文摘
的局部免疫反应性研究了c反应蛋白(CRP)在异位猪模型的posttranplant闭塞的毛细支气管炎(OB)。支气管移植和控制进行自体连续出天后皮下移植。自体呆在专利。在同种异体,炎性细胞的增殖()和成纤维细胞()导致阻塞支气管腔()。涌入的CD4 + ()和CD8 + ()细胞同种异体移植物的免疫反应。CRP积极性同时增加支气管壁(myofibroblasts),在巨噬细胞,内皮细胞。本地OB的CRP是预测的功能特征(-0.879,. 05−)。闭塞的早期病变还显示CRP积极性,但不成熟,collagen-rich闭塞的插头()。OB发展期间,c反应蛋白是局部炎症细胞,myofibroblasts和内皮细胞可能是局部炎症反应的一部分。
1。介绍
具有重要闭塞性细支气管炎(OB)的主要原因是肺移植受者移植肺功能障碍和后期死亡率(1]。注册表数据表明,移植后5年,45%的接受了OB (1]。OB是慢性排斥反应的表现与组织病理学特征,包括牙龈炎症,上皮细胞损伤,和过度fibroproliferation,导致永久删除的小航空公司(2]。肺移植的长期效果时,才有可能更好地理解的分子和细胞机制OB和更好的治疗策略。
c反应蛋白(CRP)是一种急性期蛋白,主要是合成了肝细胞炎症,感染,和组织损伤3,4]。肝外合成c反应蛋白是第一次描述了人类外周血淋巴细胞(5]。表达在人类神经元(6),颈动脉内皮细胞(7,正常的维管组织8),冠状动脉平滑肌细胞(9,10),动脉粥样硬化斑块11,12),和脂肪细胞13也被报道。在人类呼吸道、鼻息肉上皮细胞表达c反应蛋白(14),在肺组织肺泡巨噬细胞(15]。
CRP作为临床急性全身炎症的标志。肺部疾病与炎症特征提高血清CRP水平(16,17,也有局部肺c反应蛋白合成的证据(18]。OB以来炎症特征,我们假设当地CRP生产可能发生在OB发展具有重要的意义。调查这一假设,我们进行了一次详细的c反应蛋白表达分析在我们的猪模型的OB(具有重要的意义19]。
2。材料和方法
2.1。实验模型
支气管部分皮下注射移植在11 random-bred无关的国内猪,每个重达20公斤。动物收到人道关怀符合“实验动物保健原则”(NIH出版25卷,28号1996年修订),特定的国家立法。协议是通过动物研究机构的委员会和南芬兰省级政府。特别注意了在手术麻醉和止痛。
动物麻醉的手术如前所述[20.]和安乐死与大剂量静脉注射戊巴比妥钠的后续。捐献者左尾肺叶被植入体的制备。一系列的支气管段,长度1.5厘米,是皮下移植到每个收件人的腹侧。除了6与同种异体移植物植入动物,5动物收到自体控制。共有190个样本收获通过小切口在后续的日子里2、4、7、9、11、14、17、21、28天的评分。每个样本的一部分(2/3)在石蜡formalin-fixed和嵌入式,剩下的(1/3)snap-frozen在液氮和存储直到使用。
2.2。组织学和免疫细胞化学
formalin-fixed部分(4米)被安装在Vectabond-coated幻灯片(向量实验室。有限公司,英国彼得伯勒)和加工组织学(苏木精和伊红)和免疫细胞化学。鼠标antipig单克隆抗体(σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国)对波形蛋白(1:1000)α滑肌细胞肌动蛋白(αsma)(1: 16 000)被用作前面描述的(21),连同标准avidin-biotin-peroxidase技术(22]。
冻结的部分,4米厚,被切割和风干到silane-coated幻灯片,固定在丙酮10分钟和存储直到使用。3 - layer间接immunoperoxidase法和老鼠单克隆抗体检测猪CD4和CD8(美国VMRD Inc .、铂尔曼、清洗)使用除了小鼠单克隆抗体人类单核细胞/巨噬细胞(英国牛津Biomarketing牛津),还与猪巨噬细胞活性,和人类CRP (Abcam有限公司,剑桥,英国)(1:600),还与猪c反应蛋白活性,如前所述23]。控制,非特异性鼠免疫球蛋白(Dako a / S,斯特鲁普、丹麦)是用来染色所有部分由一个相同的协议。
2.3。微观评估
从每个样品3日进行单独评估支气管时可用。上皮损失,腔的闭塞,支气管壁纤维化(病理性增加结缔组织纤维母细胞和细胞外基质组成的),和炎症(组织)的浸润炎症细胞数量分级半定量的范围。规模,使用分数从0到3,如下:0 =没有变更,1 =轻度改变,2 =中等变更(病理改变等于正常组织)和3 =严重改变(主要病理变化)。
CD4 +细胞、CD8 +细胞和巨噬细胞数在3大功率视觉领域为每个评估支气管。CRP-positive上皮细胞的百分比和闭塞的插头是分开计算,和染色强度分级规模从0到3,0 = -;1 =显示弱阳性细胞染色;2 =更强烈和/或不规则染色;3 =强烈,均匀染色。CRP指数计算CRP-positive细胞的百分比乘以c反应蛋白染色强度得分,我们之前用过的方法来评估cyclo-oxygenase表达式(20.]。CRP-positive细胞在支气管壁评估等级从0 - 3基于采用免疫染色强度和阳性细胞的数量。
2.4。统计数据
所有数据都表示为的意思标准误差(SEM)。的Mann-Whitney紫外线测试,Z调整的关系(Statistica v.5.1, StatSoft Inc .,塔尔萨,俄克拉荷马州,美国),用于统计分析,被认为具有统计显著性。斯皮尔曼等级相关的服务进行相关性分析。
3所示。结果
3.1。组织学
第二天具有重要的意义,缺血性损伤气道上皮细胞是温和的自体控制和支气管移植。快速恢复正常呼吸上皮发生在7天内自体。在同种异体,暂时和部分恢复4天转向快速失去上皮细胞与品位7天,当一个显著差异相比是明显的缺损;这个时候,大部分保存上皮由纯粹的基底细胞层在同种异体。
炎症在支气管壁保持低品位缺损(图1)。在同种异体,炎症细胞的数量逐渐增加,相比有一个明显的区别从第四天缺损上。fibroproliferation在支气管壁平行的发病的增加炎症级,和fibroproliferation明显不同于异体移植与自体白天11(图1)。闭塞的病变逐渐堵塞支气管腔在同种异体,显示显著差异从缺损7天在(图1)。发生严重的支气管移植重建,而保持自体专利运作粘液腺。
(一)
(b)
(c)
3.2。免疫细胞化学
成纤维细胞显示波形蛋白阳性染色αsma在支气管壁和闭塞的病变。强烈的积极性αsma是明显的在新成立的闭塞的插头,但不成熟,collagen-rich scar-like病变。
支气管壁的控制自体,几个CD4 +和CD8 +细胞在随访观察。涌入的CD4 +和CD8 +细胞CD8 +细胞主要显示支气管移植免疫反应,明显不同于从第四天开始自体(表1)。巨噬细胞的数量是最高的在最初的缺血性损伤和免疫反应的发生;巨噬细胞存在更多的第七天开始在同种异体,在天9日也显示出统计上的显著差异11日,14日,21岁,28(图1)。
在最初的缺血性损害后续第二天,57%的呼吸道上皮细胞的自体和同种异体表达c反应蛋白的48%。c反应蛋白染色强度和和c反应蛋白指标和,分别。迅速c反应蛋白表达降低与上皮损伤移植:16% ()保存细胞的c反应蛋白染色强度和CRP指数在7天。中等到高强度上皮的表达,观察CRP在后续的恢复呼吸道上皮缺损。
观察c反应蛋白表达在所有植入在支气管壁初始缺血性损伤,然后减少自体。相比之下,迅速增加支气管移植(图表达1)。统计的区别和自体移植达到后续天9 ()。表达不仅是第一个主要是巨噬细胞(图中观察到1),但也myofibroblasts和内皮细胞(图中观察到2)。而巨噬细胞的数量减少对随访结束时,染色的强度增加内皮c反应蛋白免疫反应性。积极myofibroblasts算少数,观察到后续的开始。相关分析表明,c反应蛋白染色强度等级在支气管壁在后续的日子里14中,17日,21日和28似乎与支气管壁炎症和预测,CD4 +和CD8 +细胞的数量,支气管壁fibroproliferation和导管闭塞(表2)。这些都是OB的功能特征。
(一)
(b)
(c)
闭塞的病变早期,大多数的细胞包括成纤维细胞、炎症细胞、内皮细胞显示CRP-positivity2.0强度得分(图1)。11天之后,当72%的细胞在闭塞的插头CRP-positive,细胞表达c反应蛋白的比例迅速下降。CRP指数计算在闭塞的早期病变4天,但只有在28天的成熟,collagen-rich插头。有统计上的显著差异的阳性细胞百分比和CRP指数9天相比17天,14天28天。控制染色阴性。
4所示。讨论
这项研究表明,c反应蛋白表达在支气管壁和闭塞的病变主要不仅由巨噬细胞,而且myofibroblasts和内皮细胞的OB发展具有重要的意义。当地c反应蛋白表达以前观察到在呼吸道上皮细胞(14,24),在肺泡巨噬细胞(15,25]。据我们所知,这是第一次报告的c反应蛋白表达在肺的肺成纤维细胞和内皮细胞。
在我们的猪模型,OB发达总是在同种异体,而保持自体专利,如预期19,26]。人类的组织学改变相似OB (2,27和在动物模型中28,29日]。新血管形成中快速植入物(19];因此,最初的缺血性损伤在缺损完全一周内复发。此外,部分恢复之前发作的同种异体免疫反应也被观察到。CD4 +和CD8 +细胞的大量涌入是指示性的细胞介导的免疫反应30.]。波形蛋白和sma postitivity表示myofibroblasts fibroproliferatory阶段在支气管壁和闭塞的病变(31日)和巨噬细胞与特定的免疫细胞化学染色阳性。
c反应蛋白表达曾被报道corticular拒绝肾小管和肾小球细胞(32]。测量尿液c反应蛋白在肾移植受者被认为是一个有用的工具在早期的同种异体移植物排斥反应的诊断33]。c反应蛋白也有属性作为一个敏感的肺损伤的标志(25]。然而,我们的研究并不支持使用的c反应蛋白测定洗涤液体OB的早期标志,因为当地c反应蛋白在人体肺部也表示在其他炎症条件对炎症刺激反应(24,34]。同样,在我们的研究中不断产生自体CRP在呼吸道上皮细胞。这可能发生最初作为应对缺血手术损伤和后来作为应对不断增加的压力在支气管移植由于通过分泌粘液。我们建议在自体上皮c反应蛋白的表达该模型的特征。这也是之前在诱导一氧化氮合酶和硝基酪氨酸表达(35]。
并联同种异体免疫反应,我们观察到c反应蛋白表达在支气管壁巨噬细胞以及myofibroblasts和内皮细胞。众所周知,肺泡巨噬细胞表达c反应蛋白(15]。c反应蛋白表达也曾被观察到在内皮细胞(7)和光滑的纤维细胞(9,10]。在目前的研究中,染色强度增加随访中巨噬细胞和内皮细胞,但只在早期观察myofibroblasts正如前面在光滑的纤维细胞(7纤维斑块(月初)和36]。最终随访巨噬细胞染色强烈,无数毛细血管的内皮也是如此。CRP的品位在支气管壁与强度,预测进一步的炎症,CD4 +和CD8 +细胞的数量,和fibroproliferation,包括支气管管腔闭塞。所有这些功能都是OB的特征(37]。在缺损,壁画CRP生产处于关机状态。然而,c反应蛋白表达在第一天的随访期间,自体缺血性损伤复发时,和随后的炎症。内皮CRP生产一直在报道人体颈动脉(7)在主动脉(38),但它并没有此前报告在肺组织或例肺同种异体移植物排斥反应。在这项研究中,c反应蛋白表达与重构过程和支气管壁炎症,因为它曾被报道与动脉粥样硬化的进展在冠状动脉(36]。
炎性细胞因子白介素(ILs) 1和6是鼓舞人心的,但肿瘤necoris因子(TNF)是一种抑制性细胞因子对肝脏的合成c反应蛋白(39]。当地c反应蛋白表达也被认为是对炎性细胞因子(9)在肺调节免疫级联同种异体移植物排斥。在肾小管上皮细胞,肿瘤坏死因子-不刺激当地的c反应蛋白表达(32),但在人类肺上皮细胞、c反应蛋白合成细胞因子白细胞介素6,TNF -,干扰素,摘要意思(24]。脂肪细胞也可以产生CRP的影响下白细胞介素6和TNF -(13]。卡萨尔斯等人认为CRP可能调节肺部炎症减少TNF -的生产在肺泡巨噬细胞(25]。我们以前学过TNF -在我们的模型中OB (40]。在支气管壁表达式平行的c反应蛋白的免疫反应性。肿瘤坏死因子-表情似乎下降之前,CRP在闭塞的呼吸道疾病的发展。这可能会刺激肿瘤坏死因子的影响——的结果在c反应蛋白表达。
闭塞的插头,观察CRP积极性在大多数细胞。成熟的插头表达显著下降。因此,正如在动脉粥样硬化病变38),当地CRP在闭塞的斑块与斑块活动。在成熟的颈动脉斑块,c反应蛋白表达明显炎症细胞以及新成立的微血管的内皮细胞(7]。我们研究发现CRP表达式在早期的闭塞的插头,但不成熟,scar-like病变,的存在αsma也不表达。最强烈的c反应蛋白表达是观察在加速炎症阶段。因此,看来,CRP在闭塞的插头是局部炎症反应,在动脉粥样硬化病变(38]。
抑制补体激活的OB发展似乎对移植物的生存有好处41]。有证据表明,c反应蛋白限制过度补体激活(42),减少complement-mediated损害宿主组织。此外,c反应蛋白和补充组件一致的行动来促进凋亡细胞的清除,从而防止坏死(43]。我们已经表明,凋亡细胞死亡过程中是一个重要的机制,导致肺移植后移植物恶化OB (44]。CRP在我们的模型的确切作用OB仍未得到解决。可能观察到当地c反应蛋白促进影响炎症组件(45,46)和同种异体移植物排斥。
5。结论
在OB具有重要的意义。本研究文件c反应蛋白免疫反应性有多种因素导致慢性肺部同种异体移植物排斥反应。c反应蛋白表达可能是当地的炎性细胞因子和促进炎症在OB组件的开发。
缩写
| OB: | 闭塞性细支气管炎 |
| c反应蛋白: | c反应蛋白 |
| αsma: | α滑肌细胞肌动蛋白 |
| 扫描电镜: | 标准错误 |
| IL: | Interleukine |
| 肿瘤坏死因子-: | 肿瘤坏死因子- |
确认
作者要感谢席斯可Litmanen和Pirkko Uhlback优秀技术援助。研究经费支持的工作是赫尔辛基大学医院专项资金,芬兰抗结核协会基金会和坦佩雷结核病基金会。