文摘
本研究旨在阐明肥大细胞在结肠炎复发的作用诱导trinitrobenzenosulphonic Wistar鼠的酸。结肠炎诱导结肠中的组胺浓度增加,26天达到顶峰。肥大细胞的数量,可能不成熟,在8天高出十倍。不同于动物肠道寄生虫感染,结肠炎缓解后,肥大细胞不迁移到脾,显示肥大细胞增殖呈现不同的特征取决于炎症刺激。柳氮磺胺吡啶治疗,doxantrazole、槲皮素或nedocromil没有增加组胺浓度或肥大细胞数量在结肠26天,从而显示出这些细胞的缺乏脱粒。总之,尽管肥大细胞增殖与结肠炎,这些细胞和介质似乎没有明显作用的结肠炎复发。
1。介绍
在肥大细胞脱颗粒,各种介质释放包括组胺、前列腺素D2,白三烯C4、血小板激活因子、肝素、中性蛋白酶。这些细胞可能通过激活参与炎性疾病的病因和脱粒1),包括炎症性肠病(IBD)及其主要临床表现,如溃疡性结肠炎(UC) [2和克罗恩病(CD)3]。炎症性肠病的特点是慢性肠道炎症的发展和缓解的交替活跃的炎症过程。炎症性肠病的病因仍然不明,但据信包括几个相互作用的免疫,环境和遗传因素(4]。主要肥大细胞组胺mediator-known增加血管通透性,白细胞浸润,平滑肌衰退(被认为是参与肠道炎症(5]。事实上,直肠活检从发炎地区在IBD自发释放组胺6]。
肥大细胞参与患者的肠黏膜溃疡性结肠炎或节段性回肠炎是有争议的;报告显示肥大细胞的数量在增加(7],[下降8之间,或稳定活跃的IBD和控制活组织检查(9]。这些差异可能源于不同的测量技术(组织固定、染色、细胞计数)或由于炎症过程的课程(活动性疾病,缓解药物治疗)10]。事实上,肥大细胞的功能评价体内非常复杂,因为肥大细胞可能释放几个介质具有相反的生物效应(11)也参与纤维化和伤口愈合过程11- - - - - -13]。所有这些发现肥大细胞是导致假设不仅促炎效应细胞,而且监管免疫系统的组件与积极参与组织修复(12- - - - - -14]。
实验分析与临床研究相比,使用不同的动物物种变化较小的可以提供稳定的疾病模型,给出一个适当的样本的动物数量,适当的统计数据分析。因为动物研究模拟临床症状和/或发病机理,从这些研究获得的数据可用于评估疾病的病因。mast-cell-deficient Ws / Ws老鼠的研究表明,肥大细胞并不TNBS-induced结肠炎的发展至关重要。然而,这些先前的研究与TNBS-induced结肠炎大鼠使用没有复发,人类炎症性肠病的常见临床表现,进行评估后只在天7和14结肠炎感应(15]。
通过这种方式,本研究旨在确定肥大细胞及其任何介质结肠炎复发引起TNBS Wistar鼠。同时,我们核实是否在结肠炎缓解,这些肥大细胞倾向于迁移到脾,类似于发生在动物肠道寄生虫感染(16,17]。此外,我们雇佣了肥大细胞分泌抑制剂(nedocromil [18),槲皮素(19],doxatranzole [20.])来验证是否结肠肥大细胞被激活在溃疡性结肠炎复发。
2。材料和方法
2.1。动物
特定的无菌(SPF)雄性Wistar鼠(180 - 200 g)获得CEMIB-UNICAMP(巴西坎皮纳斯,SP)被安置在markrolon笼子(5每笼老鼠)和维护空调动物季度12小时光暗周期。动物有免费的水和食物。实验协议是经伦理委员会批准用于动物实验的生物科学研究所UNESP, Botucatu, SP,巴西。
2.2。药物和解决方案
Doxatranzole(默克公司)溶解在二甲基亚砜(DMSO) 5%。Nedocromil(σ)和槲皮素(σ)溶解在蒸馏水和柳氮磺胺吡啶methylcelulose(σ)的1%。DMSO溶液的浓度和甲基纤维素使用不会干扰自发组胺释放。
2.3。感应的溃疡性结肠炎复发
结肠炎最初引发的方法描述了莫里斯et al。21]。动物禁食过夜,并与氟烷麻醉。麻醉,他们收到10毫克的TNBS溶解在乙醇0.25毫升50% (v / v)的聚四氟乙烯套管通过肛门插入8厘米。老鼠从noncolitic组0.25毫升的磷酸缓冲盐。14天之后,动物收到第二个10毫克的剂量TNBS试图模仿人类炎症性肠病中常见的复发。TNBS政府后,老鼠被保存在一个头的位置,直到他们从麻醉中恢复过来,然后回到他们的笼子里。动物身体重量和发生的腹泻(被肛周的毛弄脏),每组每天都被记录下来。
2.4。实验设计
两个实验设计采用目前的研究。在第一个,我们评估了组胺浓度峰值,肥大细胞数,结肠病变的宏观特征和可能的肥大细胞迁移到脾脏。根据这些初步数据,第二个实验是为了评估可能的肥大细胞的参与和组胺TNBS-induced结肠炎复发。在第二个实验中,动物们接受25毫克/公斤/天柳氮磺胺吡啶(订单),100毫克/公斤/天nedocromil (i.p), 5毫克/公斤/天doxantrazole (i.p),或10毫克/公斤/天的槲皮素(i.p),复发感应后12天。治疗开始前2小时后复发感应和扩展的26天初始结肠炎感应,这对应于组胺浓度峰值。参数评估总组织组胺浓度,肥大细胞数量,结肠损伤的宏观特性colitis-relapsed动物。
2.5。宏观分析
每两天两组动物(TNBS和生理盐水组)被过量的氟烷安乐死,剖腹手术后结肠段得到,最终发生结肠癌和邻近器官之间的粘连。他们被放置在一个冰冷的盘子,打扫的脂肪和肠系膜,涂抹在滤纸上,重量,长度测量恒定负载下(2 g)。结肠是纵向开了,得分为宏观上可见损失规模清廉(表1由两个观察者不知道治疗),根据贝尔等描述的标准。22]。
2.6。组织组胺浓度
结肠中的组胺总额确定每个动物实验的组织。组织样本(约30 - 100毫克)用于评价组织组胺浓度的体重,3毫升的0.9%盐水煮10分钟。上层清液被转让清洁管和储存在-20°C到分析。结肠的样本进行了分析,后蛋白质的去除高氯酸(2%)海岸的荧光法等。23)使用模块化的自动连续流系统(24],遗漏的提取步骤。
2.7。显微分析
在结肠炎复发协议,代表整个肠道标本取自结肠炎症的一个区域对应于邻近节段评估总值宏观损伤和固定在Alfac解决方案(酒精68%,醋酸5%,甲醛10%)为24小时。石蜡的截面选择和嵌入式。相当于结肠段也从生理盐水组。10部分m是获得从不同水平和0.5%甲苯胺蓝染色(pH值0.5)(25]。粘膜肥大细胞的数量在10个随机选择大功率字段()计算,每10字段计算数量。光学显微镜的样品进行了分析。
2.8。统计分析
所有结果都表示为均值±S.E.M.差异测试使用单向方差分析(方差分析)和事后至少测试或学生的意义t以及对未配对样本。非参数数据(分数)表示为中位数和四分位范围(与Mann-Whitney U),分析了测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验。不同比例由确切概率法进行了分析。统计学意义是。
3所示。结果
组胺含量剖面的结肠TNBS-treated Wistar鼠并没有改变直到第十天,当它开始增加,峰值约26天,剩下稳定至少在40天。治疗改变不了组胺含量(从天0到40)在脾脏(图1)。
尽管有显著增加(大约10倍)肥大细胞数量在8天,20日,26日和28日,组胺含量的增加TNBS治疗重大只后(图26和28天2)。诱导后由TNBS肠道炎症过程,组织损伤(估计分数)增加,已经最大化第二天,剩余高直到第十天开始下降,变得差不多了14天。复发诱导损伤水平与第一个相似的治疗,20天左右达到高峰,在30天恢复。粘连、腹泻和体重/长度比率呈现类似的行为,直到第14天。然而,复发后只有腹泻百分比达到了高水平的第一个治疗;粘连的比例大约是四分之一的第一个治疗,而重量/长度比率显示很少改动。身体体重降低了TNBS结肠炎从第二天到6天,目前的动物又开始增加体重,直到实验结束。然而复发后的炎症过程,动物显示(表再次失去体重2)。noncolitic统计分析显示显著差异(盐)和colitic (TNBS)团体与组织损伤,体重,和结肠重量/长度比8天,20日,26日和28日。粘连和腹泻,8天的差异显著,20日和26但不是在28天(表3)。
(一)
(b)
结肠colitic动物doxantrazol或槲皮素处理组胺浓度上升到同一水平的TNBS对照组,但高于柳氮磺胺吡啶,nedocromil, noncolitic(生理盐水)组。与柳氮磺胺吡啶治疗组间没有差异,nedocromil, noncolitic(生理盐水)(图3(一个))。肥大细胞数量在所有这些团体的冒号遵循相同的概要文件的组胺浓度相比,noncolitic(生理盐水)组(图3 (b))。
(一)
(b)
药理治疗colitic老鼠nedocromil减少结肠组胺浓度与TNBS相比对照组(图3(一个))。此外,nedocromil和柳氮磺胺吡啶治疗减少结肠肥大细胞数量与TNBS控制(图3 (b))。
柳氮磺胺吡啶治疗,nedocromil doxantrazole,槲皮素没有宏观上减弱活化炎症过程的结肠组织。没有下降的宏观损伤分数或结肠重量/长度比与控制相比colitic动物复发。此外,腹泻发生率无显著差异被发现,在震源邻近器官粘连,或体重(表4)。
4所示。讨论
结肠炎的半抗原诱导大鼠TNBS已广泛应用于研究这种疾病的生理病理学。然而,这个模型有一定的局限性,因为一旦管理TNBS intracolonically炎症状态解决自发地随着时间的推移,直到结肠粘膜完全愈合,这不是人类IBD的情况(26]。最近,Galvez et al。26和迪史塔西et al。27]报道重新激活结肠炎模型类似于目前的研究使用的协议。TNBS第二intracolonic制定有效地导致结肠炎症反应的激活,可以在不同的宏观和一般临床参数的改变炎症。Intracolonic TNBS /乙醇作为管理最初描述(21]引起炎症反应与其他地方的类似报道特点:大鼠实验动物腹泻(22[]厌食症和减肥23),而他们的结肠段出现严重溃烂发炎,表现出强烈的充血和肠壁增厚(28]。
组胺经常被用作生化标记组织的肥大细胞的数量,因为除了在啮齿动物的胃,肥大细胞代表主要的外围组织库的胺(29日]。肥大细胞数量与组织有关组胺水平在许多不同的动物和人类组织,在正常组织和那些接受纤维化或炎症29日,30.]。
在我们目前的研究中,结肠中组胺浓度colitic老鼠保持不变直到结肠炎感应后10天,然后开始上升到峰值在26天。虽然组胺浓度并没有改变,直到10天后结肠炎感应,肥大细胞数量增加粘膜和粘膜下层的层。已经8天约10倍,之后提出了小海拔直到26天。这无疑是增加由于肥大细胞增殖;缺乏相应的组胺浓度的增加是由于不成熟的肥大细胞,细胞质颗粒中,因此更少的组胺(31日]。
这增加的肥大细胞,直到一天26日证实了以前的发现中获得相同的模型由莫里斯et al。21]中提到,肥大细胞数量增加发炎组织3和4周后结肠炎感应;然而,这些细胞没有明确的作用。最近,增加肥大细胞数在5 - 20天内(32)和肥大细胞升高protease-2 (RMPC-2)水平在3周报告在结肠组织取自TNBS老鼠(15]。
尽管激烈的肥大细胞增殖在炎症过程中,观察这些细胞没有迁移到脾脏从疾病中康复期间观察到肠道感染旋毛虫(17]。这一事实表明,肥大细胞增殖可以显示不同的特征取决于类型的炎症过程。
诱导后TNBS结肠炎的雄性sd大鼠中,Gelbamann和巴雷特(5)也没有观察结肠组胺浓度的差异,直到结束的第一周,但是4周后这个参数有大幅上升。有趣的是,这些研究没有采用复发;然而,在28天(16组胺浓度的实验g / g)是高于我们的(10.5g / g),这表明复发没有造成额外的肥大细胞增殖。相比之下,复发造成额外的刺激,引起组织损伤和更高比例的粘连,腹泻,即使没有多少变化可以看到体重和质量/长度比。
徐et al。32)报道,肥大细胞数量在拉与TNBS-induced结肠炎大鼠的结肠低在诱导后的第一个五天,显示肥大细胞脱粒。这种效应并不在我们的实验观察到由于肥大细胞多8天与noncolitics老鼠(生理盐水组)相比,显示肥大细胞脱颗粒的缺失。
槲皮素、doxantrazole nedocromil引起肥大细胞稳定与顺向抑制组胺释放33]。在目前的研究中我们已经表明,预处理与槲皮素或doxantrazole改变不了组胺浓度在结肠,表明缺乏在肠道炎症过程中组胺释放;否则,这些药物会导致组胺浓度的增加。这些疗法与槲皮素或doxantrazole表明不激活肥大细胞对TNBS诱导的肠道炎症过程。同样,Gelbmann和巴雷特(5)也没有观察组胺浓度差异的结肠colitic老鼠接受另一个抗组胺剂剂,苯海拉明,相比TNBS-control老鼠。
除了不增加组胺的浓度,nedocromil导致组胺和肥大细胞数量减少,可能由于其抑制这些细胞的增殖和分化32]。同样,柳氮磺胺吡啶也会引起肥大细胞数量的减少可能是由于其著名的抗炎效应(34]。
总之,我们已经表明,尽管肥大细胞与肠道炎症过程的增长表明海拔高度观察肥大细胞数量和组胺浓度,似乎这些细胞和介质不干扰结肠炎,至少在这TNBS管理引起的炎症过程。这些结果与下巴和巴雷特(协议35)和Fukumoto et al。15显示肥大细胞是谁不重要的发展TNBS-induced结肠炎大鼠或小鼠。此外,扩散肥大细胞不迁移到脾脏结肠炎缓解期间,与什么发生在感染寄生虫。
确认
这项工作是支持Fapesp (Fundacao必须占州政府德帕罗尽管Estado de Sao Paulo),斗篷(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越,巴西教育部,巴西),和CNPq(慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府,科技部门、巴西)。