文摘

本研究的目的是分析影响褪黑激素政府是否核factor-kappa (NF - BB)活动,促炎细胞因子表达,SAH后的基底动脉和氧化反应。共有48个兔子被随机分为4组:对照组,长官,长官+汽车集团和SAH +褪黑素组。所有SAH动物受到自体血注入小脑延髓池两次每天0和2。褪黑激素是腹腔内接种剂量的5毫克/公斤/ 12 h与长官同时从第0天到第五天。底动脉提取SAH后5天。因此,我们发现血管炎症和氧化应激诱导的SAH的动物。在动物身上褪黑激素,底动脉NF -B和促炎细胞因子减少相比vehicle-treated动物。氧化应激指标也表明褪黑激素治疗后差别明显对这些。此外,政府的褪黑激素预防血管痉挛SAH后5天。总之,post-SAH褪黑激素管理可能减弱炎症反应和氧化应激在动脉痉挛,这可能是一种机制参与褪黑激素的疗效随后SAH后血管痉挛。

1。介绍

的最常见原因是脑血管痉挛残疾和死亡的病人患动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH) (1]。通常是脑血管痉挛的血液制品,尤其是氧合血红蛋白(OxyHb)蛛网膜下腔。尽管发展中血管痉挛OxyHb的触发作用是众所周知的,血管痉挛的确切机制(s)仍然是未知的。可能的机制可能包括:调节血管炎症,内皮细胞凋亡,增加自由基的产品和氧化应激,二磷酸腺苷(ADP),诱导血管舒缩变化,抑制一氧化氮(NO)通路,蛋白激酶C (PKC)通路在血管平滑肌,其中炎症和氧化应激两个血管痉挛的病理过程中发挥着重要作用2- - - - - -4]。

最近,几个SAH的实验模型的研究表明,褪黑素可以防止血管痉挛(5- - - - - -7];然而,vasoprotective作用的确切机制目前还不清楚。如前所述,Ersahin et al .,褪黑激素治疗由于其自由基清除特性显著地抑制SAH-induced脑组织脂质过氧化和中性粒细胞浸润在大鼠SAH感应的第二天。然而到目前为止,没有发现研究文献中探讨褪黑素对血管炎症反应和氧化应激的影响后,长官。

有越来越多的证据表明,炎症是至关重要的发展[脑血管痉挛8]。核因子-B (NF -B)和促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子(肿瘤坏死因子-1)、白介素(IL)il - 6,可能导致炎症在动脉痉挛的关键因素9]。氧化应激是一种失衡状态自由基产量,特别是活性氧(ROS)导致进步的氧化损伤,以及机体的抵抗能力。通常,ROS能有效回收的抗氧化防御系统,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)。丙二醛(MDA)的最终产品是主要反应导致细胞重要的多不饱和脂肪酸的氧化膜,因此它是一个可靠的标志氧化应激(10]。因此,当前研究的目的是确定是否褪黑激素能调节炎性因子水平和生物标志物的基底动脉的氧化应激实验SAH后兔子。

2。材料和方法

2.1。动物

动物使用和护理协议,包括所有的操作规程,通过苏州大学动物保健和使用委员会和符合指南的护理和使用由国家卫生研究所的实验动物。48成年雄性新西兰白(NZW)兔子从2.2到2.8公斤是购自中国科学院动物中心(上海,中国)。他们能适应湿润房间和维护标准颗粒饮食东吴大学动物中心的前10天的实验。温度在饲养室和操作房间被保持在大约25°C。

2.2。Two-Hemorrhage兔模型

实验SAH是根据我们之前研究[11]。兔子被麻醉的肌内注射氯胺酮的混合物(25毫克/公斤)和氟哌利多在0天(1.0毫克/公斤)。根据自主呼吸,23-gauge蝴蝶针经皮插入小脑延髓池。1.5毫升CSF撤军后,相同数量的nonheparinized新鲜自体耳动脉血液缓慢注入无菌技术下的小脑延髓池1分钟。然后动物被保存在一个30°30分钟头位置,使血液流动的小脑延髓池更容易且快速的基部的水箱。从麻醉复苏后,他们回到了喂养的房间。48小时第一次SAH后,第二个是在相同的方式作为第一生产。控制动物,同样的技术应用与注入无菌生理盐水代替血液。

2.3。实验设计

实验小组由对照组(),SAH集团(),SAH +汽车集团(),SAH +褪黑激素()。在SAH +褪黑素组的动物,褪黑激素(5毫克/公斤)第一滴血后立即注射,每12小时持续120小时。兔子SAH +车辆组接受相同体积的车辆(1毫升乙醇1%生理盐水)在相应的时间点。褪黑激素和车辆管理的腹腔内。褪黑激素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)绝对是溶解在乙醇和进一步稀释在盐水达成最终浓度为1% (v / v)乙醇。剂量是根据艾登和同事因为他们观察到有益的影响减少SAH后底动脉的血管收缩与褪黑激素治疗后使用相同的剂量(5]。所有的兔子都在5天死亡。

每组6只兔子是牺牲fixation-perfusion方法。底动脉被苏木精和伊红染色())。每组中的其他六只兔子被抽血,杀头。动脉被除去,在0.9%生理盐水冲洗(4°C)几次,洗去血和血凝块。然后是动脉在液态氮冷冻立即生化研究。

2.4。Perfusion-Fixation

兔子定于死亡麻醉的肌内注射氯胺酮的混合物(40毫克/公斤)和氟哌利多(2.5毫克/公斤)。动物们再用3.5毫米直径的气管插管气管内管和机械通风啮齿动物呼吸机(国网公司、中国)。Perfusion-fixation执行。胸腔被打开了插管放置在左心室,胸降主动脉夹紧,右心房和开放。灌注开始了500毫升生理磷酸缓冲溶液(PBS, pH值7.4)37°C,紧随其后的是500毫升10%的缓冲甲醛灌注压力下120厘米H₂o . perfusion-fixation之后,整个大脑的基底动脉与被沉浸在同样的固定剂的解决方案。

2.5。测量血管横截面积

脑血管痉挛的程度进行了测量底动脉腔的横截面区域。formalin-fixed和石蜡包埋底动脉部分(4米厚度)deparaffinized,水分,洗净,与苏木精和伊红染色。然后底动脉的显微图放入电脑。截面法和血管壁厚度是由一名调查员不知道群设置,使用高清晰度的医学图像分析程序(hmiap - 2000,由同济医科大学,中国)。区域的周长计算通过测量实际的血管腔,然后计算一个等效圆的面积(面积=,在那里基于计算当量=半径)从周长测量值(=周长/ 2),从而纠正船舶变形和off-transverse部分。对于每一个船,三个连续的部分(近端中点,中间,和远端),测量,平均。

2.6。核内蛋白提取和电泳迁移率改变分析(EMSA)

核内蛋白提取和量化描述12]。EMSA执行使用商业套装(凝胶转变分析系统;Promega,麦迪逊,WI)的方法在我们的实验室。NF -B寡核苷酸探针(-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC -)是end-labeled与(- - - - - -³²P] ATP(免费的生物技术,北京)。EMSA执行根据我们之前的研究12]。凝胶电泳后,被调到绘画纸滤纸,真空干燥和暴露于柯达XAR-5电影一夜之间。水平的NF -B DNA结合活性被扫描量化发达柯达XAR-5电影与电脑辅助,线性扫描密度计在透明模式(Hoefer科学仪器,旧金山,CA)。数据被表示为任意微单元(adu)获得的光密度扫描。

2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)

炎症介质水平的量化使用特定ELISA试剂盒对老鼠根据制造商的指示(TNF -法国贝桑松Diaclone研究,;il - 1欧洲,il - 6 Biosource SA、显示、比利时)和我们之前的研究12]。值表示为ng / g蛋白。

2.8。MDA水平的测量

MDA含量测定的方法之前的研究(13,14]。测定的原理依赖于脂质过氧化反应形成硫代巴比土酸和产品命名为硫代巴比土酸反应物质,使最大吸收波长为532纳米。连续稀释1,1,3,3 tetraethoxypropane被用来获得一个标准的吸光度与浓度曲线,和MDA浓度曲线的组织样本测定。MDA浓度作为nmol / g湿纸巾。

2.9。测量组织SOD的活动

SOD酶活性测定与RANSOD SOD测定工具包(英国草毒死)。的方法测定采用黄嘌呤和XOD产生超氧化物自由基反应INT红甲瓒染料。然后测定SOD活性的抑制程度的反应。一个单位的草皮是导致50%的抑制率减少INT的条件下测定。SOD活动的样本作为U /毫克的蛋白质。

2.10。测量氧化酶活动的组织

氧化酶试验(美国西北生命科学专业温哥华,佤邦)工具包用于测定氧化酶活动和组织这个试验是一个适应的先前的研究方法14,15]。测定的原理如下:氧化酶催化降低H₂O₂谷胱甘肽氧化减少,GSSG形式。GSSG然后减少GR和烟酰胺德奈恩钨钢二核苷酸磷酸形成辅酶ii +(导致吸光度下降在340海里)谷胱甘肽和回收。因为氧化酶是限制,减少吸光度在340 nm氧化酶浓度成正比。氧化酶活力是报告为单位的基础上定义:1 U(氧化酶=酶催化氧化所需的数量(H₂O₂)1.0摩尔谷胱甘肽对GSSG每分钟25°C, pH值7.0。氧化酶的活动组织样本作为单位每毫克的蛋白质。

2.11。统计分析

所有数据被当作的意思SD。使用SPSS 12.0统计分析的数据。所有的数据都受到单向方差分析。实验组之间的差异决定了费舍尔的LSD期末测验。推断统计学意义。

3所示。结果

3.1。一般的观察

体重没有明显变化,平均动脉血压,温度,或者注入动脉血气数据检测的实验小组(数据未显示)。兔子所有幸存的过程实验SAH感应。

3.2。褪黑激素SAH后脑血管痉挛改善管理

如图1,有一个横截面积的显著差异底动脉在所有团体在SAH后5天()。一个长官之间发现显著差异(米²)和控制(米²)组()(图1)。也有显著区别的基底动脉横截面积之间的SAH +褪黑激素(米²)和SAH +车辆(米²)组()(图1)。之间没有显著性差异是SAH组和SAH +汽车集团()。

3.3。褪黑素对NF -B在SAH绑定活动底动脉

确定在NF -褪黑素的影响底动脉SAH后,B绑定活动EMSA进行检测的变化NF -B部分中描述2。EMSA放射自显影法的NF -B DNA结合活性在基部的动脉是如图2。低NF -B绑定活动(弱EMSA放射自显影法)被发现在对照组。与对照组相比,NF -动脉显著增加(B绑定活动)在SAH或SAH +汽车集团在SAH后5天。之间没有统计上的显著差异SAH集团和SAH +汽车集团()(图2)。在SAH +褪黑素组动脉NF -B绑定活动显著下调(褪黑激素注射后)。

3.4。褪黑激素治疗SAH后血管的促炎细胞因子水平降低

il - 1的浓度肿瘤坏死因子-和il - 6低底动脉的对照组(,,ng / g蛋白质、职责)(图3)。与对照组相比,血管的三个炎性细胞因子水平在很大程度上诱发SAH或SAH +汽车集团。如图3SAH后,褪黑激素政府可能导致明显降低il - 1肿瘤坏死因子-和il - 6的浓度。结果表明,褪黑激素政府SAH后可以表达下调的基底动脉的促炎细胞因子的表达。

3.5。褪黑素对氧化应激的影响在SAH后底动脉

组织MDA水平和组织SOD的值和氧化酶酶活性表所示1。SAH显著增加组织MDA水平(),并显著降低组织SOD和氧化酶酶活性()相比,控制。通过减少褪黑激素治疗已经显示出保护作用显著(),MDA水平升高,也大大增加了抗氧化酶活动(SOD,降低;氧化酶,)。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,(1)血管炎症介质诱导SAH后用褪黑激素治疗时可能非常压抑;(2)增加动脉组织的脂质过氧化作用可以显著下调后褪黑激素注射实验SAH后;(3)褪黑激素管理后,postSAH降低抗氧化状态改善了two-hemorrhage模型;(4)与先前的研究协议(5),褪黑激素治疗预防脑底动脉的血管痉挛的兔子。这些首次发现,褪黑激素能调节血管炎症和氧化应激反应,这可能是一个机制,褪黑激素变弱SAH后脑血管痉挛的发展。

已经有很多研究关注褪黑激素在SAH模型的神经保护作用5- - - - - -7,16]。大多数以前的研究使用了one-hemorrhage SAH模型;然而在当前的研究中,我们使用了two-hemorrhage模型更适合SAH-cerebral血管痉挛的研究比one-hemorrhage模型准确因为血管痉挛的时间进程与观察人类,SAH后5天达到高峰(17]。因此,在目前的研究中,我们选择了第五天为研究时间点。同时,我们给褪黑素后出血,这与临床相匹配。

在SAH的情况下,一系列复杂的细胞和分子事件引起的蛛网膜下腔的血凝块,并在一个健壮的炎症反应。细胞和分子事件涉及:(1)的表达粘附分子,引起白细胞粘附内皮;(2)细胞因子的生产;(3)免疫球蛋白和补体的激活。脑血管痉挛可能结果从这些事件之间的相互作用8]。脑血管痉挛的,在整个physiopathologic过程NF -B和促炎细胞因子发挥了重要的作用9]。

在研究关于褪黑激素和炎症介质,阿隆索等人研究了褪黑激素的影响诱导一氧化氮合酶的表达(间接宾语)和NF -B在大鼠骨骼肌急性运动后(18]。他们的研究结果表明,褪黑素对急性运动造成的损害有强有力的保护效应在大鼠肌肉,防止氧化应激,NF -B激活,伊诺表达。同时,结果从另一个先前的研究表明,褪黑素表现出卓越的能力减少促炎细胞因子(il - 1、il - 6和TNF -)在amyloid-beta-induced氧化应激模型19]。然而,数据仍然缺乏对褪黑素的影响在SAH模型血管炎症。在目前的研究中,我们证实了SAH可以激活炎症介质如NF -B, il - 1、il - 6和TNF -已报道,在先前的研究8,9]。此外,我们提出了褪黑激素治疗可以抑制血管炎症反应在这个兔子SAH模型。

过度生产和随后的脂质过氧化自由基的建议有因果联系SAH后脑血管痉挛(6,20.]。有几个来源的过度生成自由基SAH后,包括线粒体呼吸中断和细胞外血红蛋白但血管痉挛的主要来源被认为是自氧化的氧合血红蛋白高铁血红蛋白,从而导致生产超氧化物自由基(6]。抗氧化制剂如1日以(烟酰胺)丙烷,tirilazad,白藜芦醇,ebselen改善实验血管痉挛,降低脂质过氧化作用在不同的动物模型6]。upregulation自由基产生的酶和抑制内在SOD等抗氧化系统和氧化酶SAH后发生,导致大脑氧化损伤6]。所显示的Ersahin [7],褪黑激素治疗由于其自由基清除特性显著地抑制SAH-induced脑组织脂质过氧化和中性粒细胞浸润在SAH感应的第二天,而枯竭的抗氧化剂谷胱甘肽水平,抑制Na⁺- k⁺腺苷三磷酸酶活性恢复控制的水平。然而,对于血管组织,SAH后褪黑素对氧化应激的影响仍然未知。我们的数据表明,褪黑激素治疗诱导的抗氧化防御系统,表达下调的基底动脉的脂质过氧化作用,并导致显著增加SAH后底动脉的横截面积。因此,我们的研究结果建议的可能性血管氧化实验SAH后预防褪黑素的功能管理。

总之,我们所知,这是第一次研究证明褪黑素对炎症和氧化应激的影响SAH后大脑中动脉。我们发现SAH可能上调炎症介质,增加脂质过氧化,抑制抗氧化防御系统和兔基底动脉,褪黑激素可以显著调节的管理。褪黑激素的治疗SAH模型导致衰减SAH后脑血管痉挛的程度。这些结果表明,长官可以诱导血管的动脉壁炎症过程和氧化应激可能在脑血管痉挛的发病机理中发挥核心作用。postSAH褪黑激素治疗的好处政府可能是因为其有益的影响调节促炎介质和氧化应激生物标志物。

确认

作者感谢Bo Wu博士和Geng-bao冯博士的技术援助。第一和第二作者的贡献同样这项工作。