文摘

砷与多个有关有害影响在细胞水平。这些缺陷可能与间接损害免疫系统的完整性,尤其是在淋巴人口。描述砷氧化还原状态的影响在这个人口,铜冶炼厂工人和砷未曝光的捐助者参与了这个研究。我们分析了尿液样本和淋巴细胞丰富分数从捐赠者定砷含量和淋巴细胞增殖。此外,我们研究了氧化标记MDA,维生素E和供体血浆中SOD活性。我们证明在人类暴露于高砷浓度,淋巴细胞MDA和尿砷含量与SOD活性表现出正相关,负相关,血清维生素E水平。引人注目的是,从砷暴露人群应对多克隆淋巴细胞刺激器,phytohemaglutinin,更高的利率的胸苷掺入比控制人口的淋巴细胞。类似的,在体外对砷的反应观察使用T细胞系。我们的研究结果表明,人体长期接触砷诱导氧化损伤相关的淋巴细胞,并可能被视为比评价T细胞监测。

1。介绍

过渡金属元素是无处不在的环境中,通常存在于土壤中数量很低,食物,和水。然而,有些地方的地质水平高和相关经济活动,导致人类慢性接触有毒的金属。砷(As)是一种发生在大多数生态系统自然过渡金属在智利北部(地区)的水文地质特征和它的存在是由人类活动增强。该地区密集的铜矿开采增加了土壤中砷的含量和水,从而增加对人类健康的风险(1]。然而,由于开采过程,特别是周围的矿山和冶炼工厂在奇卡马塔矿,高水平的砷在空气中直接影响矿工(2- - - - - -4]。研究砷的影响对人们在工作场所被认为是重要的为了测量煤矿工人的职业风险(5]。例如,许多负面影响已被归因于慢性砷暴露,包括不同类型的癌症的出现(6),类似于铜冶炼厂工人在美国的研究显示,接触和癌症之间的关系(7]。同样,在智利北部一个回顾性研究涉及人们暴露在高砷地区显示肺癌的发病率增加,皮肤,和膀胱癌8]。

在分子水平上,physiopathological效果与砷毒性似乎涉及不同的机制和细胞内的目标。氧化应激是最记录机制的毒性和致癌性。氧化应激是激进的氧物种之间的不平衡的结果(ROS)生产和抗氧化防御系统。抗氧化反应是最有效的细胞防御机制之一。许多酶和非酶的因素参与细胞保护清理和清除活性氧。超氧化物歧化酶(SOD)和维生素E的主要酶和非酶的机制,分别参与抗氧化反应。的主要活性化合物氧化应激和氧化信号诱导的活性氧,能够破坏分子DNA,蛋白质,和膜脂质,产生致癌信号通路的激活。一般来说,最重要的目标arsenic-containing化合物似乎线粒体蛋白质从呼吸链电子的偏转产生活性氧。,ROS可能由胞质酶和过氧化物酶活动或氧化 来 (综述[9])。ROS生产,可能导致攻击,不仅与抗氧化防御系统和DNA,但也对膜磷脂、非常敏感的氧化,产生过氧化氢自由基和丙二醛(MDA)。在这方面,激进的食腐动物的应用显示的参与As-induced活性氧诱导的脂质过氧化反应,以及DNA损伤(10]。

这项工作的目的是确定是否arsenic-driven氧化与潜在变化活动显示了相关淋巴细胞获得铜冶炼厂工人。我们确定在体外从高度暴露人口显示淋巴细胞高胸苷掺入比控制人口。此外,尿砷含量之间的正相关和淋巴细胞MDA含量和SOD活性,以及与血清维生素E水平成负相关的关系,观察。同样,SOD有高度暴露的活动增加了个人和正相关,如尿液。我们的结果表明,慢性暴露诱发淋巴细胞的氧化损伤。

2。材料和方法

2.1。道德

本研究进行的安托法加斯塔,智利北部地区,矿工环境暴露于高水平的砷。协议是大学的伦理委员会批准的圣地亚哥,智利。所有受试者签署知情同意书。

2.1.1。志愿者

从160年冶炼厂工人(部分转换器),他们招募了一群40在这项研究中,工人满足下列条件:不吸烟,没有心血管疾病,也没有严重超重的问题,但由于久坐不动的习惯(他们经常进行体育运动)。他们都没有显示,酗酒问题或症状的慢性疾病如高血压或糖尿病。志愿者的平均年龄 年(范围29-57),高度 厘米(范围1.60 - -1.81),重量 公斤,身体质量指数 (范围21.5 - -29)。作为一个控制,32人的平均年龄 年未曝光的砷胡瓜鱼是从Antofagasta招募的。对照组被暴露在饮用水中砷的浓度最小,与尿检测不到的水平。关于样品,第一个上午尿样和其他收集尿液样本在聚丙烯试样容器和储存在−在使用前20°C。血液样本被使用密封的乙二胺四乙酸(EDTA)真空采血管Pb-free试管。样本储存在4°C不到8 h,直到细胞分离。Lymphocyte-enriched分数从血液样本中获得使用Ficoll-Histopaque梯度沉积根据制造商的协议(σ化学。有限公司,圣路易斯,密苏里州)。

2.2。扩散分析

驴淋巴细胞增殖(3H] tdr掺入试验是在标准条件下进行,如前所述[11]。简单地说, 在96孔板的细胞被播种,同时暴露了亚砷酸钠(10−6米)和0.5μg / ml PHA(σ化学。有限公司,圣路易斯,密苏里州)。细胞培养48 h,然后用2脉冲μCi /的[3H]热带病研究和培训特别规划(Amersham生命科学)。24小时后细胞恢复和细胞溶解10%三氯乙酸。的公司3H]热带病研究和培训特别规划被液体闪烁测量(贝克曼,LS 6500)。背景决心利用nonstimulated细胞增殖和减去从总数、Jurkat细胞

2.3。测定尿中砷的含量

尿液样品在室温下解冻,稀释10倍,离心机在4°C 3000×g 30分钟。沉淀是丢弃,上层清液是通过一个0.45μ过滤器(水域,GHP Arcordisc Minispike)。然后上层清液稀释至10毫升,总砷含量的量化进行了使用原子吸收分光光度计,配备了一个标准的瓦里安空气乙炔火焰雾化器,如前所述在[12,13]。检测是使用系统耦合流动注射分析氢化物发生原子吸收光谱法(FIA / HGAAS),如前所述在[14]。

2.4。测定氧化标记

MDA形成被用来量化组织的脂质过氧化反应和测定硫代巴比土acid-reactive材料。五百万个细胞中均质1.15%氯化钾缓冲区。匀浆被添加到反应混合物组成的1.5毫升的0.8%硫代巴比土酸,2毫升8.1% SDS(卷/卷),1.5毫升的20%(卷/期)乙酸(pH值3.5),和6毫升的蒸馏H2在90°C O和加热45分钟。样本在室温下冷却后,通过离心10分钟,每分钟10000转,吸光度测量在532 nm通过使用1,1,3,3-tetramethoxypropane作为外部标准。脂质过氧化物水平被表示为nanomol MDA /毫克的蛋白质。维生素E如前所述使用高效液相色谱法测定(15]。标准曲线是由色谱仪已知数量的α生育酚(西格玛化工有限公司)。溶剂都是高效液相色谱法和微孔过滤0.22年级μm膜之前使用。这些都是用5毫升乙醚和甲醇使用前。维生素E是筛选了硅胶列(债券Elut SI # 601313 Analytichem国际)和检测是由高效液相色谱二极管阵列检测器。Misra SOD活性测定使用的方法和Fridovich16)基于抑制肾上腺素的自动氧化肾上腺素红。

2.5。统计分析

皮尔森的 价值决定测试之间的统计相关性MDA,维生素E, SOD活性和尿液中砷的浓度。尿液的差异之间的内容高度暴露组和居中者使用U-Mann惠特尼试验进行了分析。的差异3H-thymidine合并在淋巴细胞之间的控制和展示出来的工人进行了分析使用一个未配对 以及与韦尔奇的修正。多个直系的尿液浓度之间的相关分析结果变量和样本T细胞增殖;MDA和维生素E浓度是血浆的因果变量。使用Graphpad prism 5.0统计分析软件。所有的统计分析的价值与意义 。

3所示。结果

3.1。砷在淋巴细胞暴露人口的影响

暴露于砷已与增加患病率在人类开发几种疾病,包括基因毒性损伤和癌症。本研究的主要目的是评估砷对淋巴细胞的影响,因为这些细胞损伤可能高度暴露人群的疾病的发展。首先,我们评估(3H] tdr掺入PHA-stimulated淋巴细胞分离出一个高度暴露组中,对照组的人来自同一个地区。如图1(一)淋巴细胞增殖,观察两组人进行了研究。然而,淋巴细胞从那样暴露人口显示较高的3H] tdr掺入相比对照组( 和 分别地, )。有趣的是,有一个正相关( )(3H] tdr掺入和砷盐存在于尿液收集24 H(图1 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
比较砷暴露对淋巴细胞的增殖的影响独立于低收入和high-As-exposure人群。相关的淋巴细胞增殖和尿排泄的高度为暴露人口。(一)扩散被比较的评估3H-Thymidine公司([3H]热带病研究和培训特别规划,cpm)淋巴细胞分离low-As-exposure组(对照组, = 3 1 从high-As-exposure组)和( = 5 0 )。两组之间的差异被发现统计学意义(U-Mann-Whitney测试 = 。 0 1 3 8 )。(b)之间的关系3H-Thymidine合并和砷浓度尿(ppm)的高度暴露人口( = 5 0 )。确定了两个变量之间的联系 皮尔森( = 。 0 0 2 )。

我们也评估了MDA、维生素E和原生质的SOD活性在控制和暴露人群确认淋巴细胞氧化应激和损伤。如图2(一个)MDA两种人群的分布是不同的,在更高的高度暴露人口的等离子体相比,水平低的人口( 和 μM,分别地。 )。分析显示一个重要和积极的血浆MDA水平之间的相关性和尿液中砷( )(图2 (b))。如果氧化应激与氧化代谢产物的增加,对砷受伤也可能与血浆的天然抗氧化剂的浓度的变化。支持这个想法,我们发现,维生素E高度暴露人群的血浆水平低于水平低的人群( 和 分别地, )(图3(一个))。此外,我们发现了一个逆相关性维生素E和尿砷的浓度( )(图3 (b))。SOD活性血浆样品中测定对照组明显高于high-As-exposure人口( 和 职责。)(图4(一)),这与有关酶活性浓度尿液从这个人口( )(图4 (b))。总之,这些结果表明,砷诱发显著增加的损失由自由基在高度暴露的人。确认之间的关联砷和氧化还原状态,描述的变化倍数嫡系的相关性进行了分析。这种相关性表明尿液浓度并不与样本T细胞增殖( ),但确实与血浆的MDA浓度( )和维生素E浓度( )。此外标准化相关系数表明,增加尿中浓度与血浆MDA浓度的增加和减少血浆维生素E(标准化系数0.374−0.294,resp)。表明氧化应激增加。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
比较砷暴露对脂质过氧化的影响在低收入和政策影响人群的血样。(a)的比较MDA分布在血液样本隔绝low-As-exposure(控制, = 3 1 )和high-As-exposure ( = 5 0 )人群。脂质过氧化是评估血浆MDA浓度。统计分析显示两组(测试U-Mann-Whitney之间的显著差异 < 。 0 0 0 1 )。(b)相关性MDA浓度和尿排泄的高曝光率等人口( = 5 0 )。这两个变量之间的关系所决定的 皮尔森( < 。 0 0 0 1 )。
(一)
(一)
(b)
(b)
图3
比较水平的维生素E血浆样本中低收入和政策影响人类和相关性血浆维生素E浓度和尿排泄的高度为暴露人口。(一)维生素E浓度剖面的等离子体low-As-exposure集团( = 3 1 )和high-As-exposure集团( = 5 0 )。统计分析显示两组(U-Mann-Whitney测试之间的显著差异 < 。 0 0 0 1 )。(b)血浆维生素E浓度之间的关系(μ米)和尿液浓度(ppm)的高度暴露人口。由两个变量之间的关系 皮尔森( < 。 0 0 1 8 )。
(一)
(一)
(b)
(b)
图4
比较血浆样本中SOD活性水平的低收入和政策人口和SOD活性之间的相关性,从高度为暴露人口的尿排泄。(a)在血浆SOD活性的样品low-As-exposure集团( = 3 1 )和high-As-exposure集团( = 5 0 )。数据平均标准误差(用图表表示 < 。 0 0 0 1 )。(b)血浆SOD活性和在尿液浓度之间的关系从高度暴露人口( < 。 0 0 0 1 )。建立了统计差异之间的SOD活性组根据U-Mann-Whitney测试。
3.2。砷对人体细胞的体外增殖的影响

一旦淋巴细胞反应和氧化状态的高度暴露人口特征,我们评估的影响砷T-lymphoma Jurkat细胞。首先,如(3)诱导减少胸苷掺入在人类成纤维细胞培养基底扩散浓度的形式(数据没有显示)。相比之下,双重效果观察Jurkat PHA-induced增殖的细胞,也就是说,剂量的0.2到2 ppm的砷减弱(3H]热带病研究和培训特别规划整合,但低剂量(低于0.2 ppm)诱导增加(图5(一个))。如图5 (b),增加3H]热带病研究和培训特别规划整合与总细胞数在剂量范围从0.05到0.2 ppm。相反,观察细胞生长的一个重要剂量依赖性降低,直到细胞增殖是完全被捕。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图5
亚砷酸钠对Jurkat细胞的影响。(一)抑制扩散PHA-stimulated Jurkat细胞亚砷酸钠。细胞( 2 × 1 0 5 细胞/)表示过,孵化和扩散是评估3H]热带病研究和培训特别规划整合。结果表示在每分钟计数(cpm)没有,存在不同的亚砷酸钠浓度。(b)评估增殖的细胞( 2 × 1 0 5 细胞/ 5)刺激μg / ml PHA 48 h。结果表示为获得细胞的数量在不同的亚砷酸钠浓度的培养基。(c) Jurkat细胞脂质过氧化作用引起的砷。细胞( 2 × 1 0 5 细胞/)孵化与亚砷酸钠48 h和脂质过氧化物水平测定在匀浆MDA浓度。

为了评估氧化应激相关响应,脂质损伤对砷治疗Jurkat细胞MDA水平,研究了确定脂质过氧化作用的标志。结果表明,砷诱发MDA剂量依赖性的方式,增加最大增加观察砷(图0.2 ppm5 (c))。更高浓度的金属诱导Jurkat细胞MDA含量减少。我们的结果与之前的报道相一致,支持假设低水平的砷诱导细胞中DNA修复机制,因为氧化细胞损伤。

4所示。讨论

在这个工作我们证明慢性砷暴露与氧化损伤的增加淋巴细胞的差别,对这些基因的抗氧化机制。与此同时,在淋巴细胞的作用机制并不完全清楚,当前的共识是,砷会导致氧化应激(17]。这样,归纳几个ROS的最佳特征暴露,引起细胞损伤的影响(9]。改变的细胞抗氧化系统已经在许多病理报道涉及metal-induced氧化应激(18]。

在这里,我们表明,人类长期接触也存在外周血淋巴细胞的变化。也许,淋巴细胞正试图开发一个响应对氧化的挑战,从而增加抗氧化防御系统。在这方面,文献是矛盾的,这表明淋巴细胞治疗在体外用砷表现出较低程度的某些抗氧化酶的活性,如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶,超氧化物歧化酶(19]。然而,这种研究在体外和急性暴露。另一方面,另一个工作报道,暴露诱导显著提高SOD活性在体外(20.]。在中国内蒙古,一项研究,与人类暴露在高度污染的饮用水,血液SOD活性差异不显著(21]。然而,这项研究的作者比较了高度暴露人口暴露于较低的一组,后者还有两次一样水平接受水平由世界卫生组织饮用水。根据我们的结果,然而,在人类长期暴露,为污染的空气中SOD活性诱导直接关系排泄,并可能在等离子体的水平。,响应As-induced损坏细胞抗氧化剂的吸收可以包括修改或变更活动或其氧化。使用抗氧化剂如维生素E被描述为一个有效的策略来保护细胞免受As-induced氧化损伤(22]。然而,直到现在没有检查血液中的维生素E含量的暴露人口被描述。我们发现维生素E的显著下降,这直接关系到分泌水平。

引人注目的是,有争议的证据关于砷对淋巴细胞增殖的影响,在体外挑战导致抑制淋巴细胞增殖与减少胸苷掺入。在体外研究表明,arsenic-delayed t淋巴球扩散和修改DNA合成发生在两相的剂量依赖性的方式(23,24),高剂量抑制PHA-induced T细胞增殖的23,25,26砷),而低剂量使用在体外增加PHA引起的淋巴细胞增殖,与我们的结果一致在体外(24,27]。另一方面,当我们确定暴露工人淋巴细胞显示增加胸苷掺入,文献报道减少淋巴细胞增殖在小鼠模型(28)和淋巴细胞减少或没有变化的人暴露在饮用水中砷在墨西哥。报告显示,成年人一样长期暴露于高水平的淋巴细胞平均世代时间较低比个人更少接触金属。不幸的是,病例数量分析是比较低,不允许有信心(29日]。其他情况下的成年人在墨西哥没有显示复制指数的变化与慢性淋巴细胞获得个人接触,通过饮用水(30.]。一项最近的研究表明,儿童接触到的淋巴细胞显示细胞促有丝分裂的反应降低PHA (31日]。所有这些观察结果与我们的结果的分歧。不幸的是,我们没有解释这些差异,除了剂量工人在我们的研究中可能是低于中观察到人们从水或暴露于砷可能与特定区域差异和其他金属出现在空气中,在墨西哥矿,或在水中。然而,它一再建议,证明细胞ROS水平低的暴露诱发分裂和增殖(审查[32])。广泛记录,使用抗氧化剂或ROS拾荒者,正如上面所讨论的,防止As-induced损伤。在这方面,我们可以推测,诱导细胞增殖水平可以找到的浓度的毒性主要是由于ROS生成。

回顾性研究在同一地理区域作为我们的研究最近描述癌症患病率的增加相比,智利的其他部分(8]。同样的,其他的研究报道,长期吸入砷与白血病、肺癌和尿砷代谢产物的排泄33- - - - - -35]。在美国,饮用水中砷已与一些疾病,比如癌症、心血管疾病和糖尿病36- - - - - -41]。砷在癌症诱导的作用不明确,但它支持的想法产生基因毒性。我们的结果支持这一观点,癌症的发病率有关氧化应激变化,进而损害基因组,并改变了淋巴细胞活动或反应。通过这种方式,有大量的证据支持后者的想法,除了描述的变化淋巴细胞的增殖反应。例如,在体外研究表明,抑制和il - 4 - 2分泌和CD25表达(23,25,26]。据报道,在印度和其他国家,在那里人类暴露于砷在饮用水、外周淋巴细胞显示姐妹染色单体交换频率的增加(42- - - - - -44]。此外,Yu和同事表明,从患者PBMC arsenic-induced博文氏病的T细胞比例下降,特别是辅助T分组人口(45]。其他重要的和最近的证据表明,低在体外砷的浓度增加T调节淋巴细胞的数量和功能(46]。,增殖细胞的损伤诱导,以及有害影响淋巴细胞的功能,也就是说,诱导抗炎和T监管淋巴细胞在低浓度,支持不同的砷的作用,不仅可能成为电感的癌症也与淋巴细胞功能受损有关。然而,我们不能排除其他过渡金属,都可能导致淋巴细胞的氧化降解。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。协议是大学的伦理委员会批准的圣地亚哥,智利。所有受试者签署知情同意书。

缩写

为: 砷
ROS: 激进的氧物种
SOD: 超氧化物歧化酶
MDA: 丙二醛。

承认

作者感谢乔治·蒙哥马利语言建议。