炎症介质

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体积2009年| 文章的ID689430年| https://doi.org/10.1155/2009/689430

分析的几个mRNA在人脑膜瘤

伊夫Denizot ,¹ 阿马斯拉斐尔,² Karine杜兰,² Sandrine罗伯特,² 让-雅克•莫罗,³ 弗朗索瓦Caire,³ 尼古拉斯Weinbreck,² 和弗朗索瓦Labrousse²

学术编辑器: Muzamil艾哈迈德

收到了 2009年9月07

修改后的 2009年11月25日

接受 2009年12月21日

发表 2010年3月21日

文摘

针对磷脂酶的重要致癌作用我们调查了记录在人类的脑膜瘤。实时PCR用于调查记录26人脑膜瘤肿瘤。结果表明,三个端依赖高分子量(iva,-IVB,印度河流域文明),一个独立的高分子量(vi)和五个低分子量分泌形式的(ib,活动花絮,第三,- v,十二)表示iva,-IVB,第六,xiia为最主要的表达形式。国际教育协会,国际金融,试管,-XIIB没有检测到。等离子体(-VIIA)和细胞内(-VIIB) platelet-activating因素acetylhydrolase成绩单是人类脑膜瘤中表达。但是没有发现差异记录数量与肿瘤级别,脑膜瘤亚型,炎性细胞渗透,一个关联的水肿,有丝分裂,大脑入侵,vascularisation或坏死。总之很多基因编码形式的倍数表达在脑膜瘤可能作用于磷脂重建和在本地类二十烷酸和/或细胞因子网络。

1。介绍

脑膜瘤是第二个最常见的原发性颅内肿瘤。脑膜瘤目前临床上造成焦或广义癫痫疾病,局部神经赤字或神经心理学下降1]。大量的分子和遗传途径中改变大脑肿瘤细胞已确定。其中,一个可能的角色类二十烷酸级联已建议在脑膜瘤(2]。磷脂酶一₂(中国人民解放军₂)是关键酶参与类二十烷酸代(3- - - - - -5]。中国人民解放军₂催化的水解sn2的位置膜glycerophospholipids解放类二十烷酸前体花生四烯酸(AA) (3- - - - - -5]。四个不同家庭有记载:低分子量分泌形式的解放军₂(sPLA₂),Ca^{2 +}端依赖高分子量聚乳酸₂(cPLA₂),Ca^{2 +}独立的高分子量聚乳酸₂(iPLA₂);和platelet-activating因素acetylhydrolase (PAF-AH)。苏丹人民解放军₂家庭是涉及一些生物过程如炎症和宿主防御(3,4]。已确定九同功酶在人类:解放军₂ib,解放军₂活动花絮,解放军₂iid,解放军₂国际教育协会解放军₂iif,解放军₂第三,中国人民解放军₂- v,解放军₂- x,解放军₂xiia,解放军₂-XIIB。除了它们的功能在消化的膳食磷脂,宿主防御细菌和AA释放细胞磷脂类二十烷酸合成,两类受体(M和N)和细胞外蛋白质绑定几件物品已经被确认表明解放军₂可能通过受体激活信号(3- - - - - -5]。在人类cPLA₂家庭由四个成员,解放军₂iva,解放军₂-IVB,解放军₂印度河流域文明,人民解放军₂试管;中国人民解放军₂iva stimulus-coupled细胞AA的中央监管机构发布(3- - - - - -5]。在人类iPLA₂由七国集团成员,iPLA₂(中国人民解放军₂-VIA-1)目前最著名的成员和磷脂重建中扮演主要的角色和癌症3,5]。旁边的重要地位类二十烷酸生成,解放军₂也代的关键酶促炎脂质中介拥堵的最近记录在人类脑膜瘤(6]。PAF-AH活动拥堵的水解不活跃的拥堵的前体,lyso-PAF是脑膜瘤中发现6]。但是没有结果报告这种酶活性是否起源于中国₂-VIIA和/或计划₂-VIIB、等离子PAF-AH和胞内PAF-AH形式,分别。目前解放军的贡献₂脑膜瘤是贫乏的记录尽管解放军₂减少人工脑膜瘤细胞的生长抑制(7]。针对各种解放军的重要潜在致癌作用₂物种,我们调查,在mRNA水平,人类颅内脑膜瘤中表达。

2。材料和方法

2.1。病人

本研究遵循规则的程序编辑由法国国家伦理。伦理批准了我们医院的伦理委员会(CHU Dupuytren、里摩日、法国)。20六个病人手术颅内脑膜瘤(从1998年到2004年)。的肿瘤从服务d 'Anatomie Pathologique楚Dupuytren(法国)。经过医院进行常规分析,样本保存在的过剩直到使用武力这按照规定在法国。没有书面或口头同意了,因为它是一个研究样本已经收集并称为法国生命伦理研究之前低(2004)。因此,伦理委员会明确批准同意的豁免。正常脑膜并不在我们机构的伦理委员会法律。可用肿瘤的低量(10 - 15毫克)只允许在mRNA水平调查。肿瘤分类(根据世界卫生组织的标准8]。我有16级脑膜瘤包括8过渡(2人,6女性,平均年龄60岁),3 meningothelial(1人,2女性,平均年龄60岁),和5纤维(5妇女,平均年龄59岁)。高度肿瘤II级脑膜瘤:7典型(6人,1女性,平均年龄58岁)和1 chordoid脑膜瘤(1人,54年)。两个肿瘤分为未分化三级脑膜瘤(2人,平均年龄54岁)。坏死是评估使用形态学标准定义的脑膜瘤的分类:“自发或地理坏死的焦点”。主要lymphoplasmocytic慢性炎性浸润。

2.2。RNA提取

使用“RNeasy脂质组织总RNA提取的迷你套装”(试剂盒、Courtaboeuf、法国)10 - 15毫克的肿瘤组织。在RNA提取之前,肿瘤碎片孵化与14 mm陶瓷珠子“赖氨酸矩阵D”(贝尔坦公司技术、Montigny-Le-Bretonneux、法国)1毫升QIAzol裂解试剂和均质在5500 rpm在2倍40秒自动搅拌机Precellys(贝尔坦公司技术)。然后使均匀样本用于RNA净化根据制造商的协议。DNase我消化步骤包含每个提取避免RNA基因组DNA的污染。RNA完整性检查了毛细管电泳在生物分析仪2100(安捷伦科技、厚重的、法国)。只有RNA RNA完整性(R.I.N)高于5.5数量用于逆转录。总RNA浓度决定通过测量吸光度在260 nm spectrophotometre NanoDrop nd - 1000 (Labtech、巴黎、法国)。

2.3。反转录

总RNA在单一反向转录链cDNA使用随机五个一和协议中所描述的“上标rt - pcr三世第一链合成系统”(表达载体、- pontoise、法国)。简单地说,1与200 U g总RNA孵化M-MLV逆转录酶的0.5毫米核苷酸,MgCl 50 ng随机五个一,5毫米₂,10毫米dithiotreitol 40 U核糖核酸酶抑制剂,在最后一卷20L 1 x RT缓冲区。反转录进行如下thermocycler黄金9700(应用生物系统):变性在5分钟C和冷却1分钟在冰上,杂交在10分钟C在50分钟后跟互补脱氧核糖核酸的合成C;酶是由一个5分钟灭活孵化C和寒冷的冰;最后的毁灭RNA的RNA:互补脱氧核糖核酸杂交是由2 U核糖核酸酶H在20分钟反应是冻结在C直到定量实时PCR的认识。

2.4。实时聚合酶链反应分析

中国人民解放军₂ib,解放军₂活动花絮,解放军₂iid,解放军₂国际教育协会,中国人民解放军₂iif,解放军₂第三,中国人民解放军₂iva,解放军₂-IVB,解放军₂印度河流域文明,人民解放军₂试管,解放军₂- v,解放军₂第六,中国人民解放军₂- x,解放军₂xiia,解放军₂-XIIB,解放军₂-VIIA PAF-AH(等离子体),解放军₂-VIIB(细胞内PAF-AH),解放军₂分析了R成绩单使用实时聚合酶链反应(PCR)。PCR是在重复利用TaqMan测定试剂(应用生物系统公司,培育城市,CA) [9,10]。产品引用以下:解放军₂ib: Hs00386701-m1;中国人民解放军₂花絮:Hs00179898-m1;中国人民解放军₂iid: Hs00173860-m1解放军₂国际教育协会:Hs00173897-m1;中国人民解放军₂iif: Hs00224482-m1;中国人民解放军₂第三:Hs00210447-m1;中国人民解放军₂iva: Hs00233352-m1;中国人民解放军₂-IVB: Hs00979952-m1;中国人民解放军₂印度河流域文明:Hs00234345-m1;中国人民解放军₂试管:Hs00603557-m1;中国人民解放军₂- v: Hs00173472-m1;中国人民解放军₂第六:Hs001/85926-m1;中国人民解放军₂- x: Hs00358567-m1;中国人民解放军₂xiia: Hs00830106-s1;中国人民解放军₂-XIIB: Hs00261432-m1;中国人民解放军₂-VIIA: Hs00968593-m1;中国人民解放军₂-VIIB: Hs01042135-m1;中国人民解放军₂R: Hs00234853-m1。实时PCR进行遵循制造商的建议在最后一卷20l 10l 2 x普遍PCR大师混合,20 ng cDNA体积的9l(互补dna的数量是一个等价的基于RNA的初始金额用于RT反应和1l的20 x TaqMan基因表达特定的调查。PCR参数如下:C 10分钟和四十的循环C / 15秒C / 60秒。放大产品分析了在7000年ABI棱镜系统(应用生物系统公司)9,10]。基因表达水平正常化18 s RNA(产品参考:Hs99999901-s1)根据制造商的建议。大量的各种成绩单比较样本记录的最低水平(一个病人是任意引用1)。相对量化的基因表达进行了比较方法()(图1(一))。实验是在重复。的意思是值中使用了计算通过使用“相对定量计算与分析软件应用生物系统公司实时PCR系统”。NonRT控件(只有RNA)和空白RT控件没有RNA (RT)是运行以确保放大细节。

(一)

(b)

图1

Q-PCR分析解放军₂记录在人类的脑膜瘤肿瘤。(一)代表跟踪18岁和解放军₂iva从两个不同的肿瘤患者(重复样本)。(b)检测(一式两份)的18岁,解放军₂iva,解放军₂-IVB,解放军₂印度河流域文明,人民解放军₂试管,解放军₂六世在脑膜瘤的肿瘤。

2.5。数据分析

意义是评估利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验一个Mann-Whitney紧随其后U以及。

3所示。结果与讨论

在第一组实验中我们研究了如果mrna来自解放军5细胞内₂基因(cPLA四₂和iPLA₂在脑膜瘤中发现。如图1 (b),mrna来自四个五个克隆的解放军₂基因检测。的意思是报道在表值1。中国人民解放军₂试管成绩单没有出席可检测水平。相比之下,中国人民解放军₂iva,解放军₂-IVB,解放军₂印度河流域文明,人民解放军₂六世被发现在96%(25/26),100%(26/26),92%(24/26),和分别为100%(26/26)的肿瘤(图2)。这些结果证实了之前的研究强调解放军₂人类活动在100%的脑膜瘤(6]。(没有区别惠特尼,曼U为中国人民解放军以及)被发现₂记录数量与肿瘤级别(图1),脑膜瘤亚型,炎性细胞渗透,一个关联的水肿,有丝分裂,大脑入侵,vascularisation或坏死(数据没有显示)。分析二十级6个病人显示以下排名在人类脑膜瘤:解放军₂六世中国人民解放军₂-IVB中国人民解放军₂iva中国人民解放军₂印度河流域文明(表1)。中国人民解放军₂-IVB和解放军₂印度河流域文明几乎没有特异性的sn2脂肪酸与计划相比₂包含AA在iva这优先水解磷脂sn2位置[3- - - - - -5]。中国人民解放军₂vi最初报道调解磷脂装修,因此,作为管家蛋白在细胞生长没有显著作用(3,4]。然而最近的一些研究表明,人民解放军₂vi表现出角色在细胞调控中,成长,和死亡。特别是,解放军的一种机制₂vi介导细胞生长需要监管的AA释放,p53, MAPK激活(11]。感兴趣的,责任人p53和MAPK激酶最近在人类脑膜瘤的病理报告(12,13]。解放军的作用₂第六,因此,建议在脑膜瘤肿瘤的生长。在一起,这些观察结果可能表明解放军₂vi作为药物开发的新颖和有趣的目标为脑膜瘤治疗。然而,鉴于解放军的无处不在的表达式₂六世在glycerophospholipid代谢及其作用,药物策略针对解放军₂vi必须表现出选择性以避免不受欢迎的副作用。

(一)

(b)

(c)

(d)

图2

胞质解放军₂记录在人类的脑膜瘤。Sixteen-grade我和高二2 + 3脑膜瘤。基因表达水平正常化18 s RNA。数量的记录比较样品与记录的最低水平(一个病人是任意引用1)。)表明患者没有检测记录。组之间没有显著差异情况进行了记录。

在第二组实验中我们研究了如果mrna来自九个解放军₂基因(即。,中国人民解放军₂ib,解放军₂活动花絮,解放军₂iid,解放军₂国际教育协会,中国人民解放军₂iif,解放军₂第三,中国人民解放军₂- v,解放军₂- x,解放军₂xiia,解放军₂-XIIB)被发现在人类的脑膜瘤。中国人民解放军₂国际教育协会,中国人民解放军₂iif,解放军₂-XIIB成绩单没有出席在肿瘤检测水平,解放军₂iid和解放军₂- x记录被发现在几号(4/26,15%)。相比之下,中国人民解放军₂ib,解放军₂活动花絮,解放军₂第三,中国人民解放军₂- v和解放军₂xiia被发现在88%(23/26),88%(23/26),77%(20/26),65%(17/26)和96%(25/26)的肿瘤,分别(图3)。的意思是报道在表值1。结果显示以下等级级的解放军₂成绩单在脑膜瘤:解放军₂xiia中国人民解放军₂花絮中国人民解放军₂ib中国人民解放军₂- v中国人民解放军₂三世中国人民解放军₂iid中国人民解放军₂- x。(没有区别惠特尼,曼U以及)没有被发现₂记录数量与肿瘤级别(图3),脑膜瘤亚型,炎性细胞渗透,一个关联的水肿,有丝分裂,大脑入侵,vascularisation或坏死(数据没有显示)。中国人民解放军₂xiia,解放军₂活动花絮,解放军₂ib可能与脑膜瘤的生长。解放军的生理作用₂xiia仍然是一个悬而未决的问题。是否计划₂xiia展品疲软AA催化活性(14),这种酶的潜在作用是建议在膜融合或细胞分裂15]。中国人民解放军₂xiia据报道,抑制骨形成蛋白(BMP)通过激活Smad1/4复合物的损失(16];由于自BMP抑制人类恶性胶质瘤的肿瘤发生的潜在的重要性通过触发Smad信号级联(17]。中国人民解放军₂ib表达主要是神经元在人类大脑18]。除了其分解脂肪的和炎性活动,人民解放军₂ib作为受体配体诱导细胞信号和随后cPLA激活₂,从而间接导致生产AA (19]。但是解放军的角色₂ib作为中国人民解放军的配体₂R仍然是有争议的。中国人民解放军₂花絮诱导出促有丝分裂的反应和激活AA代谢在星形细胞瘤细胞(20.),通过活性氧对神经细胞死亡至关重要(21和在细胞衰老过程中发挥作用22]。最后,研究表明解放军的角色₂活动花絮,解放军₂第三,中国人民解放军₂- v作为潜在的预后标志物在结直肠腺癌和前列腺癌23,24]。报告的数据图3建议水平的人民解放军₂活动花絮,解放军₂第三,中国人民解放军₂- v成绩单大大不同病人之间(见日志规模)。可以,他们的水平与脑膜瘤肿瘤病人结果有关吗?显然更大的患者数量的调查将感兴趣的测试这个假说。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

在第三组实验中我们研究了PAF-AH酶构成另一个计划₂亚科。如图4(上半部分),解放军₂-VIIA(等离子PAF-AH形式)和中国人民解放军₂-VIIB(细胞内PAF-AH形式)出现在100%(23/23)和95%(22/23)脑膜瘤肿瘤。意味着C_T报道在表值1。(没有区别惠特尼,曼U以及)被发现PAF-AH记录金额与肿瘤级别(图4(一)),或其他临床资料(数据没有显示)。目前的结果证实了之前的研究报告PAF-AH酶活性在脑膜瘤匀浆(6]。PAF-AH家族展现独特的底物特异性对拥堵和氧化磷脂。的这些生物活性磷脂降解PAF-AH可能导致炎症反应的终止。它的存在在人类脑膜瘤是一致的存在拥堵在脑膜瘤肿瘤(6,25]。

(一)

(b)

(c)

图4

PAF-AH和解放军₂在人类脑膜瘤R成绩单。上面板:等离子PAF-AH (PLA₂-VIIA)和胞内PAF-AH (PLA₂-VIIB)脑膜瘤肿瘤。Fifteen-grade我和九年级2 + 3脑膜瘤。(患者)表示没有可检测记录。组之间没有显著差异情况进行了记录。较低的面板:解放军₂R成绩单fifteen-grade我和九年级2 + 3脑膜瘤。

最后在第四组实验中我们集中我们的注意力在解放军₂在人类脑膜瘤R成绩单。如图4(下图),解放军₂R记录中发现100%(23/23)脑膜瘤肿瘤与肿瘤级别但没有显著的联系。中国人民解放军₂R可以作为配体数解放军₂因此协调各种生物反应(如细胞增殖、细胞迁移、激素释放,脂质介质生产和细胞因子生产)。反过来,中国人民解放军₂在解放军R也可以起到负面的作用₂函数通过下调他们夸张的反应计划₂R是参与降解/解放军的内化₂(26]。特别是,中国人民解放军₂R缺陷小鼠表现出抗内毒素休克(27中国人民解放军)和可拆卸的₂R防止复制衰老的发生和减少压力诱导衰老28]。最后中国人民解放军₂R是调节在dermatofibrosarcoma [29日]。

总之,许多基因编码形式的cPLA倍数₂,解放军₂,PAF-AH表达人类脑膜瘤(在mRNA水平),他们可能在肿瘤的生长不仅作用于磷脂装修还通过改变当地类二十烷酸和/或细胞因子网络。的证据表明immunhistochemistry的重要性确定的相对表达不同的解放军₂形式在人类脑膜瘤肿瘤。发现特定的受体结合的解放军₂强烈表明,这些酶可以通过绑定到一个受体发挥各种生物反应,除了他们的酶活性。感兴趣的脑膜瘤肿瘤表达了中国人民解放军₂R成绩单。显然是需要进一步的研究来阐明解放军的贡献₂,cPLA₂,iPLA₂,PAF-AH脑膜瘤并确定其可能的相关性在新的治疗干预的目标。

缩写

中国人民解放军₂:	磷脂酶一₂
解放军₂:	分泌磷脂酶一₂
cPLA₂:	胞质磷脂酶一₂
iPLA₂:	钙独立磷脂酶₂
聚合酶链反应:	聚合酶链反应。

确认

这项研究支持由联赛“La靠le癌症”(拉西de La Haute-Vienne)和“狮子俱乐部德拉科,区33 103地区Sud”。创始人没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

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1。介绍

2。材料和方法

2.1。病人

2.2。RNA提取

2.3。反转录

2.4。实时聚合酶链反应分析

2.5。数据分析

3所示。结果与讨论

缩写

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