文摘
在淋巴细胞(LY),证据确凿的干扰素-抗增殖的影响α抑制蛋白质合成,降低氨基酸结合,细胞周期阻滞。然而,这种细胞因子的影响在这些细胞葡萄糖和谷氨酰胺代谢还没有很好地调查。因此,雄性Wistar鼠肠系膜和脾脏LY是培养在干扰素的存在与否α,研究了葡萄糖和谷氨酰胺代谢变化。肠系膜的扩散LY伴随着葡萄糖总消费量的减少(35%),有氧代谢葡萄糖(55%)、最大glucose-6-phosphate脱氢酶活性(49%)、柠檬酸合成酶活性(34%)、谷氨酰胺消费总量(30%),有氧谷氨酰胺消费(20.3%)和谷氨酰胺酶活性(56%)。LY隔绝脾脏,干扰素α也减少了扩散和代谢受损。这些数据表明,在LY,干扰素的抗增殖作用α与减少葡萄糖和谷氨酰胺代谢。
1。介绍
α干扰素(干扰素α)最初是作为一种抗病毒细胞因子。随后,几个也证明了其效果。其中,抗增殖效果是最好的特征(1),并允许干扰素α用于治疗一些肿瘤(2]。干扰素α蛋白质产生响应感染以及既定的和有一个广泛的功能在不同的细胞类型包括淋巴细胞(LY)活动的调制(3,4]。因此,这种细胞因子可以调节增殖、生存和分化LY (1]。干扰素的抗增殖作用αLY有关,例如,逮捕了细胞周期(2)和抑制蛋白质合成和氨基酸结合(5]。
LY激活的特点是高生化活动的状态(6)需要维持增殖和内源性的合成产品在这些细胞(7- - - - - -10]。因为在LY葡萄糖和谷氨酰胺消耗是严格耦合细胞功能11),两个底物的吸收和消费显著增加应对与激活的要求。在这种情况下,不仅用于DNA和RNA合成前体分子提供(11),但也生物合成过程所需的能量12]。葡萄糖和谷氨酰胺代谢(因此LY函数)可以决定的在体外测量一些糖酵解的关键酶,glutaminolysis,柠檬酸循环(13]。事实上,我们之前已经确定了LY功能改变诱导不同实验条件下使用这种方法(14- - - - - -16]。
考虑干扰素的抗增殖作用α的重要性和葡萄糖和谷氨酰胺对LY新陈代谢,人们很容易推测干扰素α影响这些细胞的葡萄糖和谷氨酰胺代谢。因此,本研究的目的是评价葡萄糖和谷氨酰胺的代谢LY肠系膜淋巴结和脾脏的老鼠培养干扰素的存在α。我们的假设是干扰素的抗增殖作用α在淋巴细胞可以联系到减少葡萄糖和谷氨酰胺的代谢。
2。材料和方法
2.1。动物和试剂
成年雄性Wistar鼠重180 g(8周)的动物育种单位,生物医学科学研究所,圣保罗,巴西,圣保罗大学被安置在一个温控房间23°C下的光周期方案12:12小时光:黑暗周期(八点灯),水和食品随意。这些动物是依法维护巴西实验动物科学协会的指导方针,和所有实验程序是动物实验伦理委员会批准的生物医学科学研究所的圣保罗大学。(U -14(U - C]葡萄糖14(2 - C]谷氨酰胺和14C]胸苷是从Amersham购买(英国小都,Buckinghamsthire)。所有其他试剂包括干扰素-α购买,除非指定,从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)或默克(达姆施塔特,德国)。
2.2。LY脾脏和肠系膜淋巴结
提取器官和细胞提取按组织钢网被Ardawi和Newsholme [17]。细胞悬液的过滤(英国米德尔塞克斯绘画纸plc)和离心机在150克15分钟在4°C。总与巨噬细胞污染低于1%。
2.3。淋巴细胞增殖
LY脾脏和肠系膜LY被种植在96孔板(1×105细胞每口井;康宁,河边的广场,美国纽约)在无菌条件下GIBCO RPMI 1640中48小时37°C人为湿润大气中5%的有限公司2在微处理器孵化器(实验室,波士顿马)。细胞也被种植在伴刀豆球蛋白(ConA;5μg / mL),脂多糖(LPS;10毫克/毫升)或重组鼠重组干扰素α(1000 U /毫升;添加到文化时期)的开始。在文化48小时后,98%以上的淋巴细胞仍然是可行的,以台盼蓝排斥。这些细胞被标以7400 Bq14C-thymidine (Amersham-GE医疗,乌普萨拉,瑞典)和稀释在无菌PBS的最终浓度为1μ克/毫升。额外的细胞保持在这些条件下15小时,自动使用多个cell收割机收割和滤纸(Skatron结合,Sulfolk,英国)。论文光盘包含标记细胞数在5毫升布雷的闪烁鸡尾酒Beckman-LS 5000 td液体闪烁体(贝克曼仪器,富勒顿,CA)。
2.4。孵化过程
LY脾脏和肠系膜LY孵化(1×106细胞在37°C /瓶)克雷布斯铃声中有2%脱脂牛血清白蛋白(BSA)的葡萄糖(5毫米)或谷氨酰胺(2毫米)。与200年1小时后,细胞被破坏μL 25% (w / v)三氯乙酸和示例是中和100年μL 0.5三羟甲基氨基甲烷含液0.5 KOH的代谢物的测定。葡萄糖消耗被(一条对付责难者决定如前所述18]。乳酸生产如前所述取决于恩格尔和琼斯19]。谷氨酰胺消费决定使用Windmueller和Spaeth[描述的方法20.]。所有光谱光度测量的测量进行了日立u - 2001分光光度计(日立、东京、日本)25°C。
2.5。葡萄糖和谷氨酰胺氧化
的14有限公司2产自14比较和14C-glutamine氧化被确定为描述Curi et al。21]。LY孵化了1小时的存在的放射性标记的底物在一个密封的锥形烧瓶(25毫升)与一个细胞孵化室,第二个用于有限公司2收集,如前所述,Kowalchuck et al。22]。
2.6。酶
的活动glucose-6-phosphate脱氢酶(G6PDH)、己糖激酶(香港)和谷氨酰胺酶(GLUTase),酶催化,分别的第一反应磷酸戊糖和glycolitic glutaminolytic途径,被Bergmeyer测量如前所述et al。23],瑰柏翠和Newsholme [24],Curthoys和洛瑞25),分别。柠檬酸合成酶(CS),一个重要的酶从克雷布斯循环,被高山所描述的测量等。26]。酶的提取媒体:25毫米Tris-HCl缓冲区包含1毫米EDTA和30毫米β巯基乙醇(港元;pH值7.4),50 mM Tris-HCl包含1毫米EDTA (GLUTase: pH值8.6),50 mM Tris-HCl包含1毫米EDTA (CS;pH值7.4),包含1毫米和50毫米Tris-HCl EDTA (G6PDH;pH值8.0)。酶化验,特里同x - 100添加到媒介的最终浓度0.05% (v / v)。对于香港活动,以下孵化中使用(pH值7.5);包含7.5毫米75毫米Tris-HCl MgCl2氯化钾,EDTA 0.8毫米,1.5毫米,4.0毫米β磷酸肌酸巯基乙醇,0.4毫米,1.8 U肌酸激酶,1.4 U glucose-6-posphate脱氢酶和辅酶ii 0.4毫米+。分析缓冲CS活动(pH值8.1)由100毫米Tris-HCl, 0.2毫米5.5′-dithio-bis-2-nitrobenzoic酸,15 mM acetyl-coenzyme, 0.5毫米草酰乙酸。G6PDH缓冲区(pH值7.6)由86毫米Tris-HCl包含6.9毫米MgCl2辅酶ii, 0.4毫米+、1.2毫米glucose-6-phosphate和特里同x - 100年的0.5%。GLUTase化验(pH值8.6)由50 mM磷酸钾缓冲包含0.2毫米EDTA和20毫米谷氨酰胺。在所有情况下,最后测定体积为1.0毫升。CS活动是由吸光度在412 nm和其他酶在340海里。所有光谱光度测量的测量进行了日立u - 2001分光光度计(日立、东京、日本)25°C。
2.7。蛋白质测量
样品的蛋白质含量测定方法的布拉德福德(27]。BSA作为标准。
2.8。统计分析
分析使用GraphPad-Prism执行。当差异组被双向因子方差分析发现,所使用的图基测试。意义的水平被选为所有统计比较。数据意味着±SEM。
3所示。结果
3.1。从肠系膜淋巴结淋巴细胞
从肠系膜淋巴结淋巴细胞培养的干扰素α(1000 U /毫升48小时)提出了一个减少增殖指数评估所有条件下细胞培养相比,没有这个细胞因子(减少了13%,24.4%,和33.5%,控制相比,伴刀豆球蛋白a,和有限合伙人实验,分别)(表1)。减少伴随着减少49.2%的最大活动glucose-6-phosphate脱氢酶(G6PDH)(图1)。葡萄糖利用率对于精力充沛的过程也减少了干扰素α可以被减少35.3%葡萄糖消耗和降低55%葡萄糖脱羧(图2)。另一方面,最大的活动己糖激酶(香港)增加了1.4倍与干扰素细胞孵化α(图1)。柠檬酸合成酶的最大活动(CS)和谷氨酰胺酶(GLUTase化验)也减少淋巴细胞孵化的干扰素α细胞培养相比,没有细胞因子(减少34%和56%,分别地。)(图1)。同意GLUTase化验的结果,谷氨酰胺消费(−30.2%)和谷氨酰胺有氧利用率(−20.3%)降低干扰素α相比细胞无细胞因子(图孵化2)。
3.2。从脾淋巴细胞
在淋巴细胞经脾脏,干扰素α促进了同样的模式变化的葡萄糖和谷氨酰胺代谢从肠系膜淋巴结淋巴细胞中观察到。控制细胞培养相比没有干扰素α,从显示的脾淋巴细胞增殖指数降低所有条件评估(减少了31.3%,33.1%,和27%,与控制相比,伴刀豆球蛋白a,和有限合伙人实验,分别地。)(表1)。作为来自肠系膜淋巴结淋巴细胞的观察,大部分的葡萄糖代谢的特点从脾脏LY是降低干扰素α可以看到,在最大G6PDH活性(图减少43%3)和减少22%的葡萄糖消耗(图4)。同样,葡萄糖代谢的异常增加1.2倍最大香港活动中观察到脾脏LY孵化时在干扰素的存在α相比,控制细胞(图3)。谷氨酰胺代谢,另一方面,也减少了在这些LY由于干扰素α活动。谷氨酰胺消费下降了21%,谷氨酰胺脱羧干扰素的存在降低了23%α相比,控制细胞(图4)。谷氨酰胺脱羧伴随着减少55.3%的柠檬酸循环的重要酶类的活性(图3)。
4所示。讨论
干扰素的抗增殖作用α已经被描述在不同的细胞类型(2]的能力相关,这些细胞因子影响几个过程(例如,蛋白质合成)所需LY激活(5]。在此,我们证明葡萄糖和谷氨酰胺代谢,对LY激活(特别重要17),也由干扰素调制α。
正如预期的那样,我们的研究结果证实干扰素的抗增殖作用αLY从肠系膜淋巴结和脾脏。事实上,在一般意义上,细胞因子促进了新陈代谢的变化的相同模式LY从这些不同的位置。因此,适用人群的数据将一起讨论。
严格确认衬底在LY(使用和功能之间的关系11),干扰素的抗增殖作用α伴随着减少葡萄糖和谷氨酰胺代谢。因此,我们的研究结果的减少基质添加到列表的已知因素与干扰素的抗增殖作用有关α。
尽管是一个不重要的氨基酸,几个条件如感染和损伤导致谷氨酰胺可以成为“有条件至关重要”。从这个角度来看,调查的速度利用谷氨酰胺通过免疫细胞执行旨在开放的新方法治疗增生性的操纵,吞噬,这些细胞的分泌能力11]。为例,淋巴细胞有丝分裂原伴刀豆球蛋白增加谷氨酰胺酶活动以及利用谷氨酰胺(28]。在这项研究中,干扰素的抗增殖作用αLY是,然而,伴随着谷氨酰胺酶最大活动和谷氨酰胺消费的减少。此外,降低柠檬酸合成酶(CS)的活动和谷氨酰胺脱羧证明有氧途径与氨基酸的代谢也受到干扰素α。
虽然葡萄糖和谷氨酰胺都是用于能源生产供应,第一似乎更重要的定量(12]。在这项研究中,LY培养的干扰素α消耗更少的葡萄糖和总提出了降低本底物由有氧代谢通路的增长表明小葡萄糖CS的脱羧和活动。除了能源生产,最大G6PDh活性的降低,磷酸戊糖途径的第一个酶,表明干扰素α也妥协扩散通过减少生产代谢产物和生物合成所需的前驱细胞组件所必需的扩散(29日]。还是考虑葡萄糖代谢,有趣的是,尽管减少葡萄糖的消耗,干扰素α增加了香港的最大活动表明葡萄糖的转化率glucose-6-phosphate并不受这个细胞因子的影响。激活后,通过GLUT1 (LY增加葡萄糖摄取30.]。因此,即使香港活动增加代表了一个更大的葡萄糖吸收培养LY酶活性越大并不足以促进葡萄糖的增加消费,因为随后的葡萄糖代谢的过程被干扰素表达下调α。
按照存在et al。30.),了解正常供应功能监管,推动允许生产ATP和生物合成的前体必不可少的增长,这些细胞的效应函数的差别是非常重要的,由于严重的对这些免疫功能,导致供应不足。
此外,因为许多癌症细胞葡萄糖消耗的方式类似于LY,也就是说,将葡萄糖转化为乳酸即使在足够的氧气的存在(31日],人们很容易推测,目前研究的结果可能是干扰素的作用的理解有关α作为抗癌剂。支持这种猜测,它已经表明,不同的肿瘤细胞可以抵抗干扰素α(32,33]。这种效应可能与JAK-STAT通路的激活不足和效应器STAT1和STAT2。在这种情况下,尽管STAT1的充足水平是干扰素的建立至关重要α效果,低水平或超表达的转录因子对肿瘤细胞(似乎是有利32]。有趣的是,一个以前无特征STAT1的作用在调节基因的表达参与糖酵解,柠檬酸循环,和氧化磷酸化最近演示了。另一方面,我们之前能够证明肿瘤的老鼠提出减少扩散,葡萄糖的消耗,最大酶如G6PDH活性和c,同时,沃克256肿瘤细胞相同的动物提供了一个增加葡萄糖代谢(34]。
作为干扰素α已经激活凋亡影响LY (35)调制的葡萄糖和谷氨酰胺的代谢15),这些底物的代谢和LY扩散可以与胶原诱导关节炎(16),和高葡萄糖和脂质水平在患有2型糖尿病和肥胖导致LY活动促进炎症(30.]。这里给出的结果可能与免疫学相关的其他领域相关。
因此,进一步的调查有关的分子机制干扰素的效果α(和其他细胞因子)对葡萄糖和谷氨酰胺代谢以及扩散LY可能导致癌症的发展战略目标,自身免疫性疾病和慢性疾病。
5。结论
总之,我们的数据表明,葡萄糖和谷氨酰胺代谢的抑制的一个重要组成部分干扰素的抗增殖作用的机制α在小鼠的淋巴细胞。
确认
作者感谢尼尔斯·奥尔森博士Saraiva卡马拉在这个调查他的建议和意见。本研究由FAPESP(97/3117-6)必须占州政府的支持。