文摘

有证据表明,多形核中性粒细胞(中性粒细胞)可以起到严重的抗肿瘤的作用。相声肿瘤细胞和内皮细胞之间(ECs)的积累是必要的中性粒细胞在肿瘤。这项工作报告两个PMN-sensitive的能力,人类,永久性细胞lines-colorectal腺癌(HT-29)和咽鳞状细胞癌(FaDu)细胞作为炎性病灶。中性粒细胞是细胞毒性两行,中性粒细胞的粘附肿瘤细胞是重要的在这个效果。肿瘤细胞释放数额可观的引发和格罗,人类microvascular-EC单层膜诱导中性粒细胞的轮回。调节媒体相关线路诱导中性粒细胞的粘附和microvascular-EC ICAM-1的表面表达。此外,FaDu-conditioning-medium microvascular-EC强烈诱导促炎细胞因子的生产。这些结果支持了这样的观点,即肿瘤细胞通常会诱发的急性炎症反应,导致了自己的毁灭。

1。介绍

多形核中性粒细胞(中性粒细胞)是最丰富的血液白细胞。他们在先天免疫起着重要的作用,提供防御感染的一线。此外,有明确的证据表明,中性粒细胞可能也是一个有效的抗肿瘤作用。说道和科恩1973年报道,乳过氧化物酶对肿瘤细胞产生细胞毒性的活动(1]。此后,克拉克et al。2)表明,过氧化物酶系统对小鼠淋巴瘤细胞在炎症细胞的细胞毒性。在未来几年,许多报道出现描述细胞毒性体外中性粒细胞和巨噬细胞对肿瘤细胞的影响(3- - - - - -9]在动物模型和人类[10- - - - - -12]。有人建议,肿瘤进展与嗜中性白血球减少症或有缺陷的能力杀死肿瘤细胞中性粒细胞(12- - - - - -15]。据报道,鼠标线,基因选择高急性炎症反应表现出一种不同寻常的抵抗tumourigenesis相比,选择低的急性炎症反应。有趣的是,这款鼠标线产生大量的中性粒细胞在骨髓,展出大量的中性粒细胞在血液,并在本地显示阻力增加的渗透中性粒细胞自发apoptose (16- - - - - -19]。中性粒细胞参与高热的抗肿瘤作用在实验小鼠模型(20.]。中性粒细胞参与也功效的抗肿瘤作用与几类细菌治疗后肿瘤(21- - - - - -24]。2003年,一只老鼠完全抵抗癌症的应变是描述(25]。此外,它已经表明,这种阻力是由于中性粒细胞,巨噬细胞和NK细胞(26]。这种阻力的机理尚不清楚,但似乎抗肿瘤效应需要免疫细胞之间的接触和恶性细胞(27]。同样,Jaganjac et al。28]表明,中性粒细胞参与著名的自然回归W256癌细胞生长在Sprage-Dawley老鼠。此外,大量的中性粒细胞参与也拒绝改造的肿瘤细胞释放细胞因子和肿瘤坏死因子- 2(29日]。

很明显,中性粒细胞在宿主防御感染起着必不可少的作用30.),但中性粒细胞导致抗肿瘤的机制活动不理解。它已经表明,炎症细胞的抗肿瘤活性是由氧化和non-oxidative机制的结合。这些复杂的机制包括强烈的物种活性氧(ROS)的生产,hypoclorous酸,蛋白酶,defensins,抑制细胞生长的因素,穿孔素和膜中性粒细胞和靶细胞之间的相互作用6- - - - - -9,31日- - - - - -36]。

在研究肿瘤生长动力学数学,利用分形几何和缩放技术,Bru et al。37]发现固体肿瘤的增长遵循普遍增长模式被称为“线性分子束外延。“这种增长动力由微分方程描述,其中包含一个术语扩散的细胞表面的细胞集落生长。这一项导致的生物学解释这个概念,当维护最少的营养和氧气,肿瘤细胞重视空间和竞争(38]。基于这一概念,周围炎症细胞的竞争空间提出了固体肿瘤作为中性粒细胞抗肿瘤机制,也可以贡献的活动。测试的抗肿瘤效应大量中性粒细胞浸润,持续治疗gm - csf在老鼠实验模型,应用和实现一个强大的嗜中性诱发肿瘤。值得注意的是,在治疗组有16倍降低死亡率比控制(39]。相同的治疗策略是应用先进的肝癌患者,他表现出一个完整的g - csf的4个月治疗后缓解期(40]。有间接证据苏et al。41]表明,g - csf的强大的抗肿瘤治疗的效果是由于老年病的中性粒细胞在骨髓生产。这些作者诱导循环中性粒细胞的数量持续增加,通过长时间的g - csf管理局,他们发现一个意想不到的存活率在双盲,安慰剂对照的随机试验鳞状头部和颈部癌症。病人在g - csf的手臂显示平均24100 /白细胞计数L在治疗期间(约50天)和5年无病生存率是84%。相比之下,对照组平均4100 /白细胞计数L在5年存活率为47%。其他临床试验使用连续的gm - csf政府在晚期前列腺癌42]或持续的g - csf在四期黑色素瘤脑转移(43]报道比批准治疗时更好的生存。

我们的假设是对肿瘤体内中性粒细胞的效率主要取决于肿瘤的能力作为炎症网站保证招聘的细胞(尤其是中性粒细胞)产生一个强大的急性炎症反应。招聘网站的血液中的中性粒细胞炎症是一个多步骤的过程涉及一系列协调中性粒细胞和内皮细胞(EC)之间的相互作用44]。一些炎性介质,如细胞因子、生长因子、脂质介质,等等,由细胞分泌的炎症部位,激活EC表达粘附分子,从电子商务引起下游介质的生产。在肿瘤的情况下,肿瘤细胞之间的通信和电子商务应该第一步启动中性粒细胞积聚在肿瘤的网站。通过血球渗出,中性粒细胞通过整个血管壁,产生抗肿瘤效果他们向肿瘤细胞迁移和坚持。最后,中性粒细胞激活秘密细胞因子,帮助协调抗肿瘤免疫反应。因此,我们使用两种不同肿瘤细胞系的研究表明,肿瘤可以炎症网站招募中性粒细胞敏感。

2。材料和方法

2.1。肿瘤细胞系

HT-29和FaDu永久性结肠直肠腺癌和pharinx scamous细胞癌分别细胞系(从美国获得类型文化Collection-ATCC HTB-38和写明ATCC HTB-43)是生长在含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)和补充2毫米谷酰胺,1毫米丙酮酸钠,100 U /毫升青霉素和100年g / mL链霉素(生物产业、聚居区打赌Haemek、以色列)。

2.2。隔离的中性粒细胞

中性粒细胞悬浮液得到如前所述[45]从肝素实际上周围静脉血血液病学的病人患有铁超负荷和那些经历周期性放血,后签署同意。细胞生存能力,用台盼蓝染料排斥,总是超过95%。总和微分单元数量进行了使用Sysmex xe - 2100(罗氏西班牙,巴塞罗那,西班牙)细胞计数器。此外,中性粒细胞的百分比进行评估使用染色涂片检查。比例一直高于95%。

2.3。隔离和文化人类微血管内皮细胞(HMVEC)

人类皮肤微血管内皮细胞(HMVEC)隔绝人类包皮的修改先前描述的技术(46]。简单地说,包皮切成3米广场和放置在PBS含有0.3%胰蛋白酶(Difco实验室、底特律、MI)和1% EDTA (Sigma-Aldrich Quimica S.A.马德里,西班牙)C 30分钟。洗后皮肤碎片与PBS几次,这些细胞被按在皮氏培养皿中释放介质。微血管段经过150人米尼龙网和收集。HMVEC培养在1% 131年MCDB gelatine-coated烧瓶内补充20%的边后卫,20毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,1005 g / mL链霉素,ng / mL bFGF, 20 ng / mL EGF(所有从生物产业)和10 U /毫升肝素(σ)。起初,HMVEC纯化了CD31-coated Dynabeads(表达载体Dynal,奥斯陆,挪威)制造商的指示后获得纯HMVEC的细胞群。微血管内皮细胞中被确认为vWF和CD31免疫荧光染色。实验用细胞培养的3 - 5个段落。实验前,细胞保持48小时中含有1%的边后卫没有肝素和生长因子。

2.4。中性粒细胞粘附和Transendothelial迁移化验

中性粒细胞是悬浮在PBS的细胞密度1中性粒细胞/毫升。1,-dioctadecyl-3 3,-tetramethyl-indocarbocyanine高氯酸(迪勒)在乙醇添加到收益率1g / mL最终浓度和孵化C 1小时。之后,中性粒细胞被洗两次与PBS和悬浮在DMEM含有1%的边后卫在足够的细胞密度。贴上中性粒细胞悬挂加温C 5分钟前化验。

肿瘤细胞粘附试验进行,HMVEC培养12-well菜融合。培养细胞被洗两次添加0.5毫升的DMEM和1%的边后卫和温暖C 5分钟前的0.5毫升的标签包含2中性粒细胞停业中性粒细胞。细胞被孵化C 30分钟。此后,PBS的细胞被洗4次,和250年L 1%的特里同x - 100在PBS然后补充道。文化的菜肴都摇动了15分钟在室温和上层清液被移除。荧光测定立即在520 nm励磁光和565 nm emission-light。结果记录为大量的中性粒细胞粘附,从标准曲线计算通过测量荧光生成不同的已知数量的标签加工相同的中性粒细胞粘附样本。

transendothelial迁移化验、肿瘤细胞真皮成纤维细胞和HMVEC 12-well组织培养板培养。细胞汇合的时,他们与PBS洗两次,然后用1毫升的DMEM孵化,无酸碱指示剂(为了避免色彩干涉荧光测量)包含10%的边后卫,在C 48小时孵化器。HMVEC接受il - 1最后5个小时。Transendothelial迁移进行了化验将3孔隙大小细胞培养插入(BD欧洲实验室的器具,Le Pont de Claix法国),HMVEC以前培养的融合。化验没有消除调节执行媒体从井包含肿瘤细胞、成纤维细胞和il - 1对待HMVEC。插入的介质被和2中性粒细胞在500年L (C预热DMEM免费酸碱指示剂含有10%的边后卫随后补充道。系统是放置在C孵化器和中性粒细胞被允许穿过HMVEC单层3小时。在这之后,插入删除和100L 1% Triton x - 100在PBS被添加到井底部。样本处理如上所述确定的中性粒细胞数量交叉。洗后的完整性HMVEC层总是由显微镜观察和控制在任何情况下没有观察到变化。非特异性轮回井底部是评估没有细胞,从与细胞获得的值减去。

2.5。细胞毒性试验

肿瘤细胞培养在12-well文化板块包含12毫米直径覆盖眼镜。在试验之前,肿瘤细胞被洗了,500L含有10%的边后卫的DMEM补充道。5中性粒细胞悬浮在500L 10%的边后卫被放置在0.4的DMEM米和3米孔细胞培养插入,包含肿瘤细胞位于井。四个不同的条件是化验:中性粒细胞放置在3m插入;中性粒细胞激活为0.1mol / L n-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)放置在0.4m插入;中性粒细胞放置在310 m插入的鸡尾酒克/毫升的鼠标反CD44分子单克隆抗体(ref 550990 BD Pharmingen,圣地亚哥,CA), 10克/毫升的鼠标反CD162单克隆抗体(ref 556052 BD Pharmingen)和10克/毫升的鼠标反CD18单克隆抗体(ref 555922 BD Pharmingen)和控制进行了有介质没有插入的中性粒细胞。中性粒细胞与抗体鸡尾酒孵化30分钟前放置插入。板包含所有细胞被孵化的表示(结果部分)的时间内C孵化器。恢复后的显微观察了吖啶橙(AO)和溴化乙锭(EB)染色。染色,包括治疗1g / mL AO和5g / mL EB在PBS溶液为15分钟,安装Fluoprep (BioMerieux、法国)显微镜玻片,和一个奥林巴斯BX50显微镜中观察到。AO渗透在整个细胞和细胞核呈现绿色。EB只是被细胞胞质膜完整性丢失时,和染色细胞核红色。

2.6。蛋白质阵列测试

分泌细胞因子与人类细胞因子抗体阵列特征3 (RayBiotech, Inc .)正在GA30092, 1-888-494-8555)和样本处理协议由制造商提供。检测被孵化提供0.5毫升的混合物的ECL免疫印迹分析系统(通用电气医疗集团,英国白金汉郡HP79NA) 1分钟。x射线胶片使用Curix RP2和G153开发人员开发和快速固定器G354 (Agfa-Gevaert, B2640 Mortsel,比利时)。屁股的密度测量GelDoc 2000的数量一个软件(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。

2.7。蛋白质定量分析

选定的蛋白质的定量分析后的培养基是由特定的ELISA (GRO制造商的指令和ena - 78来自研发系统,明尼阿波利斯,锰;引发来自Endogen-Pierce,罗克福德,IL);VEGF是Biosource欧洲,Fleurus Begium)。

2.8。流式细胞仪分析表面HMVEC ICAM-1表情

HT-29 FaDu培养融合看成是提到的。中被取代,48小时后,恢复和调节介质存储在−C直到用于HMVEC刺激。刺激支流HMVEC是由替换介质DMEM包含10%的边后卫(控制),调节介质从肿瘤细胞或DMEM含有10%的边后卫和人类重组il - 1 10 U /毫升(积极控制,罗氏应用科学,巴塞罗那,西班牙)。孵化后一夜之间,HMVEC与细胞分裂分离解决方案(σ,圣路易斯,密苏里州)离心机和悬浮在PBS pH值7.4包含2%的牛血清白蛋白和叠氮化钠0.1%。二十L R-phycoerythrin的商业解决方案(PE)贴上鼠标反ICAM-1 (CD54 ref 555511 BD Pharmingen)然后添加允许站在C在黑暗中20分钟。细胞被离心机,洗两次,400年暂停包含2% paraformaldehide L PBS。流式细胞术分析在Cytomics FC500血细胞计数器(beckman coulter、迈阿密、FL)。

3所示。结果

观察中性粒细胞的作用在肿瘤细胞,肿瘤细胞系培养在井的底部transwell设备;5中性粒细胞通过上层膜孔被添加。系统文化离开了房间过夜。确定中性粒细胞的细胞毒性效应的依赖后者和肿瘤细胞之间的联系,两种插入。在一组实验中中性粒细胞被放置在3米孔插入允许中性粒细胞通过。这些实验进行鸡尾酒的缺失和存在的抗体CD18, CD162和CD44,防止公司的中性粒细胞粘附肿瘤细胞。在第二组实验中,中性粒细胞被放置在0.4米孔插入,以防止他们的通道;然而,这些膜允许中介分子通过。在这些实验中,中性粒细胞被fMLP添加到插入体内刺激。控制实验是将培养基没有插入的中性粒细胞。

正如所料,两个培养的细胞毒性的影响中性粒细胞细胞系时观察中性粒细胞自由通过上层的插入。一个代表性的实验如图1。FaDu细胞更敏感,中性粒细胞比HT-29细胞,而完全破坏培养观察FaDu殖民地与中性粒细胞隔夜孵化后,48小时内完成孵化是必要的破坏HT-29文化(没有显示)。当中性粒细胞无法通过细胞膜(插入孔直径0.4米)没有破坏HT-29观察细胞总量即使中性粒细胞与fMLP刺激;此外,细胞毒性影响FaDu显然是减轻。甚至当中性粒细胞穿过膜(3米直径孔)同样降低细胞毒性效应是观察当这些中性粒细胞抗体针对的鸡尾酒粘附分子(因此抑制中性粒细胞的粘附肿瘤细胞)(图2)。这些结果表明,中性粒细胞和之间的直接接触和粘附肿瘤细胞是很重要的,虽然不是绝对必要的FaDu,这些免疫系统细胞发挥细胞毒性作用。

检查肿瘤细胞坚持中性粒细胞的能力,2DiI-labelled中性粒细胞直接添加到文化井包含汇合的真皮成纤维细胞或HMVEC(负控制),肿瘤细胞,肿瘤细胞抗体的鸡尾酒粘附分子,和HMVEC以前对待人类重组il - 1的10 U /毫升5小时(积极的控制);都是在孵化C 30分钟。结果在图2表明,中性粒细胞坚持HT-29和FaDu细胞。中性粒细胞的粘附肿瘤细胞显著大于粘附皮肤成纤维细胞,如果HMVEC。治疗的中性粒细胞抗体对中性粒细胞粘附分子强烈降低肿瘤细胞的粘附。

能力的肿瘤细胞诱导中性粒细胞通过人类微血管单层轮回研究通过添加DiI-labelled中性粒细胞为3米孔隙大小细胞培养插入之前涂上HMVEC培养直到融合。插入井被放置在文化包含汇合的人类皮肤成纤维细胞(负控制),肿瘤细胞系,HMVEC以前对待人类重组il - 1的10 U /毫升5小时(积极的控制)。transwell系统被孵化C 3小时。图3显示中性粒细胞的数量转向肿瘤细胞在井底部3小时。中性粒细胞的数量交叉HMVEC层明显高于当肿瘤细胞在底部比真皮成纤维细胞在这个位置。肿瘤细胞引起中性粒细胞比HMVEC刺激与il - 1。

nonquantitative蛋白表达阵列被用来探索释放的细胞因子和生长因子肿瘤细胞系。人类皮肤成纤维细胞包含在分析由于这些细胞被用作负控制在许多实验。结果如图所示4。调节媒体从肿瘤细胞培养许多蛋白质是积极的。微数组的评估点进行估计的相对表达蛋白质评估(也见图4)。主要由肿瘤细胞系趋化因子释放是CXC-chemokines GRO和引发。定量评价GRO,引发和VEGF通过ELISA表明HT-29和FaDu细胞释放大量的这些蛋白质,虽然水平FaDu调节介质的大一个量级(图5)。

确定肿瘤细胞激活微血管内皮细胞的能力,HMVEC受到调节媒体从肿瘤细胞系的文化。首先,HMVEC释放的细胞因子和生长因子的决心使用蛋白质组分析(图6)。培养基与il - 1 HMVEC刺激显然MCP-1阳性,引发,GRO和il - 6。此外,ena - 78,发布的肿瘤细胞(见图4),被HMVEC专门发布。当然MCP-1的释放,引发,ena - 78由HMVEC暴露于il - 1和il - 6和调节媒体从肿瘤细胞系如图7。引发主要HMVEC产生的细胞因子。调节介质从HT-29不刺激HMVEC释放任何蛋白质的测试。相比之下,调节介质来自FaDu文化强烈诱导HMVEC释放四个细胞因子。生产MCP-1,引发和il - 6诱导FaDu调节介质甚至比il - 1诱导的。

观察肿瘤细胞调节的影响媒体的能力HMVEC坚持中性粒细胞,HMVEC一夜之间接触新鲜培养基(负控制),从肿瘤细胞调节媒体,或者人类重组il - 1的10 U /毫升(积极控制)附着力试验之前进行。洗后,2DiI-labelled中性粒细胞被添加到HMVEC然后孵化C 30分钟。调节介质从肿瘤细胞显著增加中性粒细胞的粘附HMVEC(图8(一个))。一旦控制HMVEC中性粒细胞的粘附的价值减去,FaDu调节介质显示几乎2倍容量增加的能力HMVEC坚持中性粒细胞比HT-29调节介质。这是在协议与ICAM-1感应(图8 (b))。积极的百分比HMVEC细胞(图8 (b)左面板底部)处理FaDu调节介质或il - 1(积极控制)是类似的,而积极的百分比HMVEC HT-29调节介质处理与未经处理的类似获得控制。然而,积极的百分比差异HMVEC细胞治疗FaDu调节介质或il - 1β和控制是重要的(尽管不是很重要)。这意味着许多未经处理的HMVEC ICAM-1既定(约70%的控制细胞和HT-29-treated HMVEC阳性),细胞的数量表达ICAM-1被治疗不会增加太多FaDu调节介质或il - 1β(大约90% FaDu——IL-1-treated HMVEC是积极的)。然而,对平均荧光强度与密度有关的ICAM-1 (ICAM-1分子数/阳性细胞),治疗HMVEC FaDu或HT-29调节介质显著增加ICAM-1表达式在这些细胞(尽管FaDu调节介质在这方面更强;图8 (b)下半部分)。

4所示。讨论

我们的研究的主要目的是测试假设肿瘤细胞有促炎属性和产生细胞因子和生长因子,条件为攻击肿瘤的中性粒细胞。我们的研究结果是一致的与许多报告显示中性粒细胞对肿瘤细胞细胞毒性(3- - - - - -9]。我们观察到肿瘤细胞系,用敏感的中性粒细胞。当直接接触或中性粒细胞的粘附肿瘤细胞没有出现,表明粘附可大大降低细胞溶菌作用是一个重要的条件,中性粒细胞在肿瘤细胞的细胞毒性效应。这与其他报道的数据是一致的27,36]。

我们假设对肿瘤体内中性粒细胞行动需要肿瘤细胞有能力充当炎症。很明显,肿瘤细胞必须满足的第一个条件是能够吸引中性粒细胞。这两种肿瘤细胞系(HT-29和FaDu),我们使用完成通过分泌大量的科学家趋化因子,如引发和格罗α。这些结果是一致的发现许多肿瘤细胞系既定生产引发和其他趋化因子(47,48]。值得注意的是这些HT-29和产生的主要趋化因子FaDu(引发和格罗α)法主要以中性粒细胞(49- - - - - -51]。本构的生产由肿瘤细胞趋化因子可能与本构激活NF -上发现许多肿瘤类型(52,53]。由肿瘤细胞引发的生产已经解释通常是肿瘤发生的由于其pro-angiogenic和pro-metastatic属性(54- - - - - -57]。然而,引发的主要生物活性是吸引和激活白细胞,尤其是中性粒细胞(58- - - - - -60炎症部位,此活动可能antitumoral。我们的transendothelial迁移实验的结果表明,中性粒细胞引诱剂的浓度调节媒体HT-29和FaDu足以有效地招募中性粒细胞。

体内白细胞的招聘是由激活血管内皮细胞(61年]。因此,肿瘤细胞可以激活EC。我们已经表明,HT-29 FaDu HMVEC功能诱导中性粒细胞的粘附。这与肿瘤细胞的诱导ICAM-1 HMVEC表面的表达,这是一个重要的粘附分子表面吸附和transcellular通过血管内皮细胞(中性粒细胞迁移62年]。ICAM-1是中性粒细胞柜台受体整合蛋白(63年]。这些整合蛋白在中性粒细胞表面粘附和PMN-mediated至关重要细胞毒性(64年,65年]。关于HMVEC分泌趋化因子的激活,我们观察到一个伟大的HT-29和FaDu之间的区别。前没有HMVEC诱导细胞因子的重要生产,而后来显著诱导趋化因子和白介素HMVEC的生产。此外,MCP-1的表达,引发和il - 6在回应FaDu调节介质远高于治疗后HMVEC il - 1β。这些结果强烈表明,不同肿瘤之间存在差异对于促进炎症反应的能力。这些差异的本质也许可以解释一些肿瘤的疗效作为网站的炎症。同时,这些知识将有助于设计一个PMN-based抗癌治疗。

人们普遍认为消除任何可能的癌症是通过激活宿主免疫反应(66年),但这尚未转化为临床实践。尽管越来越多的证据证明先天免疫,主要是中性粒细胞,拥有令人印象深刻的antitumoural能力(26,39- - - - - -41,67年,68年),目前immuno-therapeutic癌症领域的发展在很大程度上是基于适应性免疫的刺激66年,69年]。自适应机制通常扮演主要角色在启动修复反应,招募天生的效应细胞,如中性粒细胞、靶器官,但这些后者细胞主要负责肿瘤排斥(70年]。传出的免疫系统,主要是中性粒细胞,需要适当的信号激活的肿瘤站点进行其功能。建立癌症通常不发出这样的信号或发出信号不够强大的启动和维持一个强大的炎症反应,从而引起自己的拒绝。越来越多的证据显示消除肿瘤使用免疫“武器”只能通过显著提高急性炎症反应。可能存在一个阈值所需的中性粒细胞数量是有效的抗肿瘤活性,和一个简单的实现这一目的的方法是增加他们的循环水平,所描述的Bru et al。37- - - - - -40]。

当前执行工作只有两个肿瘤细胞系的建立,但结果打开有趣的可能性。如果恶性肿瘤局部中性粒细胞的激活能力自然机制招聘,有可能产生严重的局部炎性反应在肿瘤站点。PMN-based抗癌疗法可能是不适合肿瘤诱导自己足够强烈的免疫反应。最近,我们回顾文献显示的证据表明,许多固体肿瘤可以被中性粒细胞在体外或体内(71年]。

确认

作者感谢教授w·h·斯通的批判阅读手稿和皮拉尔Sarda为她优秀的技术援助。这项工作已经由医院的研究所圣Creu圣保罗和马德里大学我。