活的有机体内有限合伙人的系统性管理。例如,我们的实验室和其他报道,从老年小鼠巨噬细胞产生更少的肿瘤坏死因子后,il - 6在体外比同等刺激细胞暴露在有限合伙人从年轻的老鼠15- - - - - -19]。这些发现已经观察到,尽管存在“inflamm-aging”和基线升高的炎症在岁健康个体(20.,21]。

由于巨噬细胞被认为是一个重要的促炎细胞因子的来源在活的有机体内可以提出,许多可能的解释这种不一致(22]。在多个可能性,当地环境的影响在体外与年龄在微环境的影响在活的有机体内被认为是(22- - - - - -24]。我们报道了从费舍尔344岁大鼠血清il - 6的水平增加了巨噬细胞获得年轻动物和培养在体外没有兴奋剂(25]。这些观察表明,炎症介质的高生产老年人的结果,在某种程度上,从巨噬细胞与各种因素之间的相互作用在其环境原位。

分析il - 6可能发挥作用在调节巨噬细胞通过改变与年龄相关的缺陷的促炎细胞因子,我们从年轻和暴露脾巨噬细胞WT和il - 6岁KO小鼠有限合伙人。我们的研究表明,il - 6在巨噬细胞通过调节与年龄相关的缺陷促炎细胞因子的改变,这些改变不是由于表面TLR4的表达或il - 6受体的变化。

2。材料和方法

2.1。动物

年轻(2个月)和年龄(18个月)WT雌性BALB / c小鼠购自国家老化研究所的殖民地在哈伦实验室(印第安纳波利斯,)。il - 6 KO小鼠,请提供的曼弗雷德·科夫博士,分子生物医学,苏黎世联邦理工学院,瑞士有一个中断的il - 6在第二个外显子(第一编码外显子)的插入盒(26]。il - 6 KO小鼠backcrossed在BALB / c背景,培育、维护和年龄在泰康利实验室(日耳曼敦,纽约)。年轻的(2个月)和年龄(18个月)雌性BALB / c KO小鼠il - 6在这里描述的实验使用。动物被安置在类似条件下在各自的设施。他们是自由的潜在流行病毒病原体可能会影响他们的炎症反应。所有的动物都维持在一个环境控制设施罗耀拉大学医学中心试验前至少一个星期。牺牲的时候,所有老鼠和器官解剖可见肿瘤筛查和/或严重异常。如果发现,这些动物从研究中删除。这里所描述的实验协议遵循准则建立的出版物,实验动物保健原则(NIH没有出版。86 - 23,1985年修订),芝加哥洛约拉大学机构批准的动物保健和使用委员会。

2.2。细胞隔离和文化

老鼠被公司牺牲₂吸入和随后的颈椎错位。为了避免混淆因素与昼夜节律有关,所有动物保护8点和9点之间进行。脾巨噬细胞被塑料坚持孤立如前所述[17]。短暂,脾脏是无菌和中断产生细胞悬液在RPMI 1640中,补充了5%的边后卫,青霉素(100 U /毫升),链霉素(100g / ml), 2毫米谷氨酰胺(培养基)(GIBCO-BRL大岛,纽约)。与ACK裂解红细胞裂解后缓冲区(英杰公司集团,卡尔斯巴德,CA),白细胞数在血细胞计数器和活力是由台盼蓝排斥。两个细胞被播种在96 - 200年孔板l培养基。孵化后2小时和5%的公司₂,不依从细胞被丢弃与温暖中愿望和洗两次磷酸缓冲盐(PBS)。这个方法导致了附着人口特征为> 98%阳性Mac-3 Di-I-acetylated低密度脂蛋白摄取,正如我们之前报道(27]。贴壁细胞于200年接受治疗l培养基单独或包含100 ng / ml有限合伙人从大肠杆菌0111:B4(σ生物科学,圣路易斯,密苏里州)。在缺乏刺激,巨噬细胞细胞因子水平检测不到([16)和数据未显示)。16小时后上层清液收集和存储。

2.3。促炎细胞因子的测定

肿瘤坏死因子的浓度,il - 1、il - 6和il - 12在巨噬细胞上清液测定的商用OptEIA ELISA试剂盒(圣地亚哥BD Pharmingen CA)根据制造商的指示。这些包的最低可检测极限是15.6 pg / ml。数据表示为pg / ml。

2.4。流式细胞术

总脾细胞悬浊液得到上面的报道。流式细胞术进行如前所述[16,17]。简单地说,阻止非特异性染色后anti-CD16 / CD32 (FcIII / II;圣地亚哥BD-PharMingen CA),总脾细胞悬浮液是沾APC-conjugated anti-CD3 (细胞,克隆145 - 2 - c11 eBioscience,圣地亚哥,CA), PE-conjugated anti-CD4 (圣地亚哥细胞,克隆GK1.5 eBioscience CA), FITC-conjugated anti-CD8 (细胞,克隆53 - 6.7,eBioscience,圣地亚哥,CA), FITC-conjugated anti-Ly49c (细胞,克隆5 e6, eBioscience,圣地亚哥,CA), Alexa萤石750 -共轭anti-F4/80 (细胞,克隆BM8,英杰公司Corp .)、贝CA), PE-conjugated anti-IL-6Ra (圣地亚哥细胞,克隆D7715A7 BD-PharMingen CA), APC-conjugated anti-CD19 (细胞,克隆MB之时价,eBioscience, CA),圣地亚哥biotin-conjugated anti-TLR4 (圣地亚哥细胞,克隆MTS510 eBioscience CA), biotin-conjugated anti-gp130 (细胞克隆125623年,研发系统公司、明尼阿波利斯、锰)。与PerCP-conjugated biotin-conjugate孵化后,细胞被孵化链霉亲和素(细胞,eBioscience,圣地亚哥,CA)。FACSCanto正欲流仪决定了使用流式细胞分析仪(bdi,圣何塞,CA)和数据分析与FlowJo软件(树明星Inc .,亚什兰或)。

2.5。统计分析

数据表示为±SEM。方差分析和Tukey-Kramer多个比较被用来确定统计学意义使用GraphPad Prism 2.0版统计软件包(美国圣地亚哥,CA)。一个P值小于被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。巨噬细胞的细胞因子水平从岁IL-6-Deficient LPS刺激后的老鼠

当刺激在体外有限合伙人,从老年小鼠巨噬细胞产生的细胞因子少于同等刺激细胞从年轻的老鼠15- - - - - -19]。来确定这种表型可能在一定程度上取决于il - 6,高架在岁健康个体的循环(9,10,28,29日),我们评估脾巨噬细胞的促炎细胞因子生产获得年轻WT KO小鼠和il - 6岁。从年龄和年轻老鼠巨噬细胞产生促炎细胞因子在LPS刺激(数字1(一)- - - - - -1 (d))。正如之前报道的(15- - - - - -19),从年龄WT小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子的产量下降和il - 6(55%),以及il - 1(80%)和il - 12(35%)相对于脾巨噬细胞从年轻WT小鼠获得给定的有限合伙人。类似于从年龄WT小鼠巨噬细胞,细胞因子的生产由年轻的巨噬细胞il - 6 KO小鼠肿瘤坏死因子降低(67%)、il - 1(31%)和il - 12(71%)相对于年轻的WT老鼠(图1)。相比之下,从年轻的il - 6 KO小鼠巨噬细胞相比,有限合伙人暴露诱导高细胞因子生产的细胞il - 6岁KO小鼠肿瘤坏死因子(1.3、2.2和1.2倍,il - 1和il - 12, resp)(图1)。KO小鼠细胞因子生产的巨噬细胞il - 6岁是升高的细胞相比,年龄WT小鼠肿瘤坏死因子(1.8、3.7和1.9倍,il - 1白介素、职责)。总的来说,这些结果表明,il - 6在调节过程中发挥作用的巨噬细胞通过改变与年龄相关的缺陷促炎细胞因子的生产。

3.2。对脾细胞细胞群体年龄和il - 6的影响

白细胞介素- 6是一种多效性的细胞因子,一个重要的角色在支持T和B淋巴细胞的生长30.在淋巴组织,主要在脾(31日]。因此,缺乏表达il - 6可能修改脾细胞的表型和细胞因子的生产时讲究的在体外。为了测试这个假说,脾细胞悬浊液接受了检查,他们被分头检查,通过流式细胞仪对特定的脾细胞细胞的数量。T细胞的比例是由分析脾细胞的细胞表面标记CD3 (T细胞),CD4细胞(CD3⁺/ CD4⁺;辅助/诱导细胞)和CD8 (CD3⁺/ CD8⁺;抑制器/细胞毒性细胞)。相对于年轻WT老鼠,CD3的百分比⁺T细胞从年龄WT小鼠脾细胞减少(13%,),表1。有趣的是,这种差异更明显的脾细胞il - 6岁KO小鼠相对年轻的细胞il - 6 KO小鼠(CD3减少24%⁺T细胞,)。脾CD3的分析⁺/ CD4⁺辅助/诱导T细胞比例并没有发现老化或il - 6的影响。然而,CD3⁺/ CD8⁺抑制器/细胞毒性T细胞减少从年龄WT小鼠脾细胞(25%,),相对于年轻WT老鼠。此外,CD3下降显著(47%)⁺/ CD8⁺抑制器/细胞毒性T细胞il - 6岁被发现在KO动物,相对于从年轻的脾细胞il - 6 KO小鼠。分析在脾脏B细胞百分比也通过测量B220评估⁺脾细胞、表1。脾脏的年轻WT老鼠B220组成的40%⁺细胞。这个比例略增加衰老和il - 6的缺陷,然而,这些差异没有达到统计学意义。同样,F4/80的分析⁺巨噬细胞老化的人口没有影响或缺il - 6百分比。

3.3。年龄和il - 6的影响在巨噬细胞TLR4的表达

TLR4参与与年龄相关的缺陷在LPS激活后巨噬细胞激活记录广泛(了1,2])。然而,TLR4缺在衰老和il - 6水平是未知的。分析TLR4的表达在巨噬细胞il - 6岁KO小鼠脾脏巨噬细胞被流式细胞仪检测。正如我们之前的报道(16,17),F4/80⁺WT岁巨噬细胞从老鼠并没有表现出与年龄有关的表面差异TLR4表达WT岁年轻WT(23.0%和24.7%),表2。在F4/80⁺巨噬细胞il - 6的KO小鼠,类似的TLR4的百分比⁺细胞被发现相对于那些来自WT老鼠,不管年龄或缺il - 6在年轻的il - 6 KO(24.6%和23.6%在il - 6岁KO)。这些结果表明,巨噬细胞TLR4表达的变化不是负责促炎细胞因子的增加生产从il - 6岁KO小鼠巨噬细胞中观察到。

3.4。年龄和il - 6的影响在巨噬细胞il - 6受体表达

在活的有机体内以及在体外研究表明,刺激与il - 6影响il - 6受体的表达32,33]。分析老化和il - 6的影响il - 6信号的初始步骤,我们测量表面水平的il - 6受体总共脾细胞悬浮液通过流式细胞术。的细胞因子il - 6信号是由绑定80 kda糖蛋白链(IL-6Ra / CD126) (34]。F4/80⁺巨噬细胞从岁WT老鼠没有IL-6Ra表达细胞百分比的差异(表2)或表面的水平表达的平均荧光强度(MFI)(数据未显示)相对于那些从年轻WT老鼠。在F4/80⁺KO小鼠的巨噬细胞il - 6,类似水平的IL-6Ra发现相对于那些来自WT老鼠,不管年龄和il - 6的缺乏。IL-6Ra绑定后il - 6,二聚signal-transducing糖蛋白130 (gp130 / CD130)导致激活Janus激酶(激酶)/信号的换能器和转录激活信号转导通路(STAT) 3。如表所示2F4/80 gp130水平⁺从年轻还是年龄WT老鼠巨噬细胞相似。没有老化或il - 6的影响被发现在细胞表面表达gp130 KO小鼠il - 6。

4所示。讨论

在这个报告中,我们分析的影响通过巨噬细胞衰老和细胞因子il - 6在生产在体外。我们的结果添加到公布的数据(15- - - - - -19]显示减少促炎细胞因子的合成和释放,TNF,il - 1、il - 6和il - 12,在巨噬细胞从年龄WT老鼠相比年轻WT LPS刺激后的动物。此外,我们第一次发现击出白介素恢复促炎细胞因子的生产从老年小鼠巨噬细胞从年轻WT小鼠巨噬细胞的水平。年龄在WT老鼠相比,脾细胞il - 6岁KO小鼠类似CD3的相对丰度与年龄相关的减少⁺T细胞、CD3⁺/ CD4⁺T细胞,Ly49c⁺NK细胞,然而,一个更为明显减少在CD3被发现⁺/ CD8⁺T细胞。没有发现老化或il - 6的影响缺乏F4/80的百分比⁺巨噬细胞和CD19⁺B细胞数量,无论是在表面的TLR4的表达,也不是白介素受体的组件,IL-6Ra, gp130。总的来说,我们的研究结果表明,il - 6在调节过程中发挥作用与年龄相关的缺陷在巨噬细胞促炎细胞因子的变化。额外的调查需要阐明这些影响所涉及的细胞机制。

巨噬细胞显示先进的影响在他们的许多生物学性质包括细胞因子生产(最近了1,2])。一般来说,当讲究的在体外有限合伙人,从老年小鼠巨噬细胞产生低于同等水平的促炎细胞因子刺激细胞从年轻的老鼠15- - - - - -19]。相比之前报道,从年轻WT小鼠巨噬细胞,巨噬细胞从岁WT小鼠肿瘤坏死因子的产量下降和il - 6。il - 1和白介素生产LPS刺激后从年龄WT小鼠巨噬细胞也减少。这些结果是重合的结果与Chelvarajan合作者和独立源用于隔离的巨噬细胞(塑料坚持利用在当前研究中与未分离脾细胞的积极选择用磁排序CD11b Chelvarajan和合作者(所使用的微18])。总体而言,我们的研究结果同意出版文学展示从年龄WT老鼠巨噬细胞细胞因子减少生产。

白细胞介素- 6岁缺乏小鼠巨噬细胞的细胞因子生产状况恢复年轻的WT老鼠。老年性改变巨噬细胞的功能源于内在和外在的缺陷和可能的后果复杂的交互与其他细胞类型或老年人环境(22]。我们的研究结果,添加到前面的结果24,25,35- - - - - -37),建议改变巨噬细胞的细胞因子的生产结果部分的年长老鼠从外在因素的表达的变化。年轻的细胞il - 6 KO小鼠显著降低il - 1的含量,肿瘤坏死因子,白介素孵化有限合伙人时相对于WT同行。我们仍然没有一个解释这些结果,不过,它可以推测修改组件的稳态细胞通路之间共享的il - 6信号级联,促炎细胞因子表达式(即。、Erk和AP-1)可能是一个合适的常见的链接。进一步的研究将阐明这个问题。

白细胞介素- 6支持脾T和B淋巴细胞的生长30.,31日]。因此我们的兴趣研究如果老化的影响,缺乏由巨噬细胞在细胞因子il - 6生产可以归因于这些细胞在脾脏的数量的变化。虽然有些我们测试显示的脾细胞数量与年龄相关的细胞因子释放减少,不管存在il - 6,我们没有找到F4/80变化⁺巨噬细胞年轻WT老鼠和年轻KO小鼠il - 6之间。但出乎意料的是,降低更明显CD3中找到⁺/ CD8⁺T细胞(25%在il - 6岁KO WT岁和47%,)。我们的结果同意科夫和合作者的指示没有il - 6的影响缺乏的骨髓和脾脏B细胞室年轻KO小鼠il - 6,与正常的表达B220, IgM, IgD, CD23 [38]。在这个研究中T细胞受体的表达,,,链,CD4、CD8 CD44 (Pgpl), CD24 (HSA)从年轻的脾细胞il - 6, KO小鼠持平(38]。科夫等人也减少了30%到50%的总数在年轻的脾细胞il - 6 KO小鼠相比,年轻的控制(38]。同样,我们观察到的脾细胞数量减少40%年轻KO小鼠il - 6以及concanavalin-A诱导增殖反应相对于年轻WT老鼠(数据未显示)。总的来说,这些结果强调il - 6参与特定的淋巴细胞的扩张和功能子集。进一步的调查将有助于澄清il - 6的影响的一些与年龄相关的T细胞缺陷,如淋巴细胞活化。

老化的影响在巨噬细胞中细胞信号传导等分析了几组(综述(39])。Renshaw和合作者与有缺陷的细胞因子的生产从老年小鼠巨噬细胞LPS刺激后所有的子类信使rna通常下降以及减少TLR4的表达在细胞表面从年老的老鼠相比,那些年轻的老鼠(15]。然而,从单独的两个独立的研究组织未能显示在细胞表面表达TLR4的年龄相关性差异(16,18]。在我们的研究中,我们显示出类似的表面表达TLR4在从年龄WT小鼠巨噬细胞16,18]。TLR4表达不受老化或缺乏从衰老白介素KO小鼠巨噬细胞il - 6。以前,我们报道,il - 6岁KO小鼠相似的lipopolysaccharide-binding血清蛋白(LPB)相对于年龄WT老鼠(10]。高龄和il - 6缺陷修改了产生这种蛋白质的生产能力在活的有机体内炎症后的挑战[10]。因此,年龄或il - 6缺乏似乎并不影响表面初始有限合伙人参与信号转导分子的表达。这个结论似乎也有效的组件在巨噬细胞il - 6受体的水平保持不变,不管年龄和il - 6的缺乏。在人类中,有一个显著增加可溶性白介素受体直到70岁左右,70岁后逐渐下降的水平(40]。在老鼠中,il - 6管理引发了upregulation组件的几个组织il - 6受体的小鼠胚胎在早期发育(32]。然而,享年推广/ lpr小鼠,基因倾向于自身免疫性疾病的发展和报道水平的il - 6和sIL-6R水平升高,有一个以上的差别明显对这些gp130脾T细胞(33]。我们的研究结果不同于出版文献和表明,il - 6表达的差别或对这些受体在其他模型不太可能在巨噬细胞il - 6“长期缺席”时,也许替代补偿机制在细胞il - 6岁KO小鼠。最有可能在我们KO小鼠il - 6岁机制负责年龄相关性的影响il - 6在LPS-mediated细胞激活巨噬细胞中观察到可能产生在细胞层面,如巨噬细胞中所观察到的年龄WT老鼠。这样的例子可能包括缺陷细胞内激活瀑布(15- - - - - -17,41]。

只有少数出版物il - 6和衰老的影响在特定的细胞参与炎症反应。大部分的工作已经在小鼠模型的系统性炎症反应燃烧伤害后,在脓毒症,或之后有限合伙人管理。在这些研究中,我们分析了老化和il - 6对肝的影响在两个模型的系统性炎症反应损伤:背烫(烧)伤与腹腔内有限合伙人管理。证据从组织学观察显示获得相当数量的多形核细胞(中性粒细胞)肝脏burn-injured老鼠不管年龄和il - 6的不足。然而,增加肝中性粒细胞在野生型小鼠(WT)岁给有限合伙人相对于年轻WT老鼠给有限合伙人。积累肝可大大降低中性粒细胞在KO小鼠il - 6岁给定的有限合伙人与LPS-exposed岁WT老鼠。这些结果表明,中性粒细胞的作用的侮辱specific-hepatic损伤介导的il - 6岁动物(11]。斯塔尔和合作者对il - 6的表达在不同的组织在年龄WT老鼠LPS-induced系统性炎症。在不同组织测试,从附睾的白色脂肪组织脂肪垫最高水平的il - 6表达mRNA在年轻和老年小鼠更高水平的5.5倍。免疫组织化学显示LPS-induced il - 6表达对脂肪细胞和基质细胞有关。il - 6岁KO小鼠表现出死亡率减少到有限合伙人提出的有害影响il - 6超表达的年龄(12]。这些结果表明,脆弱性增加系统性炎症随着年龄的增长,部分原因是增强il - 6由脂肪组织生产。总体而言,其他细胞的作用,除了巨噬细胞,在工作记录先进的年龄和il - 6在活的有机体内由上面两个出版物显示(建议11,12]。这份报告是第一个分析老化和il - 6的影响在巨噬细胞体外细胞因子的生产。进一步的研究将阐明细胞机制参与我们的研究结果以及其他细胞衰老和il - 6的影响。

缩写

IL:	白介素
IL-6Ra:	白介素受体拮抗剂
柯:	基因敲除
有限合伙人:	脂多糖
小额信贷机构:	平均荧光强度
TLR4:	toll样受体4
肿瘤坏死因子:	肿瘤坏死因子α
WT:	野生型。

确认

作者感谢米歇尔·摩根女士为优秀的技术援助。主任帕梅拉·l·Witte博士罗耀拉大学的免疫学和老化程序被公认为有思想的讨论。这项工作是由美国国立卫生研究院的R01 AG018859 (e . Kovacs), + 30 AG029724(诉Nomellini)和F31 AA017027 (j . Karavitis)。