文摘
背景。我们之前显示,胎粪针对肺细胞死亡的凋亡和炎症细胞因子表达。是否这是由于胎粪暴露本身,或胎粪相关缺氧仍不清楚。目标。阐明鸦片的影响,盐,牛奶、低氧和氧过多诱导肺损伤。设计/方法。我们研究了5组兔崽:(I)生理盐水;(2)牛奶;(3)10%的胎粪的解决方案;(IV)仅15分钟的缺氧(10%啊2),(V) 5分钟的缺氧(95%啊2)。肺灌洗细胞接触后用于凋亡细胞计数和细胞因子的表达。在体外反应人类549年的上皮细胞meconium-and牛奶接触也进行了研究。结果。没有盐和牛奶在细胞死亡组。然而,胎粪造成显著的细胞损失相比,生理盐水和milk-Inflammatory细胞因子显著增加胎粪组与生理盐水或牛奶组。尽管低氧和氧肺显示增加炎症反应而saline-treated肺、胎粪组相比这伤不显著。与A549细胞的研究也显示了类似的结果。结论。我们得出结论,在胎粪吸入性肺细胞损伤是主要从胎粪本身。
1。介绍
在先前的研究中,我们证明了在新生儿胎粪暴露兔肺导致显著的细胞死亡和炎性细胞因子的表达1]。它可以诱发恭维激活、细胞凋亡和磷脂酶A2激活(2]。在临床情况下,最有害影响的MAS的发展增加肺血管阻力(PVR)和相关肺动脉高压(3]。增加PVR的原因被认为是相关的主要由meconium-induced缺氧和肺损伤;然而,其他机制的相对贡献和介质是未知的4]。新生儿胎粪吸入经常需要高浓度的氧气。高氧暴露也与肺的不利影响(5,6]。
在临床胎粪吸入综合征(MAS),有三个肺细胞损伤的主要机制。(1)胎粪及其组件本身可能导致细胞损伤。(2)缺氧也会导致细胞损伤有关。(3)在治疗期间,肺都暴露于高氧浓度,这也可能导致细胞损伤。因此,所有这些机制可能发挥重要作用在meconium-induced肺癌细胞凋亡和细胞因子表达增加。然而,尚不清楚缺氧和氧过多是否会独立诱导肺损伤类似于胎粪。
我们假设与胎粪相关肺损伤可能是由于细胞对缺氧的反应和氧过多MAS中看到。为了测试我们的假设,我们设计了一个研究来确定胎粪的独立影响,低氧,氧过多和惰性物质,如盐和牛奶在诱导肺癌细胞凋亡和炎症细胞因子的反应。除了上面的研究,我们使用A549细胞进行了体外实验研究胎粪的独立效应和盐在缺氧情况下,氧过多在诱导凋亡细胞死亡。在本文中,我们提出我们的这些研究的发现。
2。材料和方法
2.1。胎粪的准备
15个初步的人类从足月胎粪样本获得的,健康的新生儿。克新鲜新生儿胎粪是均质在搅拌机在冰上9毫升的0.9%氯化钠10%(重量/体积)最终浓度之后,旋转在5.000 RPM 20分钟在4°C到单独的上层清液和颗粒(碎片)。然后通过一个玻璃上层清液过滤过滤后通过0.2灭菌过滤器(从微孔过滤器都是有限公司,贝德福德,MA)和用于肺部滴注法。胎粪更高10%浓度的实验引起了许多兔子小狗的死亡。他们的呼吸是慢,紧随其后的是完整的呼吸暂停。因为这个原因,我们决定用10%的胎粪的解决方案为我们的研究。
2.2。动物模型
我们用新西兰白兔两周神经元幼崽(LSP产业联盟树林,WI)作为我们的研究的动物模型(1]。动物被照顾和处理根据国家健康研究所的指导方针。动物保健和使用委员会在迈克尔·里斯医院,芝加哥,伊利诺斯州批准了这项研究。几天前的实验中,动物和他们的母亲被安置在不锈钢兔子的笼子里。母亲喂养与普通上贴兔粮(科学动物饲料有限公司,阿灵顿高地,IL)。
我们使用了六个兔子每组和每个时间段(最低允许获得统计上显著的数据)。五组动物进行了研究:集团我:saline-instilled(子组:只有盐水;子群b:盐水在缺氧;子群c:盐水在氧过多);第二组:暴露于低氧(FiO)2:10%)一段15分钟;第三组:暴露于氧过多(FiO)2:95%)一段15分钟;第四组:灌输10%胎粪的解决方案(子群,只有胎粪;子群b:胎粪在缺氧;子群c:胎粪在氧过多);用牛奶集团V:灌输与铁,“雅培Similac”儿科婴儿配方奶粉,罗斯。盐、牛奶或胎粪的体积灌输给每200克体重300克。动物不容忍FiO缺氧2超过15分钟不到10%。组受到生理盐水、胎粪,和牛奶滴剂(组我,IV, V)进行了研究在0 - 4 -,8 -,从侮辱和24小时的时间,然后他们牺牲了。滴注法之前,我们麻醉兔10毫克/公斤氯胺酮和甲苯噻嗪1毫克/公斤,由于腹腔内(1]。小中线切口是在颈部的腹侧方面暴露出气管;盐水、胎粪或牛奶然后灌输到肺后跟5毫升空气传播鸦片丸进入肺部。与4 - 0尼龙缝合皮肤切口关闭;兔子被允许呼吸室内空气自然为0,4,8,24小时,然后是安乐死与戊巴比妥钠(100毫克/公斤,i.p)。牺牲之后,胸部立即打开了中线切口,肺孤立和肺灌洗得到如下所述。我们评估时间表兔子开发肺损伤的迹象,而不是测试的存活率的实验。
在每个动物的牺牲和隔离肺,气管插管,通过气管和主支气管灌洗进行恢复肺细胞如前所述[1]。我们收集肺灌洗10毫升整除三次收集30毫升的液体灌洗每只兔子的研究。我们获得了几次后总蛋白细胞声波降解法使用一个超声音超声发生器(然后驾驭在10000转10分钟孤立细胞碎片。然后我们用丙酮沉淀supernatant-contained蛋白质颗粒溶解在50μL (ddH2由布拉德福德方法O测量蛋白质含量。最后,我们添加了50μL (SDS样品缓冲样本和执行10% SDS凝胶电泳。
2.3。细胞死亡的决心
肺灌洗液是在5000转10分钟在4°C。然后上层清液和细胞颗粒被抛弃和0.1 g / ml溴化乙锭染色,吖啶橙(密苏里州圣路易斯西格玛化工有限公司)。洗胃细胞的荧光显微镜(主要是巨噬细胞,白细胞和中性粒细胞)执行前面我们所描述的(1]。荧光分析清楚区分活细胞死亡。活细胞(与吖啶橙染色)出现绿色,而死细胞(与溴化乙锭染色)出现红色。死细胞的数量数了三次,在幻灯片上的不同区域,计算结果从每个100个细胞数的比例。
2.4。用ELISA研究细胞因子的蛋白质
离心后的上层清液获得的样本用于ELISA检测如前所述[1]。我们测量了il - 1β、il - 6、il - 10和肿瘤坏死因子α细胞因子表达在象形图毫升(pg / ml)使用商用ELISA试剂盒所描述的制造商(研发系统有限公司、明尼阿波利斯、MI)。
在另一项实验中,独立的低氧或氧过多对meconium-induced肺损伤的影响进行了研究使用人类肺上皮细胞A549细胞在文化。细胞在低氧或氧条件进行处理,然后胎粪解决方案增加了10%。细胞培养工作的详细描述描述如下。
2.5。细胞培养
我们正在进行体外研究证明meconium-induced使用培养的A549细胞炎症。人肺腺癌A549细胞行了美式文化的收集和火腿的F12培养基培养补充10%胎牛血清的边后卫。细胞收集超过90%纯以吖啶橙染色法进行评估。所有的细胞都被播种在24-well或6-well钱伯斯和所有实验密度80% - -90%的血清火腿的F12培养基。细胞治疗在缺氧(或氧过多)15分钟,然后10%胎粪被加入到盘子和孵化八小时在低氧或氧条件收获前37°C。定量的细胞死亡,我们使用Acrydine橙色(活细胞染色,绿色)和溴化乙锭(死细胞染色,橙色)染色细胞。
2.6。数据分析
所有测量比较采用重复测量方差分析。结果均值±标准差至少四个实验。在形态学实验中,每每个幻灯片300细胞数和数字组之间的比较。成对的评估是由实验和控制条件在每个实验中,和意义是取决于学生的以及。统计学意义是用方差分析确定视为明显重要。所有统计计算InStat生物统计学软件。
3所示。结果
Saline-instilled动物(对照组)显示大约相同数量的milk-instilled肺灌洗细胞。表1(一个)显示在不同时间细胞计数肺灌洗。
Meconium-instilled动物表现出显著降低洗胃细胞数量在一段时间的8小时后胎粪滴注法与牛奶或saline-instilled (与与)和24小时(与与)。缺氧细胞计数较低有关,治疗时间15分钟类似于胎粪。氧过多没有差异(表1(b))。
观察细胞死亡在肺灌洗可以非常重要,可以达到52%的鸦片后24小时内滴注法(1]。图1(一)证明存在洗胃细胞死亡在胎粪,盐,和牛奶。这些组之间没有明显差异。细胞死亡在氧和缺氧条件如图1 (b)。死细胞的数量明显高于胎粪滴剂后后盐和牛奶滴注法和差异具有统计学意义()。细胞死亡与胎粪组的时间明显增加,但不是在盐水或牛奶(图组1(一))。缺氧导致和氧过多在图的死细胞1 (b)。
(一)
(b)
在微观考试我们观察到许多炎性细胞渗透和许多肺泡开放。动脉壁厚saline-instilled动物相比。我们还观察到支离破碎的基底膜,也与炎症细胞渗透。缺氧也会增加肺泡septae的大小,显示破肺泡(没有显示)。
氧过多的效果并没有显著的生理盐水以及meconium-instilled肺。氧动物展示了沉睡的行为及其效果被认为已经在15秒后治疗。氧过多和缺氧动物证明呼吸窘迫的迹象(收缩、鼻扩口)。不管缺氧或hyperoxia-induced损伤的影响,指出meconium-induced损伤明显更具有破坏性和meconium-induced肺损伤明显高于其他群体的研究。
Meconium-instilled动物证明总蛋白质含量的增加肺灌洗(见表2(a))。Meconium-induced相比,蛋白质含量显著高于水平从动物中观察到肺灌洗灌输盐,牛奶以及动物暴露于低氧或氧条件(表2(b))。在meconium-treated肺,毫克/毫升的总蛋白检测24小时后胎粪滴注法;毫克/毫升saline-instilled肺;毫克/毫升milk-treated肺;毫克/毫升在缺氧性肺;毫克/毫升的氧肺。数据meconium-instilled肺是统计学意义与所有其他组织。数据氧肺也显著与生理盐水组()和不显著和缺氧组()。
气管内的滴剂鸦片导致戏剧性的炎性细胞因子的表达在肺灌洗而不是生理盐水或milk-instilled肺。Saline-exposed新生兔肺灌洗4细胞因子水平相似,8、24小时。在这项研究中,我们演示了TNF的表达α,il - 1β、白细胞介素6、IL10细胞因子在不同的学习小组的兔子。的肿瘤坏死因子α和炎性细胞因子il - 6表达显著meconium-instilled肺(表3(a))。
这两种细胞因子高表达了大约四倍比lavage-treated肺saline-treated相比。Milk-instilled动物没有任何明显的表达细胞因子与saline-instilled所讨论的,和Milk-instilled saline-instilled动物显示大约相似,不显著的肿瘤坏死因子水平α和细胞因子il - 6表达。令人惊讶的是,il - 1β表达了对两个高4小时后meconium-instillation(最大观察表达il - 1β比saline-instilled肺(见表)3(一)详细信息)。
在低氧或氧条件,炎性细胞因子肿瘤坏死因子的水平α和白细胞介素6显著增加(表3(b))。抗炎细胞因子il - 10水平没有显著的组织进行了研究。
3.1。A549细胞研究的结果
我们发现meconium-treated细胞类似于肺灌洗细胞表现出显著更高百分比的细胞死亡(图2相比,D, E, F) saline-treated细胞(图2,A, B, C)。这种差异具有统计学意义()。我们还发现缺氧+胎粪组显示一些细胞死亡的数量增加和炎性细胞因子表达相比,氧过多+胎粪组;然而,这并没有显著增加()。
4所示。讨论
胎粪吸入综合征常与缺氧有关。缺氧是伴随着机制负责MAS的临床表现7]。水平的缺氧导致胎粪所指出的增加引起的炎症细胞因子在缺氧条件下生产。Leeper-Woodford和Detmer表明急性肺缺氧可能诱导增强NF-kB在肺泡巨噬细胞活化,导致增加生产和肿瘤坏死因子等炎性细胞因子的释放α(4]。
氧过多也被报道引起肺部病理和功能障碍,导致一些物种的死亡(8,9]。在生存的研究中,弗兰克et al。8]表明,新生儿肺尤其容易受到氧接触,因为他们无法增加抗氧化酶保护肺部,导致死亡率50%三天。凯利et al。10]报道21%的死亡率在新生儿暴露于95%氧过多为96小时。氧过多与炎性细胞水平低;蛋白酶活性和总蛋白质含量略有增加saline-instilled的动物相比,显示一个类似程度的肺功能障碍。这个功能障碍可能是由于肺部炎症和毛细管泄漏。肺细胞死亡可能由许多因素,其中最关键的是胎粪和氧过多5,7,11- - - - - -16]。先前的研究已经详细描述了氧过多对肺部的影响在不同的动物模型。巴克利等人研究了细胞凋亡的细胞死亡体外从hyperoxia-exposed鼠肺细胞培养11]。Hagimoto等人显示Fas / Fas L在中介细胞凋亡途径在小鼠17]。Holopainen等人使用小猪模型显示早期肺上皮细胞坏死变化(12]。
刚出生的兔子不能容忍低氧或氧条件超过15分钟。他们中许多人死亡。然而,我们认识到,在肺部缺氧了MAS中所有时间。有趣的是,那些人肺上皮细胞在文化在低氧和氧条件下能够存活更长的时间。这就是为什么我们使用细胞培养研究除了新生兔模型。
氧过多是一个著名的炎性因子,导致肺部严重的反应。的具体利益的广泛使用机械通气和氧治疗MAS的管理。艾伦et al。18)使用人工呼吸epithelial-like细胞仅接受氧过多,TNFα独自,或者这两个因素对引发基因表达的影响。他独自证明氧过多引发表达式有微小的影响,但协同增加肿瘤坏死因子的存在α。新生大鼠Ben-Ari等人的研究,表明肺部100%氧气的接触会导致肺肿瘤坏死因子的生产α第三天,il - 6天6 - 9氧过多的19,20.]。
有一个类似的低氧和氧动物的肺功能障碍程度。在我们的研究中,meconium-instilled动物显示出了明显更高水平的细胞死亡和细胞因子表达,相对于其他治疗方法。低氧和氧动物产生初始肺部炎症(多形核细胞和炎性细胞因子增加)。
我们比较的影响牛奶滴剂前胎粪滴剂的研究报道(15]。我们所知,没有数据的影响牛奶滴注法在肺癌细胞凋亡或细胞因子表达在文献中,使我们的研究独特的在这一领域。牛奶独自肺的影响与盐的影响。
最后,肺损伤的另一个表现是毛细管泄漏导致灌洗液中总蛋白浓度的增加,胎粪组高(表3)。相比之下,落下帷幕milk-instilled动物蛋白质的总量相当saline-instilled动物。
在目前的研究中,我们比较了炎症的影响胎粪与牛奶滴剂的影响。我们还提出了一个数据缺氧的影响和氧过多肺细胞死亡和炎性细胞因子的表达。
我们的数据似乎证明没有一个刺激物引起急性肺损伤导致肺细胞死亡或细胞因子表达在一定程度上被胎粪的愿望。低氧和氧的侮辱,即使治疗只有15分钟,导致最小的变化,而牛奶和盐更少有害效应引起的。缺氧,总是meconium-induced肺损伤的一个因素,似乎并不负责其损伤和凋亡的影响。需要更多的研究来发现通风机械应力的作用或胎粪的特点如粒径、粘度、肺细胞损伤等等,包括一个长时间的治疗,2,4,8,24小时的低氧或氧过多治疗。
总之,我们表明,缺氧和氧过多导致没有显著增加细胞死亡和炎症在新生兔崽。牛奶接触与盐水的作用效果。上面描述的影响小得多,胎粪相比更多的延迟效应。我们目前的研究表明,牛奶和盐进入肺部的愿望不会导致肺损伤。
总的来说,我们的数据表明,meconium-induced肺损伤不得解释为随之而来的牛奶,缺氧,或在MAS氧过多。胎粪的多个化合物可能的主要代理,导致肺部炎症和肺细胞死亡。